理沖湯對性激素誘導的子宮肌瘤大鼠Wnt/β-catenin 信號通路的調(diào)節(jié)作用研究*

陳瑩瑩，劉超萍△，陳 楊

1 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2 湖南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，湖南 長沙 410208

子宮肌瘤是常見的婦科疾病之一，主要由增生的子宮平滑肌組織和少量的纖維結(jié)締組織形成，又稱為纖維肌瘤、子宮纖維瘤［1］。Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)異常與多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。近年來研究表明，Wnt/β-catenin信號通路及相關蛋白的異常表達在子宮肌瘤的發(fā)病機制中起著重要作用［2］。理沖湯由黃芪、黨參等多種中藥組成，是治療婦科疾病的常用中藥湯劑之一。有文獻報道，理沖湯用于子宮肌瘤患者的臨床治療療效顯著［3-4］，但其藥理作用機制尚不明確。筆者通過研究理沖湯對性激素誘導的子宮肌瘤大鼠的藥理作用及對Wnt/β-catenin 信號通路的調(diào)節(jié)作用，為理沖湯的藥理作用研究及臨床應用提供新的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雌性SD 大鼠60 只，SPF 級，2～3 月齡，體質(zhì)量（220±20）g，購自湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物合格證號：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)條件：自由進食、飲水飼養(yǎng)于實驗動物房。動物實驗遵守實驗動物福利倫理審查指南。

1.2 藥物與試劑理沖湯（生黃芪9 g，黨參6 g，白術(shù)6 g，生山藥15 g，天花粉12 g，知母12 g，三棱9 g，莪術(shù)9 g，生雞內(nèi)金9 g 組成）由藥材飲片制成每毫升含1.7 g生藥的制劑，購自于北京同仁堂股份有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：20190816）；孕酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：20191011）；米非司酮膠囊wnt7a（批號：AF8361）、β-Catenin（批號：AF1189）、兔單克隆抗體、山羊抗兔二抗（批號：A0208）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒（Promega 公司，批號：Z3351）；ECL顯色液（Thermo公司，批號：32132X3）。

1.3 實驗儀器MB-530 型酶標儀（濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司）；DYCZ-25D 型雙垂直電泳儀（北京六一儀器有限公司）；DYCZ-40G 型轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器有限公司）；Gel Doc XR型凝膠成像儀（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）；FC5718 230V型離心機［奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司］。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立 除15 只大鼠作為對照組外，其余45 只大鼠參照文獻［5-6］方法建立子宮肌瘤大鼠模型，具體方法為：按照0.5 mg/kg 的劑量給予大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，每日1 次，連續(xù)30 天，期間每周腹腔注射1 次孕酮注射液（4 mg/kg），最后5 天同時給予大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇及孕酮注射液，以大鼠血清雌二醇及孕酮水平顯著升高及大鼠子宮發(fā)生明顯病理學變化視為造模成功。

1.4.2 分組及給藥 將造模完成后的45 只大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為3 組，分別為模型組、理沖湯組及陽性對照組，每組15 只。理沖湯組大鼠按照4.5 mL/kg的劑量灌胃給予理沖湯［7］，陽性對照組大鼠按照2.25 mg/kg 的劑量灌胃給予大鼠米非司酮［7］，對照組及模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥28天［7］。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠血清雌二醇及孕酮水平的測定 每組取6 只大鼠，通過眼眶后靜脈叢取血至干凈離心管中，于4 ℃靜置4 h后置于離心機中，離心半徑：13 cm，3500 r/mim，離心10 min，取上清液，用全自動生化分析儀測定大鼠血清雌二醇及孕酮水平。

1.5.2 大鼠子宮系數(shù)的測定 頸椎脫臼法處死大鼠后，稱定大鼠質(zhì)量，記為W1，分離大鼠子宮稱定質(zhì)量，記為W2，計算大鼠子宮系數(shù)。大鼠子宮系數(shù)（%）=W2/W1×100%。

1.5.3 大鼠子宮組織病理學檢查 處死大鼠后分離子宮組織，在10%中性甲醛中固定24 h 后轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，經(jīng)自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行5 μm 切片，水浴展開，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中烤2 h，常規(guī)蘇木精-伊紅染色（Hematoxylineosin staining，HE），在顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.5.4 大鼠子宮病理學評分及子宮平滑肌厚度的測定 每張標本隨機選取3 個視野，測量大鼠子宮平滑肌厚度并參照文獻方法［8-9］進行組織病理分級，計算平均病理學評分。0 級：子宮平滑肌細胞排列均勻規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，呈流水樣排列，細胞大小適中，未見子宮肌纖維增生肥大、肌纖維排列紊亂和肌纖維穿插現(xiàn)象，內(nèi)膜腺體形態(tài)規(guī)則，圓形或橢圓形，腺體上皮細胞均為單層立方或柱狀，記0 分。Ⅰ級：平滑肌層少許增厚或不增厚，內(nèi)環(huán)肌和外縱肌排列規(guī)則，細胞有增生肥大、變短的現(xiàn)象，部分肌細胞縱橫交錯，肌纖維排列紊亂，呈輕微編織狀，出現(xiàn)穿插現(xiàn)象。腺體上皮細胞呈單層，記1 分。Ⅱ級：平滑肌層明顯增厚，大面積平滑肌出現(xiàn)穿插現(xiàn)象，細胞進一步增生肥大，腺體上皮細胞呈現(xiàn)單層或復層立方狀或柱狀，記2 分。Ⅲ級：平滑肌層明顯增厚，平滑肌細胞排列紊亂，穿插現(xiàn)象明顯，肌層成漩渦狀，記3分。

