舒心通脈湯對(duì)病毒性心肌炎患者自噬相關(guān)通路的影響*

趙小松，呂正祥，楊德忠

1 重慶市江津區(qū)中醫(yī)院，重慶 404100； 2 陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院，重慶 400042

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）心肌病分類，病毒性心肌炎屬炎癥性疾病，其是部分年輕患者心源性猝死和擴(kuò)張性心肌病發(fā)生的重要原因［1］。研究表明，病毒如B型柯薩奇病毒或腺病毒感染機(jī)體后，可直接損傷心肌，造成病理性炎癥反應(yīng)［2］。同時(shí)病毒可利用自噬逃避降解，促進(jìn)病毒的復(fù)制及獲取代謝產(chǎn)物，同時(shí)過度激活的自噬還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［3］，因此，自噬可能是病毒性心肌炎發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵分子事件。針對(duì)病毒性心肌炎患者，如何有效地抑制機(jī)體細(xì)胞自噬，可能是臨床研究及治療的重要方向。中醫(yī)認(rèn)為，病毒性心肌炎屬“胸痹”“心悸”范疇，治療以活血化瘀、益氣通脈為主。以舒心通脈組分為代表的中藥方劑，可顯著改善心血管疾病，如慢性心衰患者的心功能［4］，但對(duì)于病毒性心肌炎自噬相關(guān)通路的影響，目前尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過探討舒心通脈湯對(duì)病毒性心肌炎患者外周血單核細(xì)胞自噬相關(guān)基因、凋亡及炎性因子的影響，為其臨床運(yùn)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018 年8 月至2020 年8 月重慶市江津區(qū)中醫(yī)院收治的126 例成年病毒性心肌炎患者為研究對(duì)象。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，每組63 例。觀察組中男33 例，女30例；平均年齡（45.6±9.3）歲；平均病程（9.8±2.8）天；心功能分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)50 例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)13 例。對(duì)照組中男35例，女28例；平均年齡（46.3±8.5）歲；平均病程（10.5±3.1）天；心功能分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)52 例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)11 例。兩組基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)納入：1）符合病毒性心肌炎診斷與治療指南［5］者；2）年齡＞18歲者；3）獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（AM180801），且簽署知情同意書者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)排除：1）合并細(xì)菌引起的感染性心內(nèi)膜炎、惡性腫瘤、嚴(yán)重器官功能不全者；2）對(duì)舒心通脈湯過敏者；3）治療依從性較差者。

1.4 治療方法1）對(duì)照組采用常規(guī)治療方案，即入院當(dāng)日給予休息、吸氧、抗病毒、營養(yǎng)心肌［維生素C（東北制藥，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H21020713，規(guī)格：0.1 g/片）、鹽酸曲美他嗪（遠(yuǎn)大醫(yī)藥，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20083806，規(guī)格：20 mg/片）及輔酶Q10 膠囊（普康藥業(yè)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H19999355，規(guī)格：10 mg/粒）］、極化液穩(wěn)定心電活動(dòng)等對(duì)癥治療。2）觀察組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上服用舒心通脈湯治療，藥物組成：黃芪20 g，西洋參15 g，丹參15 g，當(dāng)歸、川芎、麥冬、金銀花、連翹各10 g。水煎早晚分服。兩組連續(xù)治療2個(gè)療程（1 個(gè)療程為14 天），治療期間禁煙禁酒，禁食辛辣、油膩食物。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 自噬及凋亡相關(guān)基因mRNA 水平 收集患者治療后外周血單核細(xì)胞，提取總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄方法按試劑盒說明（Takara 公司），qPCR引物由上海生工公司合成。引物序列見表1。建立20 μL反應(yīng)體系，包括1 μL cDNA，2 μL 10X Taq 緩沖液，1.2 μL 25 mM MgCl2、0.4 μL 10 mM dNTP，0.8μL 1U/μLTaq 聚合酶，每個(gè)引物1 μL和剩余的加入DEPC水使反應(yīng)總量達(dá)到20 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：95 ℃ 3min，在95 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s 和72 ℃ 40 s，共計(jì)30 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCq方法計(jì)算相對(duì)mRNA水平。

