針刀聯(lián)合葛根素膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究*

趙 耀，王立恒△，李鳳巖，董 嵩，苗蘭英，林大勇，張麗萍

1 大連市第二人民醫(yī)院，遼寧 大連 116011； 2 朝陽(yáng)市第二醫(yī)院，遼寧 朝陽(yáng) 122000；3 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是骨科常見(jiàn)病，其臨床表現(xiàn)主要以手、足、膝、肘和肩等遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)疼痛為主，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，關(guān)節(jié)發(fā)出捻發(fā)音并有滲液［1］。其病理改變?yōu)檐浌顷P(guān)節(jié)的退行性變?yōu)橹?，并可伴有繼發(fā)性骨質(zhì)增生。OA 的主要特點(diǎn)為病程持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在治療過(guò)程中容易出現(xiàn)反復(fù)。目前治療OA 主要以類(lèi)固醇激素或透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射緩解癥狀為主，但該方法并不能從根本上治療關(guān)節(jié)的退行性改變，不能有效解除關(guān)節(jié)的粘連，且遠(yuǎn)期治療效果不佳［2］。研究顯示，OA 的病因與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，同時(shí)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的多種炎性因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白 細(xì) 胞 介 素6（interleukin-1，IL-6）也參與到骨關(guān)節(jié)炎的病程中［3］。在OA 的形成過(guò)程中，關(guān)節(jié)的滑膜和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞受到損傷后可以產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α，而這些炎性因子可促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解，產(chǎn)生基質(zhì)金屬酶蛋白1（matrix metalloproteinases-1，MMP-1）和基質(zhì)金屬酶蛋白13（matrix metalloproteinases-1，MMP-13），加重關(guān)節(jié)軟骨的損傷。

針刀松解術(shù)用針刀游離、切割粘連的組織，這樣可以直接在患處解除粘連，疏通經(jīng)絡(luò)，松解肌肉、韌帶、腱鞘和關(guān)節(jié)囊，恢復(fù)關(guān)節(jié)的力學(xué)功能，減輕患者痛苦。因此，針刀松解術(shù)具有創(chuàng)傷小、適用范圍廣、療效顯著、性?xún)r(jià)比高、無(wú)毒副作用的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)應(yīng)用于OA的臨床治療中。

葛根素是中藥葛根的有效成分之一，是從干燥的葛根中分離出來(lái)的一種異黃酮類(lèi)化合物。葛根素具有毒副作用小，來(lái)源廣泛的特點(diǎn)，其藥理學(xué)活性包括調(diào)節(jié)免疫功能、改善循環(huán)、保護(hù)心肌、抗衰老、抗腫瘤等多種功效［4］。研究表明，葛根素可以有效對(duì)抗炎性因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和IL-12 的活性，同時(shí)抑制TNF-α 的活性，減輕炎性反應(yīng)。本研究采用閉合針刀松解聯(lián)合葛根素注射液治療兔模型膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性新西蘭大白兔30 只，購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量（1.3±0.1）kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（遼）2019-0004；新西蘭大白兔自購(gòu)入后飼養(yǎng)于動(dòng)物籠內(nèi)，每只放置于單獨(dú)動(dòng)物籠中，自然光照，自由飲水，每2 天更換墊料1次，保持盒內(nèi)環(huán)境清潔。

1.2 材料與儀器樂(lè)灸牌小針刀φ0.25 mm×30 mm（馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司，器械許可證：皖械注準(zhǔn)20172270054）；葛根素注射液（浙江康恩貝制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20056320，批號(hào)：060703）；玻璃酸鈉注射液（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10960136，批號(hào)：201802065）；伯樂(lè)680 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIORAD 公司）；QuantiTect Probe RT-PCR Kit 試劑盒（凱杰公司）；TRIzol基（美國(guó)GE公司）；兔TNF-α檢測(cè)ELISA 試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：RBE102a.48）；兔IL-1檢測(cè)ELISA試劑盒（上海樊克生物科技有限公司，貨號(hào)：FK-JA2304）；兔IL-6 檢測(cè)ELISA 試劑盒（上海科順生物科技有限公司，貨號(hào)：KS17072）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模 選擇新西蘭大白兔30 只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、葛根素組、針刀聯(lián)合葛根素組和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組，每組6 只。將兔在動(dòng)物房飼養(yǎng)3 天后，除空白對(duì)照組外其余各組根據(jù)文獻(xiàn)［5］方法制作兔OA 模型。造模方法：將大白兔麻醉后，對(duì)大白兔的右側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮并進(jìn)行術(shù)前消毒，從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切開(kāi)膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀的尖端切斷膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)副韌帶，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔后，用眼科剪切斷前交叉韌帶，沖洗關(guān)節(jié)后，進(jìn)行抽屜試驗(yàn)。如果抽屜試驗(yàn)陽(yáng)性表明前交叉韌帶已經(jīng)完全被剪斷，之后縫合手術(shù)切口。術(shù)后注射3天青霉素，每次40萬(wàn)U。術(shù)后1周開(kāi)始驅(qū)趕兔子運(yùn)動(dòng)，每天30 min，6 周后模型制做完成。大白兔出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)腔積液、活動(dòng)困難等癥狀為造模成功。

