基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)研究甘草附子湯治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制*

藍紹航，龐宇舟，區(qū)佩琪，韋露秋，羅筱凡，呂 挺

1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022； 2 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜的炎性反應(yīng)和異常增生為病理表現(xiàn)，影響關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外結(jié)構(gòu)的慢性、全身性、自身免疫性疾病［1］，臨床以多關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫痛、軟骨和骨破壞，甚至關(guān)節(jié)畸形和功能喪失為主要表現(xiàn)特征。我國RA 的患病率約為0.42%，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢［2］。RA 至今病因未明，西醫(yī)認為主要與遺傳、感染、內(nèi)分泌失調(diào)和藥物誘導等因素有關(guān)，多選用非甾體類抗炎藥、激素、抗風濕藥、生物藥劑及小分子植入藥等治療，但這些藥物存在劑量大、給藥頻繁、毒副作用嚴重等缺點［3］。

RA 屬于中醫(yī)“痹證”范疇。《素問·痹論篇》曰：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹也。”［4］《黃帝內(nèi)經(jīng)》首提“痹”之病名，明確提出痹證是風、寒、濕三氣雜至，故多以祛風、散寒、除濕為基本治法。甘草附子湯源自張仲景《傷寒雜病論》：“風濕相摶，骨節(jié)疼煩，掣痛不得屈伸，近之則痛劇，汗出短氣，小便不利，惡風不欲去衣，或身微腫者，甘草附子湯主之?！保?］方中桂枝溫通陽氣，祛風和營；白術(shù)苦溫，健脾燥濕；附子辛熱扶陽溫經(jīng)，長于祛寒。附、桂、術(shù)三藥相伍，既除風、寒、濕，又溫表陽而固衛(wèi)氣，故被譽為治風濕之圣藥［6］。又痹證急而劇，甘草既調(diào)和諸藥，又緩急止痛。全方合用，可有效抓住RA 病源，切中病機，扼其病勢，提高療效。近年來運用甘草附子湯治療RA 也取得一定的研究進展，廖常志運用甘草附子湯治療RA 患者23 例，總有效率達100%［7］。王穎等［8］通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ委烺A 常見藥物頻次總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，桂枝和甘草分別排在出現(xiàn)頻次最高的第2 位和第4 位。研究發(fā)現(xiàn)，甘草附子湯能抑制T 淋巴細胞的增殖與分化，減少炎性細胞向滑膜組織的浸潤，下調(diào)血清相關(guān)細胞因子白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）的表達水平，進而起到抗炎和消除關(guān)節(jié)腫脹的作用［9］。此外，蔡悅等［10］研究發(fā)現(xiàn)，甘草附子湯可通過減少TNF-α、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性細胞因子的產(chǎn)生，降低滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinases-1）、MMP-3蛋白表達，從而抑制RA小鼠關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕的發(fā)生。

目前對于甘草附子湯治療RA 的研究較多，但尚未對其作用機制進行系統(tǒng)闡釋。網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于系統(tǒng)生物學、藥理學、藥物化學和生物化學的一門綜合性的新興學科，為中藥發(fā)展提供新的研究思想，是藥物研究的新模式［11］，為明確藥物作用機制、新藥研發(fā)、復方用藥等提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐［12］。同時，分子對接（molecular docking）也可揭示藥物治療疾病的分子機制，將藥理作用上升到分子水平上，為研究藥物機制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)［13］。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)，利用甘草附子湯中的化合物和受體分子虛擬結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其作用靶點和結(jié)合位點，闡述甘草附子湯多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用機制，彌補片面的、不系統(tǒng)的研究，為后續(xù)深入研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點預測在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選甘草附子湯（甘草、附子、桂枝、白術(shù)）的全部化學成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性指數(shù)（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選標準，確定藥物的活性成分。然后在Related Targets一欄中找出其所對應(yīng)的作用靶點，將所有藥物靶點進行合并整理，剔除重復的藥物靶點，在Uniport數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中輸入靶點名稱并限定物種為homo sapiens（human），對靶點進行蛋白名稱標準化，獲得靶點對應(yīng)的標準基因名。

1.2 RA疾病靶點獲取以“rheumatoid arthritis”為檢索詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、Pharm-Gkb（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）等數(shù)據(jù)庫獲取RA 相關(guān)靶點基因。對收集的所有RA 靶點進行處理，刪除重復靶點，即為所需的RA 總靶點。再利用R 語言繪制RA 靶點基因交集Venny圖。

