針刀聯(lián)合葛根素膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究*

趙 耀，王立恒△，李鳳巖，董 嵩，苗蘭英，林大勇，張麗萍

1 大連市第二人民醫(yī)院，遼寧 大連 116011； 2 朝陽市第二醫(yī)院，遼寧 朝陽 122000；3 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是骨科常見病，其臨床表現(xiàn)主要以手、足、膝、肘和肩等遠端關(guān)節(jié)疼痛為主，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)活動受限，關(guān)節(jié)發(fā)出捻發(fā)音并有滲液［1］。其病理改變?yōu)檐浌顷P(guān)節(jié)的退行性變?yōu)橹?，并可伴有繼發(fā)性骨質(zhì)增生。OA 的主要特點為病程持續(xù)時間長，在治療過程中容易出現(xiàn)反復(fù)。目前治療OA 主要以類固醇激素或透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射緩解癥狀為主，但該方法并不能從根本上治療關(guān)節(jié)的退行性改變，不能有效解除關(guān)節(jié)的粘連，且遠期治療效果不佳［2］。研究顯示，OA 的病因與關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)降解有關(guān)，同時關(guān)節(jié)腔內(nèi)的多種炎性因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白 細 胞 介 素6（interleukin-1，IL-6）也參與到骨關(guān)節(jié)炎的病程中［3］。在OA 的形成過程中，關(guān)節(jié)的滑膜和關(guān)節(jié)軟骨細胞受到損傷后可以產(chǎn)生炎性細胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α，而這些炎性因子可促進軟骨細胞基質(zhì)降解，產(chǎn)生基質(zhì)金屬酶蛋白1（matrix metalloproteinases-1，MMP-1）和基質(zhì)金屬酶蛋白13（matrix metalloproteinases-1，MMP-13），加重關(guān)節(jié)軟骨的損傷。

針刀松解術(shù)用針刀游離、切割粘連的組織，這樣可以直接在患處解除粘連，疏通經(jīng)絡(luò)，松解肌肉、韌帶、腱鞘和關(guān)節(jié)囊，恢復(fù)關(guān)節(jié)的力學(xué)功能，減輕患者痛苦。因此，針刀松解術(shù)具有創(chuàng)傷小、適用范圍廣、療效顯著、性價比高、無毒副作用的優(yōu)勢，目前已經(jīng)應(yīng)用于OA的臨床治療中。

葛根素是中藥葛根的有效成分之一，是從干燥的葛根中分離出來的一種異黃酮類化合物。葛根素具有毒副作用小，來源廣泛的特點，其藥理學(xué)活性包括調(diào)節(jié)免疫功能、改善循環(huán)、保護心肌、抗衰老、抗腫瘤等多種功效［4］。研究表明，葛根素可以有效對抗炎性因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和IL-12 的活性，同時抑制TNF-α 的活性，減輕炎性反應(yīng)。本研究采用閉合針刀松解聯(lián)合葛根素注射液治療兔模型膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性新西蘭大白兔30 只，購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，體質(zhì)量（1.3±0.1）kg，實驗動物許可證號：SYXK（遼）2019-0004；新西蘭大白兔自購入后飼養(yǎng)于動物籠內(nèi)，每只放置于單獨動物籠中，自然光照，自由飲水，每2 天更換墊料1次，保持盒內(nèi)環(huán)境清潔。

1.2 材料與儀器樂灸牌小針刀φ0.25 mm×30 mm（馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司，器械許可證：皖械注準(zhǔn)20172270054）；葛根素注射液（浙江康恩貝制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20056320，批號：060703）；玻璃酸鈉注射液（山東博士倫福瑞達制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10960136，批號：201802065）；伯樂680 全自動酶標(biāo)儀（美國BIORAD 公司）；QuantiTect Probe RT-PCR Kit 試劑盒（凱杰公司）；TRIzol基（美國GE公司）；兔TNF-α檢測ELISA 試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號：RBE102a.48）；兔IL-1檢測ELISA試劑盒（上海樊克生物科技有限公司，貨號：FK-JA2304）；兔IL-6 檢測ELISA 試劑盒（上?？祈樕锟萍加邢薰?，貨號：KS17072）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模 選擇新西蘭大白兔30 只，隨機分為空白對照組、模型組、葛根素組、針刀聯(lián)合葛根素組和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組，每組6 只。將兔在動物房飼養(yǎng)3 天后，除空白對照組外其余各組根據(jù)文獻［5］方法制作兔OA 模型。造模方法：將大白兔麻醉后，對大白兔的右側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮并進行術(shù)前消毒，從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切開膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀的尖端切斷膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)副韌帶，打開關(guān)節(jié)腔后，用眼科剪切斷前交叉韌帶，沖洗關(guān)節(jié)后，進行抽屜試驗。如果抽屜試驗陽性表明前交叉韌帶已經(jīng)完全被剪斷，之后縫合手術(shù)切口。術(shù)后注射3天青霉素，每次40萬U。術(shù)后1周開始驅(qū)趕兔子運動，每天30 min，6 周后模型制做完成。大白兔出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)腔積液、活動困難等癥狀為造模成功。

