補骨脂-淫羊藿藥對抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析*

楊巖冰，郭云鵬，柴 爽

河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院），河南 鄭州 450016

中醫(yī)古籍中無絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）之名的記載，但“骨痿”“骨枯”等的描述與之十分相似［1-2］。最新的專家共識根據(jù)PMOP 的臨床癥狀、體征及定性、定位，認為其當屬“骨痿”，辨證分型為脾腎陽虛證、肝腎陰虛證和腎虛血瘀證，其中，推薦腎虛血瘀證患者使用成藥壯骨止痛膠囊［3］。壯骨止痛膠囊的藥物組成包括補骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補、狗脊和川牛膝等7 味藥物，前期已開展了全方（壯骨止痛方）的作用機制研究［4-6］，組方合理性的分析［7-8］及拆方分析［9-12］，發(fā)現(xiàn)補骨脂-淫羊藿藥對可提高去卵巢大鼠腰椎骨密度，改善骨生物力學(xué)特性，提高血清雌二醇水平。由于補骨脂-淫羊藿是PMOP 治療中常用的藥對，研究其作用機制具有重要意義，故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討補骨脂-淫羊藿藥對抗PMOP的機制。

1 資料與方法

1.1 補骨脂、淫羊藿有效成分篩選及靶蛋白預(yù)測利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/）［11］，TCM Database@Taiwan 數(shù)據(jù)庫（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）［13］和BATAMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）［14］檢索補骨脂和淫羊藿的成分，本次主要研究口服給藥后補骨脂-淫羊藿藥對的作用機制，故通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL）兩個指標篩選有效成分，設(shè)置OB＞30%，DL＞0.18 為有效成分篩選標準，在BATAMANTCM 數(shù)據(jù)庫中設(shè)置評分＞80 為篩選標準［15］，綜合獲取補骨脂-淫羊藿藥對的有效成分。利用以上各個數(shù)據(jù)庫的相關(guān)預(yù)測模塊，預(yù)測有效成分的靶蛋白。

1.2 PMOP 相關(guān)蛋白的檢索利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/），GKB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/），TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），以“Postmenopausal Osteoporosis”“Osteoporosis，Postmenopausal”為檢索詞，檢索各數(shù)據(jù)庫中PMOP的相關(guān)蛋白和基因。

1.3 補骨脂、淫羊藿有效成分靶蛋白和PMOP 相關(guān)蛋白的標準化處理利用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），將物種限定為“Human”，檢索補骨脂-淫羊藿藥對有效成分靶蛋白和PMOP相關(guān)蛋白對應(yīng)的官方名稱，并記錄ID編碼。檢索PMOP 相關(guān)蛋白的ID 編碼并記錄。這樣統(tǒng)一采用UniProt 數(shù)據(jù)庫的官方名稱和ID 編碼，便于后續(xù)進行分析。

1.4 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標篩選利用在線繪圖軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP的共同靶標，并繪制韋恩圖。

1.5 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建通過使用Cytoscape 插件Network Analyzer 進行拓撲分析，讀取各個節(jié)點的中介中心度（betweenness centrality，BC）和節(jié)點度（degree）；使用Cytoscape插件Bisogenet進行可視化分析。

1.6 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標的富集分析Metascape（http：//metascape.org/）是一個在線基因功能注釋分析在線工具，可以同時執(zhí)行功能注釋和富集分析。將“1.4”項篩選出的補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP共同靶標輸入Meascape平臺，輸入物種和分析物種均選擇“H.sapiens（132）”，然后進行基因本體論（gene ontology，GO），京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，設(shè)定P＜0.05的條目被顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 補骨脂、淫羊藿有效成分-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)利用3 個數(shù)據(jù)庫共檢索出補骨脂-淫羊藿藥對已知的化學(xué)成分166 種，其中補骨脂36 種，淫羊藿130種。經(jīng)過篩選共獲得有效成分51 種，其中補骨脂28種，淫羊藿23種。中藥的配伍使用依賴于多成分、多靶標和多途徑之間的協(xié)同作用［16］，因此我們收集了各數(shù)據(jù)庫中靶蛋白共611種，刪除UniProt數(shù)據(jù)庫中無法查詢到對應(yīng)基因的和重復(fù)數(shù)據(jù)后，共獲得292種靶蛋白。見圖1。