1.3 甘草附子湯與RA 交集靶點篩選將上述獲得的藥物靶點與疾病靶點基因通過R 語言繪制Venny 圖，對甘草附子湯活性成分靶點與RA 相關(guān)靶點基因進行映射，得到藥物與疾病交集靶點。

1.4 構(gòu)建活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)將以上所得的甘草附子湯所有藥物的活性成分交集和RA 靶點基因交集數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件，并對其參數(shù)進行設(shè)置，得到活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPl）網(wǎng)絡(luò)及核心基因預測將篩選得到的“Drug-Disease”中的靶點蛋白導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)置為“0.900”，同時設(shè)置隱藏游離點，其余參數(shù)保持默認，進行蛋白質(zhì)互作分析，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將獲得數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件，使用Network Analyzer插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析篩選關(guān)鍵基因。

1.6 GO 功能富集分析與KEGG 通路分析將“1.3”項下篩選得到的藥物疾病靶點交集通過導入R 語言軟件中進行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。兩者皆以P＜0.01為篩選標準。

1.7 分子對接為驗證篩選出的甘草附子湯治療RA 可能關(guān)鍵靶點的準確性，將“1.1”項和“1.5”項中整理出的排名靠前的活性成分與藥物靶點進行 分 子 對 接。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的小分子配體2D 結(jié)構(gòu)，將2D 文件導入ChemBio3D Ultra 14.0軟件生成3D結(jié)構(gòu)，使用優(yōu)化模塊進行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲取最穩(wěn)定的分子構(gòu)象。從PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白受體三維結(jié)構(gòu)，并將其導入PyMOLWin 軟件，輸入命令刪除靶蛋白的水分子和小分子配體，完成蛋白受體準備。將蛋白受體文件導入AutoDock-Tools-1.5.6 軟件中，對蛋白分子加氫等處理，保存文件為pdbqt 格式，再將小分子配體文件導入AutoDockTools-1.5.6 軟件中，把文件轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式。以靶點的原型配體所在位置的中心定義為活性對接口袋位點，口袋大小設(shè)為1.0 nm，其他參數(shù)根據(jù)需要適當調(diào)整，確定活性口袋，使用Autodock vina軟件進行對接。

2 結(jié)果

2.1 甘草附子湯有效活性成分篩選及靶點預測經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜索，搜索關(guān)鍵詞為“甘草、桂枝、白術(shù)、附子”，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，檢索到甘草附子湯4 味藥材的有效活性成分共有127 個，其中甘草92 個、桂枝7 個、白術(shù)7 個、附子21 個。整理后預測靶點為1895 個，經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫標準化注釋并刪除重復靶點后得到133個作用靶點。見表1。

表1 “中藥-活性成分-疾病靶點”信息 個

2.2 藥物靶點與疾病靶點交集經(jīng)分析得到藥物潛在活性成分靶點133個，RA疾病基因3750個，見圖1；二者得出的交集靶點基因為133個，見圖2。

圖1 疾病基因合并Venny圖

圖2 藥物靶點和疾病靶點Venny圖

2.3 活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)將“2.2”得到的133 個交集靶點運用Perl 相關(guān)腳本進行文件處理，所得數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖3中圓形節(jié)點代表藥物的有效成分，綠、紅、橙、藍色分別代表甘草、白術(shù)、桂枝、附子的有效成分，多個顏色代表多個藥物共同的有效成分，灰色線條代表邊，黃色三角形節(jié)點代表中藥和疾病的交集靶點。圖中共有246個節(jié)點，其中來源于化合物的有99個，來源于基因的有147 個；經(jīng)統(tǒng)計degree 較高的有效成分為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、芒柄花素（formononetin）等。見表2。

圖3 活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表2 度值大于20的前4位化學成分

2.4 PPl 網(wǎng)絡(luò)及核心基因預測將“2.2”項得到的133 個交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，得出string_interactions文件，并以tsv 格式保存。網(wǎng)絡(luò)圖共有132 個節(jié)點、435條邊，平均每個節(jié)點的度值為6.59，平均局部聚類系數(shù)為0.489，PPI enrichment p-value值為＜1.0e-16，鄰接節(jié)點數(shù)目越多，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著。見圖4。將tsv 格式文件數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，使用Network Analyzer 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析篩選關(guān)鍵基因，處于核心位置的靶點有JAK2、JUN、IL-10、TNF、CSF2、CCL2、JAK3、IL-1B、JAK1、MAPK14、IL-2、IL-6等，提示這些基因在PPI中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。見圖5。