1.3.2 干預(yù)方法 1）藥物干預(yù)：術(shù)后第1 周開(kāi)始，每周給葛根素組大白兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1 次葛根素注射液，每次0.3 mL；每周給透明質(zhì)酸鈉組大白兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1 次葛根素注射液，每次0.3 mL，每周給空白對(duì)照組注射1 次生理鹽水，每次0.3 mL。2）針刀松解術(shù)：術(shù)后第1周開(kāi)始，針刀聯(lián)合葛根素組和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組于關(guān)節(jié)腔給藥前進(jìn)行大白兔膝關(guān)節(jié)行針刀松解術(shù)，將針刀刺入組織后，以通透剝離手法加壓切割病變部位，松解術(shù)后，屈伸關(guān)節(jié)。每周1次，共松解5周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6和TNF-α含量 在第6 周將大白兔通過(guò)耳緣靜脈注射氣栓的方法處死。用注射器抽取關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液，并將取出的關(guān)節(jié)液離心（離心半徑：14 cm，3000 r/min 離心10 min），留取少量上清液。通過(guò)ELISA 檢測(cè)兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6 和TNF-α 含量。具體實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 兔膝軟骨關(guān)節(jié)中MMP-1和MMP-13 mRNA 取出兔的膝軟骨1 g，在液氮中冷凍后用研磨器將軟骨捻成粉狀，用TRIzol 裂解后提取總RNA，方法按照QuantiTect Probe RT-PCR Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。合成cDNA后，對(duì)MMP-1基因、MMP-13 基因和GAPDH進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。MMP-1的上游引物為S：5'-AGGGTCAAGCAGACATCA-3'，下游引物為5'-TGATGTCTGCTTGACCCT-3'；MMP-13 的 上 游 引 物 為S：5'-TTCGGCTTAGAGGTGACAGG-3'，下游引物為5'-ACTCTTGCCGGTGTAGGTGT-3'；GAPDH 的上游引物為5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3' ，下 游 引 物5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)中液lL-1、lL-6和TNF-α含量實(shí)驗(yàn)6 周后，模型組兔膝關(guān)節(jié)液中的IL-1、IL-6 和TNF-α 含量與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)葛根素、針刀聯(lián)合葛根素和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉連續(xù)治療5 周后，各治療組關(guān)節(jié)液中的IL-1、IL-6 和TNF-α 含量均低于模型組。針刀聯(lián)合葛根素組、針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組與葛根素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組療效相當(dāng)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大白兔6周后膝關(guān)節(jié)中液lL-1、lL-6和TNF-α含量及MMP-1和MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)比較（±s）

表1 各組大白兔6周后膝關(guān)節(jié)中液lL-1、lL-6和TNF-α含量及MMP-1和MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)比較（±s）

注：*表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；&表示與葛根組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組葛根素組針刀聯(lián)合葛根素組針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)0.11±0.04#0.63±0.10*0.29±0.04#*0.19±0.05#*&0.27±0.04#*&兔數(shù)6 6 6 6 6 IL-1（ng/L）22.12±3.32#59.01±4.13*33.43±1.21#*30.51±2.16#*&27.36±1.19#*&IL-6（ng/L）99.17±11.56#179.63±5.19*122.67±5.94#*110.63±4.15#*&115.29±3.67#*&TNF-α（ng/L）18.45±2.27#55.12±30.14*29.56±1.12#*25.79±2.22#*&25.24±2.26#*&MMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)0.12±0.02#0.59±0.09*0.33±0.11#*0.22±0.09#*&0.25±0.09#*&

2.2 兔膝軟骨中MMP-1 和MMP-13 mRNA 相對(duì)表達(dá)實(shí)驗(yàn)6周后，模型組中的MMP-1和MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)葛根素、針刀聯(lián)合葛根素和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉連續(xù)治療5周后，各治療組MMP-1和MMP-13 mRNA的表達(dá)量均低于模型組。針刀聯(lián)合葛根素組、針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組與葛根素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組療效相當(dāng)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