1.3.2 干預(yù)方法 1）藥物干預(yù)：術(shù)后第1 周開始，每周給葛根素組大白兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1 次葛根素注射液，每次0.3 mL；每周給透明質(zhì)酸鈉組大白兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1 次葛根素注射液，每次0.3 mL，每周給空白對照組注射1 次生理鹽水，每次0.3 mL。2）針刀松解術(shù)：術(shù)后第1周開始，針刀聯(lián)合葛根素組和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組于關(guān)節(jié)腔給藥前進行大白兔膝關(guān)節(jié)行針刀松解術(shù)，將針刀刺入組織后，以通透剝離手法加壓切割病變部位，松解術(shù)后，屈伸關(guān)節(jié)。每周1次，共松解5周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6和TNF-α含量 在第6 周將大白兔通過耳緣靜脈注射氣栓的方法處死。用注射器抽取關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液，并將取出的關(guān)節(jié)液離心（離心半徑：14 cm，3000 r/min 離心10 min），留取少量上清液。通過ELISA 檢測兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6 和TNF-α 含量。具體實驗方法參照試劑盒說明書進行。

1.4.2 兔膝軟骨關(guān)節(jié)中MMP-1和MMP-13 mRNA 取出兔的膝軟骨1 g，在液氮中冷凍后用研磨器將軟骨捻成粉狀，用TRIzol 裂解后提取總RNA，方法按照QuantiTect Probe RT-PCR Kit試劑盒說明書進行。合成cDNA后，對MMP-1基因、MMP-13 基因和GAPDH進行實時定量PCR擴增。MMP-1的上游引物為S：5'-AGGGTCAAGCAGACATCA-3'，下游引物為5'-TGATGTCTGCTTGACCCT-3'；MMP-13 的 上 游 引 物 為S：5'-TTCGGCTTAGAGGTGACAGG-3'，下游引物為5'-ACTCTTGCCGGTGTAGGTGT-3'；GAPDH 的上游引物為5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3' ，下 游 引 物5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件對結(jié)果進行分析，計量資料采用±s表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)中液lL-1、lL-6和TNF-α含量實驗6 周后，模型組兔膝關(guān)節(jié)液中的IL-1、IL-6 和TNF-α 含量與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過葛根素、針刀聯(lián)合葛根素和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉連續(xù)治療5 周后，各治療組關(guān)節(jié)液中的IL-1、IL-6 和TNF-α 含量均低于模型組。針刀聯(lián)合葛根素組、針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組與葛根素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組療效相當(dāng)（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大白兔6周后膝關(guān)節(jié)中液lL-1、lL-6和TNF-α含量及MMP-1和MMP-13 mRNA相對表達比較（±s）

表1 各組大白兔6周后膝關(guān)節(jié)中液lL-1、lL-6和TNF-α含量及MMP-1和MMP-13 mRNA相對表達比較（±s）

注：*表示與空白對照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；&表示與葛根組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組葛根素組針刀聯(lián)合葛根素組針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組MMP-13 mRNA相對表達0.11±0.04#0.63±0.10*0.29±0.04#*0.19±0.05#*&0.27±0.04#*&兔數(shù)6 6 6 6 6 IL-1（ng/L）22.12±3.32#59.01±4.13*33.43±1.21#*30.51±2.16#*&27.36±1.19#*&IL-6（ng/L）99.17±11.56#179.63±5.19*122.67±5.94#*110.63±4.15#*&115.29±3.67#*&TNF-α（ng/L）18.45±2.27#55.12±30.14*29.56±1.12#*25.79±2.22#*&25.24±2.26#*&MMP-1 mRNA相對表達0.12±0.02#0.59±0.09*0.33±0.11#*0.22±0.09#*&0.25±0.09#*&

2.2 兔膝軟骨中MMP-1 和MMP-13 mRNA 相對表達實驗6周后，模型組中的MMP-1和MMP-13 mRNA相對表達與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過葛根素、針刀聯(lián)合葛根素和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉連續(xù)治療5周后，各治療組MMP-1和MMP-13 mRNA的表達量均低于模型組。針刀聯(lián)合葛根素組、針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組與葛根素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組療效相當(dāng)（P＞0.05）。見表1。

