GeneXpert MTB/RIF檢出量與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和利福平表型耐藥的關(guān)系

繆星國 葉 慧 蘇菲菲

（1.溫州市中心醫(yī)院感染科，浙江 溫州 325099；2.溫州市中心醫(yī)院 溫州市新發(fā)與再發(fā)傳染病診治重點實驗室，浙江 溫州 325099）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的常見傳染病，嚴(yán)重威脅人類健康。2019年世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病報告[1]顯示，我國2018年新發(fā)結(jié)核病病例約86.6萬，耐多藥結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核病患者約6.6萬例。快速、精確地診斷結(jié)核病及其耐藥性，可以有效減少感染的擴(kuò)散，提高治療效果，減輕患者和社會負(fù)擔(dān)。GeneXpert MTB/RIF（Xpert）檢測能夠提高結(jié)核病早期診斷率，并快速判斷利福平耐藥情況[2]，為肺結(jié)核的早期、合理治療提供依據(jù)。目前，Xpert檢測在肺結(jié)核診斷方面的研究報道[3-4]較多，結(jié)果均顯示，Xpert在一定程度上能反映患者體內(nèi)的MTB含量[5]，但目前痰液Xpert檢出量和MTB及其利福平耐藥關(guān)系的報道少見。本研究選取183例痰液Xpert檢測提示利福平耐藥的肺結(jié)核患者，分析其痰液Xpert檢出量與MTB培養(yǎng)陽性率和利福平耐藥表型假陽性率的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年4月—2019年12月溫州市中心醫(yī)院感染科183例初治肺結(jié)核患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）2次痰液Xpert檢測結(jié)果均提示利福平耐藥；2）同時送檢痰液MTB培養(yǎng)和一線抗結(jié)核藥物敏感性試驗。本研究經(jīng)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（L2021-02-044）。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 痰液MTB培養(yǎng)

將痰液標(biāo)本處理[5]后，接種于美國BD公司BactecMGIT液體培養(yǎng)管內(nèi)，采用BactecMGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 體外藥物敏感性試驗

采用液體法[6]進(jìn)行體外藥物敏感性試驗，體外藥物敏感性試驗藥物和標(biāo)準(zhǔn)濃度為：異煙肼0.1 μg/mL，利福平1.0 μg/mL，乙胺丁醇5.0 μg/mL，鏈霉素1.0 μg/mL。采用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株（由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供）進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.3 痰液Xpert檢測

采用Xpert擴(kuò)增檢測儀和配套Xpert檢測試劑盒（美國Cepheid公司）進(jìn)行痰液Xpert檢測。依據(jù)探針的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）判斷MTB檢出量：28

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料采用±s表示。計數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 183例肺結(jié)核患者一般情況

183例肺結(jié)核患者年齡18～81歲[（46.63±15.73）歲]，以41～64歲者居多，占45.9%。男性141例（77.0%），浙江省戶籍162例（88.5%），痰MTB培養(yǎng)陽性148例（80.9%），Xpert低檢出患者所占比例最高。見表1。

表1 183例肺結(jié)核患者一般情況

2.2 體外藥物敏感性試驗結(jié)果

148例MTB培養(yǎng)陽性患者中，利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥者分別有120例（81.08%）、117例（79.05%）、40例（27.03%）、78例（52.70%）。單純異煙肼、利福平或鏈霉素耐藥者分別有4、17、3例；異煙肼和利福平耐藥25例，異煙肼和乙胺丁醇耐藥1例，異煙肼和鏈霉素耐藥8例。異煙肼、利福平、乙胺丁醇耐藥12例，異煙肼、利福平和鏈霉素耐藥40例，異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥1例。對4種一線抗結(jié)核藥物均耐藥26例，均敏感11例。

2.3 不同Xpert檢出量患者M(jìn)TB培養(yǎng)陽性率

183例患者中，Xpert極低檢出患者的MTB培養(yǎng)陽性率最低（48.48%），高檢出患者M(jìn)TB培養(yǎng)陽性率最高（95.83%）。不同Xpert檢出量患者M(jìn)TB培養(yǎng)陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表2。

表2 不同Xpert檢出量患者M(jìn)TB培養(yǎng)陽性率比較

2.4 不同Xpert檢出量患者利福平耐藥表型假陽性率比較

148例MTB培養(yǎng)陽性患者中，Xpert極低檢出患者利福平耐藥表型假陽性率最高（43.75%）。不同Xpert檢出量患者利福平耐藥表型假陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022）。見表3。