1.5.5 大鼠子宮wnt7a及β-catenin mRNA水平的測定 取大鼠部分子宮組織，采用RNA提取試劑盒分別提取各組大鼠子宮組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，熒光實時定量PCR檢測各組大鼠子宮組織中GAPDH、wnt7a、β-catenin mRNA的表達。各檢測基因的實時定量PCR引物見表1，實時定量PCR 結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 引物序列表

1.5.6 大鼠子宮wnt7a及β-catenin蛋白水平的測定 取大鼠子宮組織，放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，4 ℃離心留取上清液，向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取蛋白50 μg進行SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)wnt7a、β-catenin 及GAPDH 抗體（1∶1000）孵育后，4 ℃過夜。PBST 充分洗膜后，加入二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，PBST 清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，應用Image J 軟件進行免疫印跡灰度值定量分析。

1.6 統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及Graphpad prism 8 進行作圖，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清雌二醇及孕酮水平與對照組比較，模型組大鼠血清雌二醇及孕酮水平顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，理沖湯組及陽性對照組大鼠血清雌二醇及孕酮水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清雌二醇、孕酮水平、wnt7a及β-catenin mRNA水平（±s）

表2 各組大鼠血清雌二醇、孕酮水平、wnt7a及β-catenin mRNA水平（±s）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組理沖湯組陽性對照組β-catenin mRNA 0.97±0.27 3.71±0.75*1.01±0.39#1.14±0.61*#鼠數(shù)15 15 15 15雌二醇（ng/L）25.47±1.37 51.63±1.43*28.18±2.31#26.84±1.01#孕酮/（pmol/L）119.37±3.06 233.67±3.78*147.41±2.73*#128.29±3.66*#wnt7a mRNA 3.35±0.62 1.44±0.55*3.13±0.75*#2.81±0.49*#

2.2 大鼠子宮wnt7a及β-catenin mRNA水平與對照組比較，模型組大鼠子宮wnt7a mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），β-catenin mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，理沖湯組及陽性對照組大鼠子宮wnt7a mRNA水平顯著升高（P＜0.05），β-catenin mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 大鼠子宮wnt7a及β-catenin蛋白水平與對照組比較，模型組大鼠子宮wnt7a 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），β-catenin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，理沖湯組及陽性對照組大鼠子宮wnt7a 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），β-catenin蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮wnt7a及β-catenin蛋白水平

2.4 大鼠子宮濕重及子宮系數(shù)與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、子宮濕重及子宮系數(shù)均顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，理沖湯組及陽性對照組大鼠體質(zhì)量、子宮濕重及子宮系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠體質(zhì)量、子宮濕重、子宮系數(shù)、子宮平滑肌厚度及子宮組織病理學評分比較（±s）

表3 各組大鼠體質(zhì)量、子宮濕重、子宮系數(shù)、子宮平滑肌厚度及子宮組織病理學評分比較（±s）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組理沖湯組陽性對照組子宮組織病理學評分（分）0.41±0.03 2.79±0.19*1.03±0.23 0.97±0.17*#鼠數(shù)15 15 15 15體質(zhì)量（g）287.94±2.64 331.19±3.63*297.81±2.43*291.76±3.64#子宮濕重（mg）0.61±0.09 1.51±0.14*0.84±0.12#0.71±0.07#子宮系數(shù)（%）0.21±0.08 0.46±0.04*0.28±0.06#0.24±0.03#子宮平滑肌厚度（μm）113.67±6.71 138.21±8.34*120.48±5.38#117.28±4.68#

2.5 大鼠子宮平滑肌厚度及組織病理學評分與對照組比較，模型組大鼠子宮平滑肌厚度及子宮組織病理學評分均顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，理沖湯組及陽性對照組大鼠子宮平滑肌厚度及子宮組織病理學評分均顯著降低（P＜0.05）。見表3。

2.6 大鼠子宮組織病理學觀察對照組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，未見明顯組織病理學變化，與對照組比較，模型組大鼠子宮組織子宮內(nèi)膜上皮細胞呈空泡狀變性，平滑肌細胞局灶性增生，肌肉內(nèi)可見明顯炎癥細胞浸潤及細胞壞死、脫落，提示造模成功；與模型組比較，理沖湯組及陽性對照組大鼠組織病理學明顯改善，子宮子宮內(nèi)膜上皮細胞變性減輕，平滑肌細胞排列較整齊，炎性細胞脫落及壞死細胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織病理學檢查結(jié)果（HE，×200）