表1 引物序列表

1.5.2 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 提取患者治療前后單核細(xì)胞，經(jīng)裂解液裂解后，測定蛋白濃度。然后進(jìn)行電泳分離，電泳完成后轉(zhuǎn)移置硝基纖維素膜。采用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，然后與稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，抗Beclin-1 抗體（1∶400）、抗LC3 抗體（1∶300）及抗GAPDH 抗體（1∶500）。次日經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后，將膜與孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的條帶與GAPDH 灰度比值。

1.5.3 外周血炎性指標(biāo) 采用ELISA 法測定不同組間外周血白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素22（interleukin-22，IL-22）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行（南京建成生物公司）。

1.5.4 臨床療效 臨床痊愈：患者臨床癥狀、體征均消失，心肌損傷標(biāo)志物和心電圖等檢查指標(biāo)均恢復(fù)正常；顯效：患者臨床癥狀和體征完全消失或基本消失，心肌損傷標(biāo)志物指標(biāo)好轉(zhuǎn)，肌鈣蛋白為陰性；有效：患者臨床癥狀和體征有所好轉(zhuǎn)，同時(shí)心電圖、心肌損傷標(biāo)志物有改善，但未恢復(fù)正常；無效：患者臨床癥狀和體征、心肌損傷標(biāo)志物和心電圖等檢查指標(biāo)未見明顯好轉(zhuǎn)甚至出現(xiàn)加重。

總有效率（%）=（痊愈+顯效+有效）例數(shù)/總例數(shù)

1.5.5 不良反應(yīng) 觀察兩組患者治療過程中惡心、嘔吐、頭暈、乏力、腹瀉等不良反應(yīng)的發(fā)生情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n，%表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血自噬相關(guān)基因mRNA 和蛋白表達(dá)水平與治療前比較，兩組治療后外周血單核細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-II mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），其中觀察組上述指標(biāo)較對(duì)照組治療后降低更明顯（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組治療前后自噬相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 兩組治療前后自噬相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組LC3-Ⅱ1.02±0.05 0.66±0.12*#0.98±0.04 0.77±0.10*例數(shù)63對(duì)照組63時(shí)間治療前治療后治療前治療后Beclin-1 mRNA 0.98±0.05 0.60±0.16*#0.99±0.06 0.78±0.10*Beclin-1 1.03±0.04 0.70±0.08*#1.01±0.02 0.80±0.09*LC3-Ⅱ mRNA 1.00±0.03 0.69±0.15*#1.02±0.04 0.82±0.11*

2.2 外周血炎性指標(biāo)水平與治療前比較，兩組治療后外周血炎性指標(biāo)IL-1β、IL-22 及TNF-α 水平均明顯降低（P＜0.05），其中觀察組上述指標(biāo)較對(duì)照組治療后降低更明顯（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后外周血炎性指標(biāo)水平比較（±s） pg/mL

表3 兩組治療前后外周血炎性指標(biāo)水平比較（±s） pg/mL

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組例數(shù)63對(duì)照組63時(shí)間治療前治療后治療前治療后IL-1β 26.28±6.15 12.65±3.87*#25.57±5.43 IL-22 33.98±4.97 14.72±4.02*#34.21±5.86 17.74±4.16*20.84±5.04*TNF-α 38.50±5.53 19.30±4.14*#39.01±6.02 24.22±4.95*

2.3 外周血單核細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平與治療前比較，兩組治療后外周血Caspase-3 mRNA水平明顯降低，Bcl-2 mRNA水平明顯升高（P＜0.05），其中觀察組Caspase-3 mRNA 及Bcl-2 mRNA 水平較對(duì)照組改善更明顯（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組外周血單核細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

Bcl-2 mRNA 1.00±0.03 1.35±0.11*#1.01±0.04 1.20±0.07*組別觀察組例數(shù)63 Caspase-3 mRNA 0.99±0.06對(duì)照組63時(shí)間治療前治療后治療前治療后0.75±0.10*#1.01±0.05 0.83±0.09*