圖4 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析經(jīng)GO富集分析共得到1912 條富集結(jié)果，其中生物過程（biological process，BP）1792 個，主要涉及對細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、對細胞黏附調(diào)節(jié)、對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對細菌源分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物過程的調(diào)節(jié)；細胞組分（cellular component，CC）28 個，主要涉及質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細胞組分；分子功能（molecular function，MF）89個，主要涉及細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性等。提示甘草附子湯在治療RA 過程中通過參與調(diào)控多種生物學過程而發(fā)揮作用。見圖6。

圖6 交集基因GO條形圖

經(jīng)KEGG 通路富集分析共得到131條通路富集結(jié)果，主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、恰加斯病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、新型冠狀病毒肺炎、肺結(jié)核、人巨細胞病毒感染、TNF信號通路）、破骨細胞分化、人T細胞白血病病毒1感染等。提示甘草附子湯可能通過以上通路發(fā)揮對RA的治療作用。見圖7。

圖7 交集基因KEGG條形圖

2.6 潛在活性成分-核心靶點分子對接分析根據(jù)甘草附子湯“活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)中靶點與成分連接的度值，選取活性化合物中degree＞20 的槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素4 個主要有效成分，分別與經(jīng)拓撲分析篩選后的關(guān)鍵核心靶點IL-6、JUN、MAPK14 進行分子對接。分子之間結(jié)合能量較低的構(gòu)象則較為穩(wěn)定，篩選對接結(jié)果中結(jié)合能量低的分子構(gòu)象即為最優(yōu)對接結(jié)果，結(jié)果表明槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素與IL-6、JUN、MAPK14 的結(jié)合能均≤-6.0 kcal/mol，展現(xiàn)出良好的結(jié)合力。見圖8，表3。

圖8 潛在活性成分-核心靶點分子對接分析

表3 槲皮素、山柰酚、柚皮素和芒柄花素與RA潛在靶點結(jié)合能量 kcal/mol

3 討論

甘草附子湯臨床應(yīng)用廣泛，為深入研究其治療RA 的作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，共篩選出127 個活性成分及133 個靶點，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素等活性成分對應(yīng)靶點較多，是甘草附子湯治療RA 的主要成分。槲皮素具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用［14-15］，可促進RA成纖維樣滑膜細胞的凋亡［16］，降低IL-1β誘導的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）產(chǎn)物量與MMP-1、MMP-3、MMP-13的含量表達，抑制NF-κB激活，減弱炎癥環(huán)境下軟骨細胞內(nèi)MMP-13 的產(chǎn)生、基質(zhì)降解和細胞凋亡，從而起到保護軟骨的作用［17-18］。山柰酚具有顯著的抗炎作用，可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等信號通路的表達，調(diào)控炎癥反應(yīng)過程，減少炎癥因子產(chǎn)生，從而有效抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展［19］。柚皮素、芒柄花素等活性成分也有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用［14-15］，但關(guān)于其治療RA 的作用目前鮮見報道，這可作為將來研究中藥活性成分治療RA 的新方向。上述成分在經(jīng)過分子對接后進一步驗證其可信度，為下一步臨床研究治療RA提供了新依據(jù)。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后篩選到JAK2、JUN、IL-10、TNF、CSF2、CCL2、JAK3、IL1B、JAK1、MAPK14、IL-2、IL-6 等12 個核心靶點，其中以IL-6 最為關(guān)鍵。IL-6 是活動期RA 患者血清及關(guān)節(jié)液中含量最高的細胞因子之一，其功能涉及多種與炎癥相關(guān)的疾病狀態(tài)，包括對糖尿病和全身性RA 的可疑性［20-21］。同時，破骨細胞活性與關(guān)節(jié)破壞程度密切相關(guān)，IL-6 作為一種炎性因子，可引起人體內(nèi)破骨細胞與成骨細胞之間的平衡失調(diào)，是造成RA發(fā)生發(fā)展的主因之一［22］。高濃度的IL-6 可刺激骨吸收的調(diào)節(jié)作用，進一步刺激破骨細胞的前體細胞，激發(fā)破骨細胞活性，導致骨質(zhì)破壞，通過多通路、多靶點參與RA 的炎癥反應(yīng)過程［23-24］。抑制IL-6的表達已成為治療RA的新方法［25］，托珠單抗（tocilizum）是目前廣泛應(yīng)用于臨床治療RA 的強效藥，可通過結(jié)合IL-6 跨膜及溶解性受體來抑制IL-6 介導的信號轉(zhuǎn)導，從而有效地緩解癥狀，預防關(guān)節(jié)破壞［26-27］。絲裂原活化蛋白激酶（MAKP）可參與細胞分化、增殖、生長、免疫調(diào)控等多種活動［28］，有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-137 通過MAPK 信號通路和IL-6/COX-II 活化在PMS 誘導的RA 急性加重中起重要作用［29］。轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）由多種蛋白復合物組成，廣泛參與調(diào)節(jié)細胞生命，如細胞分化、增殖、凋亡等過程，與外界環(huán)境壓力、細菌及病毒感染、多種疾病和病理損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、RA、腫瘤等［30-31］。TNF靶點也非常重要，TNF 參與機體的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)［32］，而TNF-α 在維護骨、軟骨組織的完整性及促進損傷修復方面發(fā)揮重要作用［33］。相關(guān)研究表明，其余靶點基因也與RA 密切相關(guān)，在此不再贅述。由此推測，甘草附子湯中的中藥有效成分可能是通過上述靶點發(fā)揮治療RA的作用。

