液體活檢標(biāo)志物在非小細(xì)胞肺癌中的臨床應(yīng)用和挑戰(zhàn)

周韻斕 沈立松

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092）

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，2020年我國新增肺癌患者約82萬例，新發(fā)和死亡人數(shù)均居我國惡性腫瘤之首，且仍然呈上升趨勢[2]。臨床上常用的傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物在肺癌的篩查、診斷和個(gè)體化治療、監(jiān)測等方面有較多不足。影像學(xué)檢查和穿刺或手術(shù)病理學(xué)檢查也不能滿足腫瘤動(dòng)態(tài)監(jiān)測的需求。伴隨精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)運(yùn)而生的液體活檢技術(shù)，基于患者血液、痰液和胸腔積液等各種體液樣本獲得反映肺癌腫瘤組織特征的生物標(biāo)志物，樣本易于獲取，且可反復(fù)、多次取樣，真正實(shí)現(xiàn)了“實(shí)時(shí)活檢”。近年來，隨著檢驗(yàn)和分析技術(shù)的發(fā)展，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）、非編碼RNA等標(biāo)志物的液體活檢不僅能揭示肺癌基因全貌，還可以監(jiān)測肺癌基因的動(dòng)態(tài)變化[1]。本文擬探討液體活檢在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的臨床應(yīng)用及其前景和挑戰(zhàn)，以期為后續(xù)的臨床研究提供參考。

1 肺癌的早期篩查和診斷

低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描（low dose computed tomography，LDCT）用于肺癌早期篩查靈敏度高，但鑒別惡性結(jié)節(jié)時(shí)存在假陽性和過度診斷的問題。液體活檢作為影像學(xué)檢查的補(bǔ)充，其作用已得到廣泛的認(rèn)可。

CTC是從原發(fā)腫瘤灶脫落進(jìn)入體液的腫瘤細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在慢性阻塞性肺疾病患者中檢出CTC，可以早于LDCT發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)人群中的早期肺癌患者[3]。目前，CTC的臨床應(yīng)用已從最初的簡單計(jì)數(shù)，發(fā)展為鑒定分析腫瘤特征性CTC分子表達(dá)譜。但鑒于CTC的稀有性，現(xiàn)有CTC富集和分選方法的靈敏度不足，尤其在早期肺癌患者中存在檢出率低的問題。與傳統(tǒng)的抗原抗體依賴的檢測方法相比，葉酸受體靶向的CTC分選技術(shù)，利用肺癌細(xì)胞高表達(dá)葉酸受體的特點(diǎn)，結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，可提高早期肺癌CTC的檢出率[4]。

ctDNA是壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的DNA[5]。檢測其片段化可以輔助肺癌的篩查，早期攔截的片段化DNA評估（DNA evaluation of fragments for early interception，DELFI）與LDCT聯(lián)合可顯著提高肺癌篩查的效能[6-7]。ctDNA甲基化在腫瘤發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，異常的基因啟動(dòng)子甲基化在癌前即可檢出病變，揭示特定腫瘤原發(fā)灶來源，是癌癥早期診斷的理想標(biāo)志物。血漿SHOX2和RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可作為早期肺癌輔助診斷的生物標(biāo)志物，基于肺泡灌洗液樣本聯(lián)合檢測這2個(gè)基因的甲基化水平，對肺癌的總體診斷效率優(yōu)于血漿樣本[8]。多癌種早期檢測（multi-cancer early detection，MCED）研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA甲基化診斷肺癌的特異性達(dá)到99%[9-10]。此外，對ctDNA的多個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行靶向DNA甲基化測序，結(jié)合計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)，構(gòu)建肺結(jié)節(jié)良性、惡性鑒別診斷模型，對于早期肺癌具有較好的診斷效果[11]。

EV是活細(xì)胞以旁分泌的形式釋放到微環(huán)境中的膜性小囊泡，包含各類蛋白質(zhì)、核酸、脂類和細(xì)胞代謝物。EV中的非編碼RNA，包括miRNA和環(huán)狀RNA均被證實(shí)有助于NSCLC的早期診斷，并且有助于鑒別腺癌和鱗癌[12]。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，miRNA的組合比單個(gè)miRNA的診斷效能更高，血漿微小RNA特征分類器（microRNA signature classifier，MSC）和微小RNA測試（miR-Test）等都是多個(gè)miRNA組合的代表[13-14]。

對于早期NSCLC而言，液體活檢的診斷效能仍然有限，其原因是在低全身腫瘤負(fù)荷、單病灶受累、無胸外轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的情況下，檢出的CTC、ctDNA或非編碼RNA含量較低，過度依賴高靈敏度的檢測方法。LDCT和液體活檢分別從肺結(jié)節(jié)生長的形態(tài)和分子層面提供宏觀和微觀的信息，兩者用于早期篩查相輔相成。液體活檢可作為LDCT的聯(lián)合或下游檢測，如將其置于上游，仍需謹(jǐn)慎。