2.4 臨床療效觀察組痊愈32例，顯效16例，有效11 例，無效4 例，總有效率93.7%（59/63）；對(duì)照組痊愈25例，顯效16例，有效10例，無效12例，總有效率81.0%（51/63）。觀察組總有效率高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.5 不良反應(yīng)發(fā)生率治療期間觀察組發(fā)生不良反應(yīng)發(fā)4 例（6.35%），其中頭暈1 例、惡心2 例、嘔吐1例，對(duì)照組發(fā)生不良反應(yīng)發(fā)2例（3.17%），其中頭暈1例、乏力1例。觀察組不良反應(yīng)發(fā)生率稍高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者不良反應(yīng)均較輕微，未經(jīng)特殊處理癥狀均自行消失。

3 討論

病毒性心肌炎是臨床常見和多發(fā)的心血管疾病之一，臨床表現(xiàn)及病情呈現(xiàn)多樣化，大部分患者臨床癥狀不明顯，預(yù)后較好，但少部分患者可出現(xiàn)多種心律失常甚至心源性猝死等。隨著相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究的深入，臨床上對(duì)于病毒性心肌炎的防治均取得了顯著進(jìn)展，若出現(xiàn)機(jī)體炎癥，給予大劑量激素沖擊療法；若患者免疫力低下，給予輸注免疫球蛋白；部分重癥患者甚至可給予體外肺氧合來維持患者呼吸與循環(huán)穩(wěn)定。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為病毒性心肌炎屬“胸痹”“怔忡”范疇，發(fā)病源于氣陰兩虛、熱毒傷心，治療時(shí)以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主［6］。相關(guān)研究顯示，舒心通脈方可改善心功能，提高心血管疾病患者臨床療效［7］，已運(yùn)用于臨床，但具體機(jī)制還有待闡明。

近年來，對(duì)自噬在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，醫(yī)學(xué)界已進(jìn)行了廣泛而深入的研究。自噬通過吞噬并降解細(xì)胞質(zhì)蛋白或受損的細(xì)胞器，對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞代謝，維持細(xì)胞器更新及機(jī)體穩(wěn)態(tài)，起著重要的作用［8］。但自噬在不同疾病中扮演的作用有所不同，如在慢性阻塞性肺疾?。?］、動(dòng)脈粥樣硬化［10］中，機(jī)體細(xì)胞自噬往往降低，而惡性腫瘤［11］患者，機(jī)體細(xì)胞自噬水平顯著增加，有助于腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。對(duì)于病毒性心肌炎患者，目前自噬相關(guān)研究較少，但動(dòng)物模型結(jié)果顯示，在病毒感染過程中，病毒可利用自噬逃避降解，促進(jìn)病毒復(fù)制和釋放［12］。同時(shí)自噬還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致重要臟器功能不全［13］。如何有效抑制病毒性心肌炎患者過度的細(xì)胞自噬反應(yīng)，有可能成為該病有效治療的靶點(diǎn)。

舒心通絡(luò)湯由黃芪、西洋參、麥冬等組成，可針對(duì)患者正氣虛弱、血瘀氣滯，進(jìn)行辨證施治。有研究顯示，黃芪除了具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力作用外，還發(fā)揮抗氧化，保護(hù)器官缺血再灌注損傷的作用［14］。西洋參具有降低心肌耗氧量，提高缺氧耐受力，穩(wěn)定心電活動(dòng)的作用［15］。因此，舒心通脈湯諸多成分通過益氣養(yǎng)陰、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，提高機(jī)體抵抗不良因素刺激造成損傷的能力。

本研究觀察舒心通脈湯對(duì)病毒性心肌炎患者自噬、凋亡相關(guān)基因及外周血炎性指標(biāo)的影響，其結(jié)果顯示，舒心通脈湯可顯著降低病毒性心肌炎細(xì)胞自噬及凋亡水平。有研究證實(shí)，過度的自噬可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，線粒體依賴性途徑是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，自噬通過對(duì)線粒體的大量降解，抑制了機(jī)體能量代謝，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡及相關(guān)促炎細(xì)胞因子的合成與分泌［16］。舒心通脈湯通過抑制病毒性心肌炎患者機(jī)體自噬和凋亡水平，有助于降低炎癥反應(yīng)，提高臨床療效。同時(shí)作為純中藥方劑，舒心通脈湯對(duì)病毒性心肌炎患者尚未產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，安全性較好。

綜上所述，舒心通脈湯對(duì)病毒性心肌炎患者具有顯著的臨床療效，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞自噬及凋亡，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。但舒心通脈湯對(duì)自噬的具體調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。