3 討論

子宮肌瘤又稱為子宮平滑肌瘤，是臨床常見的女性生殖器良性腫瘤疾病之一，主要表現(xiàn)為子宮出血、白帶增多、不孕或流產(chǎn)、腹部包塊隆起及壓迫等臨床癥狀［10］。研究表明，子宮肌瘤的發(fā)病機制與子宮正常肌層的細胞突變、性激素水平異常及局部生長因子水平紊亂等因素有關［11-13］。子宮肌瘤中雌二醇的雌酮轉(zhuǎn)化明顯低于正常肌組織，雌激素受體濃度明顯高于周邊肌組織，肌瘤組織局部對雌激素敏感性高，同時孕激素能夠促進肌瘤細胞增殖，加速子宮肌瘤的生長［14-15］，所以目前大多數(shù)學者認為性激素水平異常是子宮肌瘤的主要發(fā)病誘因。米非司酮是一種孕激素受體拮抗劑，近年來在臨床上被用于子宮肌瘤的治療，并起到一定的療效，故本實驗選用米非司酮作為陽性對照藥。

Wnt/β-catenin 信號通路是傳遞生長刺激信號的通路，是細胞增殖、分化所必須的重要信號通路之一，Wnt/β-catenin 信號通路與胃癌、肺癌、腎細胞癌等多種腫瘤疾病及糖尿病腎病、骨關節(jié)炎、哮喘等疾病的發(fā)生密切相關［16-18］。Wnt信號通路轉(zhuǎn)導異常則會影響β-catenin 的磷酸化和降解過程，導致β-catenin 在細胞核內(nèi)聚集，并與淋巴細胞增強結(jié)合因子/T 細胞因子結(jié)合，使得細胞質(zhì)中的β-catenin 移位到細胞核中與TCF 家族形成絡合物，促進TCF 和LEF 的轉(zhuǎn)導，進而促使癌基因的高表達。近年來研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路及其相關蛋白的異常表達與子宮肌瘤的發(fā)生相關［19-20］。有研究報道，子宮肌瘤組織中Wnt7a的低表達，能夠?qū)е伦訉m平滑肌細胞模式發(fā)育的失控，進而導致子宮肌瘤的發(fā)生，同時β-catenin的異常激活能夠誘導子宮平滑肌的異常增生，引發(fā)并加速子宮肌瘤的進展［21］。

理沖湯是由生黃芪、黨參、白術(shù)、生山藥、天花粉、知母、三棱、莪術(shù)、生雞內(nèi)金組成的中藥成方制劑，記載于中國傳統(tǒng)醫(yī)學著作《醫(yī)學衷中參西錄》中，有益氣行血，調(diào)經(jīng)祛瘀之功效，用于治療婦人經(jīng)閉不行，或產(chǎn)后惡露不盡，結(jié)為癥瘕，以致陰虛作熱，陽虛作冷，食少勞嗽，虛證沓來，室女月閉血枯等多種婦科疾病。近年來王亞松［7］、鄒小麗［22］等研究發(fā)現(xiàn)，理沖湯對子宮肌瘤大鼠具有顯著療效，同時曹文等［4］報道理沖湯用于子宮肌瘤的治療在臨床中已表現(xiàn)出顯著療效。

雌二醇及孕酮是反映女性體內(nèi)性激素水平的常用指標，子宮系數(shù)能夠反映子宮的質(zhì)量占比，可以間接反映子宮肌瘤的病理進展狀態(tài)。本研究通過采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合孕酮建立子宮肌瘤大鼠模型，研究理沖湯對子宮肌瘤大鼠的作用及機制，結(jié)果表明，與模型組比較，理沖湯組大鼠血清雌二醇及孕酮水平、子宮系數(shù)、子宮平滑肌厚度、子宮β-catenin mRNA 水平及β-catenin 蛋白水平均顯著降低，子宮wnt7a mRNA 及蛋白水平顯著升高，大鼠子宮組織病理學明顯改善，提示理沖湯能夠通過調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)雌二醇及孕酮水平，顯著改善大鼠子宮組織病理學進展，并能夠調(diào)節(jié)子宮組織細胞Wnt/β-catenin 信號通路及相關蛋白的表達。由于時間及資金有限，本研究未能對理沖湯對子宮肌瘤大鼠體內(nèi)與Wnt/β-catenin 信號通路相關的其他信號轉(zhuǎn)導因子做進一步研究，擬在今后研究中對理沖湯的靶向調(diào)節(jié)作用機制做進一步研究，并對其體內(nèi)藥物代謝動力學特點進行探索。

綜上所述，理沖湯能夠顯著降低大鼠性激素水平及子宮系數(shù)，改善大鼠組織病理學變化，其機制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路有關。