GO 富集分析主要涉及對細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、對細胞黏附調(diào)節(jié)、對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對細菌源分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物過程的調(diào)節(jié)。其中，細胞因子是RA 炎癥及關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)，是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細胞生成、細胞生長及損傷組織修復等多種功能，細胞因子網(wǎng)絡(luò)的不平衡可能誘導和維持炎癥及相應(yīng)的組織損傷，在RA 發(fā)病機制中有重要作用，與RA 最密切相關(guān)的細胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-2 等［34-36］。脂多糖可刺激內(nèi)皮細胞誘導轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活性升高，并上調(diào)其他炎癥因子（如TNF-α、IL-1β）的表達，導致炎癥的持續(xù)發(fā)生以及骨質(zhì)的持續(xù)破壞并與其發(fā)生協(xié)同作用，產(chǎn)生炎癥性疾?。?7］。由此可知，在RA 的病理過程中，炎癥反應(yīng)是重要環(huán)節(jié)，如何使用中藥緩解RA的炎癥反應(yīng)是治療的重要內(nèi)容。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，甘草附子湯作用RA 的靶點主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、恰加斯病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、新型冠狀病毒肺炎、肺結(jié)核、人巨細胞病毒感染、TNF 信號通路、破骨細胞分化通路、人T 細胞白血病病毒1 感染等。以上通路大多數(shù)涉及炎癥反應(yīng)和骨破壞，而炎癥反應(yīng)和骨破壞是RA 的主要臨床表現(xiàn)，骨平衡被破壞是導致骨侵蝕的主因，炎癥反應(yīng)直接或間接誘導破骨細胞分化，并使其功能減少，導致RA骨破壞［38］。TNF信號通路是炎癥反應(yīng)的重要通路，可以激活MAPK/NF-κβ等加劇炎癥反應(yīng)［39］。良好的TNF 抑制劑臨床療效也驗證了該因子及其通路在RA 中的重要地位［40］。除上述信號通路外，尚有多條信號通路參與甘草附子湯治療RA 的過程，這些信號通路為我們進一步研究甘草附子湯與RA 的關(guān)系提供一定依據(jù)和思路。由此預測，甘草附子湯主要是通過調(diào)節(jié)上述通路下調(diào)炎性因子表達，調(diào)節(jié)骨代謝，干預骨破壞，調(diào)節(jié)免疫功能等發(fā)揮治療RA的作用，從而改善患者的生活質(zhì)量。

為驗證網(wǎng)絡(luò)預測的準確性，利用分子對接技術(shù)，選取甘草附子湯中4 個核心活性成分（槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素）與關(guān)鍵靶點IL-6、JUN、MAPK14 結(jié)合，結(jié)果提示結(jié)合能量均≤-6.0 kcal/mol，匹配能量較低，說明小分子與大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定，結(jié)合性好，展現(xiàn)出良好的親和力，也驗證了本研究成果。

綜上所述，RA 是一種病理機制非常復雜的疾病，甘草附子湯治療RA 的作用機制是一個多基因、多生物過程及多信號通路共同參與過程，符合中藥治療疾病多成分、多靶點的特征。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)，初步預測甘草附子湯對RA 的主要有效成分、作用靶點、相關(guān)通路及協(xié)同作用的分子機制，為后續(xù)進一步開展機制研究、藥物開發(fā)及臨床試驗等奠定基礎(chǔ)，也提供了理論依據(jù)、線索與思路。