OA 屬于中醫(yī)學(xué)中“痹證”“骨痹”的范疇，明朝醫(yī)學(xué)家張景岳著《景岳全書(shū)》記載：“蓋痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而病也?！保?］中醫(yī)認(rèn)為痹證屬于肝腎虧損，氣血兩虛，復(fù)感外邪，筋脈失于滋潤(rùn)濡養(yǎng)，容易招致風(fēng)寒濕邪侵入，阻塞經(jīng)絡(luò)，致使氣血運(yùn)行不暢所致。針刀療法是以針灸為理論基礎(chǔ)，在西醫(yī)手術(shù)理論基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來(lái)的一種外治法。針刀療法的治療原則是“松”和“解”并用，通過(guò)解除關(guān)節(jié)周?chē)M織的粘連、攣縮，達(dá)到疏通阻塞、降低關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓力、調(diào)整關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)力平衡、通痹散結(jié)的目的［7］。針刀在改變組織中物理粘連的同時(shí)也可減少關(guān)節(jié)內(nèi)炎性介質(zhì)的釋放。研究表明，針刀可以降低關(guān)節(jié)囊內(nèi)IL-6、IL-10 和TNF-α炎性細(xì)胞因子的含量［8］。由此可見(jiàn)，針刀療法屬于OA 的對(duì)因治療，既可以有效地減少參與OA的炎癥介質(zhì)的釋放，又可以緩解關(guān)節(jié)疼痛。

OA 的病理尚未明確，目前有多種學(xué)說(shuō)用來(lái)解釋OA 產(chǎn)生的原因，其中包括關(guān)節(jié)應(yīng)力平衡失調(diào)學(xué)說(shuō)、關(guān)節(jié)疼痛綜合征學(xué)說(shuō)和炎癥慢性刺激學(xué)說(shuō)。無(wú)論哪種學(xué)說(shuō)都認(rèn)為關(guān)節(jié)內(nèi)的細(xì)胞因子是造成OA形成的重要原因［9］。IL-1通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌前列環(huán)素2 造成關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)刺激骨吸收的發(fā)生及成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖，導(dǎo)致軟骨增生性變化，這也是OA 發(fā)展到后期伴有骨質(zhì)增生的重要原因［10］。IL-6 是一種炎癥細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，它可以作用于吞噬細(xì)胞并促進(jìn)其活化，進(jìn)而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。TNF-α 是一種炎癥促進(jìn)因子，它對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用，可刺激中性粒細(xì)胞的活化，最終釋放大量的炎性介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)［11］。MMP-1 和MMP-13 屬基質(zhì)蛋白酶家族中的一種膠原酶亞型，它們的主要作用是裂解軟骨基質(zhì)中的Ⅱ型膠原，尤以MMP-13 對(duì)Ⅱ型膠原裂解能力最強(qiáng)。MMP-13 在正常的滑膜關(guān)節(jié)中幾乎沒(méi)有表達(dá)，但在OA 中MMP-13 表達(dá)持續(xù)升高，其增高程度與軟骨組織的破壞程度成正相關(guān)，即軟骨關(guān)節(jié)破壞程度越嚴(yán)重，MMP-13的表達(dá)越高。

葛根素是從豆科植物野葛或甘葛藤的根中提取出來(lái)的一種黃酮類(lèi)化合物，其來(lái)源范圍廣，價(jià)格低廉，毒性小，具有明確調(diào)節(jié)免疫力、促進(jìn)血液循環(huán)、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性，廣泛地應(yīng)用于臨床中［12］。研究表明，葛根素對(duì)炎性因子具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可以抑制白細(xì)胞介素系統(tǒng)中的促炎因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8及IL-12的生物學(xué)活性，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活膽堿能抗炎通路實(shí)現(xiàn)的［13］。同時(shí)，葛根素可以通過(guò)抑制TNF-α 而減少中性粒細(xì)胞狙擊，減輕炎癥介質(zhì)的釋放，緩解炎癥。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)葛根素、針刀聯(lián)合葛根素和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉連續(xù)治療5 周后，各治療組關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6 和TNF-α 含量及MMP-1和MMP-13 mRNA的表達(dá)量均低于模型組，而且針刀聯(lián)合葛根素治療效果明顯優(yōu)于單純使用葛根素組，針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組間沒(méi)有顯著差異。短期研究結(jié)果顯示針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組的治療效果接近，但據(jù)報(bào)道葛根素的遠(yuǎn)期療效好，OA 復(fù)發(fā)率低且患者滿(mǎn)意度高［14］。因此，針刀松解聯(lián)合葛根素注射液治療OA具有良好的應(yīng)用前景。