3 討論

OA 屬于中醫(yī)學(xué)中“痹證”“骨痹”的范疇，明朝醫(yī)學(xué)家張景岳著《景岳全書》記載：“蓋痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而病也?！保?］中醫(yī)認(rèn)為痹證屬于肝腎虧損，氣血兩虛，復(fù)感外邪，筋脈失于滋潤濡養(yǎng)，容易招致風(fēng)寒濕邪侵入，阻塞經(jīng)絡(luò)，致使氣血運行不暢所致。針刀療法是以針灸為理論基礎(chǔ)，在西醫(yī)手術(shù)理論基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的一種外治法。針刀療法的治療原則是“松”和“解”并用，通過解除關(guān)節(jié)周圍組織的粘連、攣縮，達到疏通阻塞、降低關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓力、調(diào)整關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)力平衡、通痹散結(jié)的目的［7］。針刀在改變組織中物理粘連的同時也可減少關(guān)節(jié)內(nèi)炎性介質(zhì)的釋放。研究表明，針刀可以降低關(guān)節(jié)囊內(nèi)IL-6、IL-10 和TNF-α炎性細胞因子的含量［8］。由此可見，針刀療法屬于OA 的對因治療，既可以有效地減少參與OA的炎癥介質(zhì)的釋放，又可以緩解關(guān)節(jié)疼痛。

OA 的病理尚未明確，目前有多種學(xué)說用來解釋OA 產(chǎn)生的原因，其中包括關(guān)節(jié)應(yīng)力平衡失調(diào)學(xué)說、關(guān)節(jié)疼痛綜合征學(xué)說和炎癥慢性刺激學(xué)說。無論哪種學(xué)說都認(rèn)為關(guān)節(jié)內(nèi)的細胞因子是造成OA形成的重要原因［9］。IL-1通過促進軟骨細胞分泌前列環(huán)素2 造成關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，同時刺激骨吸收的發(fā)生及成骨細胞樣細胞增殖，導(dǎo)致軟骨增生性變化，這也是OA 發(fā)展到后期伴有骨質(zhì)增生的重要原因［10］。IL-6 是一種炎癥細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，它可以作用于吞噬細胞并促進其活化，進而加強炎癥反應(yīng)。TNF-α 是一種炎癥促進因子，它對中性粒細胞具有趨化作用，可刺激中性粒細胞的活化，最終釋放大量的炎性介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)［11］。MMP-1 和MMP-13 屬基質(zhì)蛋白酶家族中的一種膠原酶亞型，它們的主要作用是裂解軟骨基質(zhì)中的Ⅱ型膠原，尤以MMP-13 對Ⅱ型膠原裂解能力最強。MMP-13 在正常的滑膜關(guān)節(jié)中幾乎沒有表達，但在OA 中MMP-13 表達持續(xù)升高，其增高程度與軟骨組織的破壞程度成正相關(guān)，即軟骨關(guān)節(jié)破壞程度越嚴(yán)重，MMP-13的表達越高。

葛根素是從豆科植物野葛或甘葛藤的根中提取出來的一種黃酮類化合物，其來源范圍廣，價格低廉，毒性小，具有明確調(diào)節(jié)免疫力、促進血液循環(huán)、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性，廣泛地應(yīng)用于臨床中［12］。研究表明，葛根素對炎性因子具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可以抑制白細胞介素系統(tǒng)中的促炎因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8及IL-12的生物學(xué)活性，其作用機制可能是通過激活膽堿能抗炎通路實現(xiàn)的［13］。同時，葛根素可以通過抑制TNF-α 而減少中性粒細胞狙擊，減輕炎癥介質(zhì)的釋放，緩解炎癥。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過葛根素、針刀聯(lián)合葛根素和針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉連續(xù)治療5 周后，各治療組關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6 和TNF-α 含量及MMP-1和MMP-13 mRNA的表達量均低于模型組，而且針刀聯(lián)合葛根素治療效果明顯優(yōu)于單純使用葛根素組，針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組間沒有顯著差異。短期研究結(jié)果顯示針刀聯(lián)合葛根素組與針刀聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉組的治療效果接近，但據(jù)報道葛根素的遠期療效好，OA 復(fù)發(fā)率低且患者滿意度高［14］。因此，針刀松解聯(lián)合葛根素注射液治療OA具有良好的應(yīng)用前景。