圖1 中藥-有效成分-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

為了從系統(tǒng)和整體的角度進一步理解有效成分-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)，我們首先使用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)共包含365個節(jié)點和638個邊，然后進行拓撲分析獲取各個節(jié)點的Degree，Degree 表示與此節(jié)點相互作用的節(jié)點數(shù)，其大小與BC 成正比，及依賴此節(jié)點的連接越多，此節(jié)點的核心性越強，因此我們選擇Degree＞5的節(jié)點構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示，補骨脂-淫羊藿藥對共有21個有效成分與26 個靶蛋白相連，其中槲皮素（quercetin）與149 個靶蛋白相連，山柰酚（kaempferol）與61 個靶蛋白相連，木犀草素（luteolin）作用于56 個靶蛋白，異補骨脂甲素（isobavachin）和脫水淫羊藿素（anhydroicaritin）作用于36 個靶蛋白，處于核心位置。

2.2 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標的富集分析利用GeneCards數(shù)據(jù)庫收集PMOP相關(guān)蛋白963 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫36 個，GKB 數(shù)據(jù)庫3 個，TTD數(shù)據(jù)庫3 個，共1005 個。刪除重復(fù)數(shù)據(jù)后共獲得964個PMOP相關(guān)蛋白。

利用UniProt 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一基因名稱后，篩選補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP 共同靶標并繪制韋恩圖，共有132 個共同靶標，見圖2。將這些共同靶標輸入Metascape 平臺進行GO，KEGG 富集分析。GO 分為細胞組分（cellular component，CC），分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過程（biological process，BP）3 個方面對基因的本質(zhì)進行描述，進行基因GO 富集分析可以了解其在Gene Ontology 中的分布和在基因功能上的體現(xiàn)。如圖3A-C 所示，顯著富集到CC 的GO 條目有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體；顯著富集到MF的GO條目有核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合；顯著富集到BP 的GO 條目有對有毒物質(zhì)、有機環(huán)狀化合物、無機物、細胞外刺激和營養(yǎng)水平的反應(yīng)。KEGG 富集分析如圖3D 所示，顯著富集的信號通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、癌癥的途徑、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、內(nèi)分泌耐藥、PI3K-Akt信號通路。

圖2 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP共同靶標

圖3 補骨脂-淫羊藿藥對和PMOP共同靶標的富集分析

3 討論

PMOP 的特征是骨骼強度降低和骨骼脆性增加，這是由絕經(jīng)后婦女的雌激素缺乏引起的。其主要并發(fā)癥是脆性骨折，導(dǎo)致疼痛，功能障礙，甚至死亡。這種疾病發(fā)病隱匿，只有在發(fā)生疼痛性骨折（例如股骨頸、脊柱、尺骨、橈骨、肱骨、肋骨和骨盆）后才被發(fā)現(xiàn)。骨折常常給人們帶來巨大的痛苦，嚴重限制了患者的生活質(zhì)量［17］。因此，預(yù)防和治療PMOP 引起了廣泛的關(guān)注。目前標準的治療方法是改變生活方式，結(jié)合雙膦酸鹽藥物及補充鈣和維生素D，以減少破骨細胞驅(qū)動的骨吸收［18］。盡管這些藥物有效，但大多數(shù)藥物都有一些局限性和副作用，影響長期給藥和依從性［19］。中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松由來已久，多從“肝脾腎”三臟論治，用藥配伍多選補腎、健脾、活血中藥，尤以補腎多見，補骨脂、淫羊藿是常用的補腎壯骨藥物，藥理研究表明它們在治療生殖系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松、心血管系統(tǒng)等疾病中具有重要作用［20-23］，但其藥理學(xué)機制尚未得到系統(tǒng)和全面的發(fā)現(xiàn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種包括化學(xué)信息學(xué)，生物信息學(xué)，網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和傳統(tǒng)藥理學(xué)的綜合方法，提供了一種從系統(tǒng)和整體的角度揭示中藥配方的生物活性成分和潛在機制的新策略［24］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，進一步探討補骨脂、淫羊藿藥對抗骨質(zhì)疏松的作用機制。