表3 不同Xpert檢出量患者利福平耐藥表型假陽性率比較

3 討論

耐藥結(jié)核病的防治是我國結(jié)核病防治工作的重點、難點。早期診斷、合理治療能夠有效減少結(jié)核病的傳播。因此，快速診斷和耐藥性檢測顯得尤為重要。

痰液分枝桿菌涂片技術(shù)能快速檢出抗酸桿菌，但陽性率較低[7]，且不能區(qū)別抗酸桿菌的類型；而傳統(tǒng)的痰液MTB培養(yǎng)和耐藥性檢測耗時長，不利于結(jié)核病的早診早治。Xpert檢測只需數(shù)小時即可檢測出MTB DNA及其利福平耐藥結(jié)果[8]，已被廣泛用于臨床。本研究183例肺結(jié)核患者中，有148例（80.87%）痰液MTB培養(yǎng)陽性，仍有29.13%的患者培養(yǎng)陰性，提示Xpert檢測可作為傳統(tǒng)培養(yǎng)法確診MTB感染的補(bǔ)充。Xpert檢出量少的標(biāo)本陰性培養(yǎng)結(jié)果可能性較Xpert檢出量多的標(biāo)本大，原因可能為患者體內(nèi)MTB含量少，送檢痰液培養(yǎng)前已進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療，導(dǎo)致MTB活性降低或死亡，使MTB培養(yǎng)假陰性，而Xpert檢測無法有效區(qū)分死菌和活菌；痰液標(biāo)本的不正確留置和保存亦可影響細(xì)菌活性，導(dǎo)致標(biāo)本MTB含量進(jìn)一步下降，可能造成培養(yǎng)假陰性結(jié)果的增多[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗直接采集目標(biāo)區(qū)域標(biāo)本，減少了患者的因素，相較于痰液標(biāo)本，MTB培養(yǎng)陽性率較高[10]。

所有檢測技術(shù)都有其優(yōu)勢和局限性，Xpert檢測時效性和敏感性較高，但易出現(xiàn)利福平耐藥表型假陽性問題。本研究中，不同Xpert檢出量患者利福平耐藥表型檢測假陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022），極低檢出患者的假陽性率最高，表明痰液標(biāo)本菌含量低時，Xpert利福平耐藥性檢測假陽性率較高，與QIN等[11]研究結(jié)果相符。出現(xiàn)假陽性的原因可能有：1）MTB復(fù)制過程中發(fā)生基因突變，產(chǎn)生耐藥基因，導(dǎo)致發(fā)生異質(zhì)性耐藥，即同一患者同時存在敏感菌株和耐藥菌株，而突變株產(chǎn)生低水平耐藥時，會影響表型藥物敏感性試驗結(jié)果[12-13]，但對Xpert檢測無明顯影響；2）痰液標(biāo)本送檢前患者使用抗結(jié)核藥物會導(dǎo)致MTB生長能力下降，從而誤認(rèn)為利福平敏感；3）RpoB基因中的利福平耐藥決定區(qū)存在沉默現(xiàn)象，或者存在一些無意義突變，如Leu511Pro、Asp516Tyr、A451V，即RpoB基因或突變可被Xpert檢出，但MTB生長過程中不表達(dá)或表達(dá)缺失[14-15]?；谏鲜鲈?，建議進(jìn)一步檢測利福平耐藥表型與基因型不一致患者RpoB基因，明確出現(xiàn)假陽性的原因。

本研究尚有一定的局限性：首先，本研究只針對初治，且Xpert檢測利福平耐藥患者的痰液標(biāo)本，并未對復(fù)診或Xpert檢測利福平敏感患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行分析；其次，本研究為回顧性研究，患者痰液的咳出方式、痰液標(biāo)本量，以及對痰液的處理保存等過程，均不清楚，增加了發(fā)生偏移的可能，建議對無支氣管鏡檢查禁忌癥患者行肺泡灌洗；本研究有28例患者Xpert檢測利福平耐藥基因型結(jié)果與表型結(jié)果不一致，原因尚不明確，下一步需要通過基因檢測等方法進(jìn)一步證明。

綜上所述，Xpert檢測雖能快速檢測MTB及其利福平耐藥性，但存在痰液培養(yǎng)假陰性及其利福平耐藥表型假陽性的可能，建議于患者抗結(jié)核藥物治療前送檢痰液標(biāo)本，并多次送檢，以提高準(zhǔn)確率。應(yīng)關(guān)注痰液分枝桿菌培養(yǎng)及其表型藥物敏感性試驗結(jié)果，提高肺結(jié)核的治療效果，減少耐藥。