首先，我們獲取補骨脂-淫羊藿藥對有效成分51種，靶蛋白292 個，經(jīng)過拓撲分析篩選Degree＞5的有效成分21 種，與26 個靶蛋白相連，其中槲皮素（quercetin），山柰酚（kaempferol），木犀草素（luteolin），異補骨脂甲素（Isobavachin）和脫水淫羊藿素（anhydroicaritin）處于核心位置。研究表明槲皮素可以通過調(diào)節(jié)成骨細胞代謝、抑制細胞衰老抵抗骨質(zhì)疏松的發(fā)生［25-27］，木犀草素可以促進成骨細胞的增殖、分化與礦化［28］，關(guān)于異補骨脂甲素的研究多集中在神經(jīng)元細胞的分化［29］，脫水淫羊藿素是新鑒定的轉(zhuǎn)錄因子SREBP2 的抑制劑，可抑制破骨細胞生成并改善糖尿病引起的骨丟失［30］。這些可以解釋中草藥的多效性。

此外，篩選出補骨脂-淫羊藿藥對與PMOP 共有132 個共同靶標，分析發(fā)現(xiàn)這些共同靶標在轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結(jié)合和營養(yǎng)水平等GO 條目顯著富集，同時，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、癌癥相關(guān)途徑、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、內(nèi)分泌耐藥、PI3KAkt 信號通路可能是補骨脂-淫羊藿藥對治療PMOP的關(guān)鍵。研究表明，絕經(jīng)后雌激素水平降低與骨質(zhì)疏松癥、動脈粥樣硬化及糖尿病相關(guān)［31］，這也符合中醫(yī)學(xué)對人體生理和病理狀態(tài)的整體理解。在人口老齡化進程中，骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的發(fā)病率不斷增長，常合并出現(xiàn)［32］。研究表明，AGE-RAGE信號通路在包括糖尿病性骨病在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥中具有重要作用，通過抑制Wnt，PI3K 和ERK 信號傳導(dǎo)抑制成骨細胞增殖［33］。此外，淫羊藿可通過多種方式影響內(nèi)分泌系統(tǒng)及下丘腦-垂體-性腺/腎上腺軸［34］。體外研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞加載適宜的流體剪切應(yīng)力可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和其特異性抑制因子的動態(tài)平衡，維持機體正常的骨形成和吸收［35］。

骨質(zhì)疏松癥是一種多基因遺傳易感疾病。人類遺傳基因的多態(tài)性決定了人體對疾病和藥物的敏感性和反應(yīng)，以及臨床表現(xiàn)的多樣性。這類似于中醫(yī)中“證”的概念，即疾病發(fā)展的某個階段的病理特征的總結(jié)，這是身體對致病因素起反應(yīng)的功能狀態(tài)。因此，我們推測中醫(yī)理論基礎(chǔ)之一就是多基因性。在這項研究中，我們分析了補骨脂-淫羊藿藥對通過多靶點、多途徑治療PMOP 的作用機制，但是，本研究仍然存在一些局限性。首先，我們的有效成分和靶蛋白的收集并不全面。這些可以通過使用液相色譜法、質(zhì)譜法、二維液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法等方法來改進。其次，我們的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究缺乏動物實驗和臨床試驗來驗證這一假設(shè)。在以后的研究中，我們將努力進行體內(nèi)、體外實驗來驗證補骨脂-淫羊藿藥對的作用機制和配伍應(yīng)用。