2 肺癌靶向治療藥物篩選和耐藥監(jiān)測

在致癌基因驅(qū)動(dòng)的NSCLC中，準(zhǔn)確的分子分型是精準(zhǔn)治療的前提。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是NSCLC的主要突變基因，突變率為46%[15]。與NSCLC相關(guān)的EGFR基因突變主要集中在酪氨酸激酶區(qū)域的18～21號(hào)外顯子上，有大型臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，基于EGFR基因的靶向治療在EGFR敏感突變陽性的晚期NSCLC患者中療效優(yōu)于化療，可改善其生存和預(yù)后[15]。所有NSCLC患者均應(yīng)檢測EGFR基因，以篩選是否能受益于酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的治療。目前，我國已常規(guī)開展EGFR基因突變的檢測。雖然長期以來突變的檢測以組織病理學(xué)活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)，但其受限于活檢組織的可用性和可及性，且難以避免腫瘤異質(zhì)性的問題[16]。

血漿ctDNA是對NSCLC患者進(jìn)行基因分型的有效工具，與組織病理學(xué)分析結(jié)果互補(bǔ)，用于篩選靶向藥敏感突變陽性的患者，指導(dǎo)獲得性耐藥患者更換靶向藥物，評估靶向治療的效果。臨床研究支持將ctDNA分析擴(kuò)展到指南推薦的其他可靶向的致癌驅(qū)動(dòng)基因變異，包括ALK、ROS1、RET、MET外顯子-14跳躍突變、BRAF、KRAS、HER2、NTRK、MET擴(kuò)增[17]。對于初治患者，當(dāng)沒有可用于腫瘤基因檢測的組織時(shí)，可采用“血漿優(yōu)先”的方法，如果血漿ctDNA不能提供基因分型的信息，再重復(fù)組織活檢；當(dāng)組織量不足或不確定是否足夠進(jìn)行基因檢測時(shí)，同時(shí)采用組織和ctDNA“互補(bǔ)檢測”；當(dāng)組織量足夠基因檢測時(shí)，可先行組織檢測[18-19]。對于經(jīng)治患者，液體活檢具有樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間短，無創(chuàng)，且可反復(fù)取樣，克服腫瘤異質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)，可作為評估NSCLC患者靶向治療療效和耐藥監(jiān)測的首選方法[18-19]。有50%的獲得性耐藥患者可出現(xiàn)EGFRT790M突變，可通過動(dòng)態(tài)檢測其血漿EGFRT790M突變進(jìn)行耐藥監(jiān)測，及時(shí)更換不同代的TKI[20]。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑（checkpoint immunotherapy，CPI）治療顯著改善了非致癌基因驅(qū)動(dòng)的NSCLC患者預(yù)后。血液腫瘤突變負(fù)荷（blood tumor mutational burden，bTMB），即每百萬堿基中檢測出的體細(xì)胞基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失錯(cuò)誤的總數(shù)，被證實(shí)是與CPI療效相關(guān)的新興生物標(biāo)志物[21]。有較高bTMB的NSCLC患者采用CPI單劑治療后，無進(jìn)展生存期更長[22]。需要注意的是，目前bTMB臨床研究選用的臨界值取決于不同的商品化試劑，其檢驗(yàn)結(jié)果在不同腫瘤種類和檢測平臺(tái)之間的差異較大；對于進(jìn)行化療的患者，bTMB療效評估的依據(jù)尚不足。另一個(gè)標(biāo)志物是CPI治療開始后ctDNA水平的定量和動(dòng)態(tài)變化，但適應(yīng)癥尚不明確，有待更多前瞻性臨床試驗(yàn)結(jié)果加以確認(rèn)。此外，CTC上的程序性死亡受體-配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）的表達(dá)可用于篩選適合進(jìn)行CPI治療的患者，并進(jìn)行療效監(jiān)測，分選后的CTC也可以鑒定EGFR、KRAS、ALK、ROS1、c-MET等多種突變[23]，但這都需以高靈敏的CTC富集和分離方法作為前提。

3 監(jiān)測肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和微小殘留病灶

在實(shí)體腫瘤中，微小/可測量殘留病灶（minimal/measurable residual disease，MRD）是經(jīng)過治療后，殘留在患者體內(nèi)的少量對治療無反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，提示惡性腫瘤的持續(xù)存在和臨床復(fù)發(fā)進(jìn)展的可能性[24]。傳統(tǒng)影像學(xué)或?qū)嶒?yàn)室檢查無法發(fā)現(xiàn)MRD，可通過連續(xù)取樣和實(shí)時(shí)活檢，采用液體活檢（如ctDNA和CTC）方法檢測到腫瘤來源的分子異常，進(jìn)而檢出MRD。因此，MRD也被稱為分子殘留病灶。

治療后連續(xù)監(jiān)測ctDNA可以在影像學(xué)進(jìn)展之前就檢測到腫瘤的復(fù)發(fā)[25]。TRACERx研究根據(jù)變異等位基因頻率來檢測血漿中的腫瘤亞克隆，在治療過程中，監(jiān)測ctDNA能夠發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的新亞克隆[26]。這些新的亞克隆來源于自然病程中腫瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)化，以及化療藥物對腫瘤細(xì)胞的克隆篩選。有研究結(jié)果顯示，手術(shù)后和新輔助治療后ctDNA檢測陰性可較其他指標(biāo)更好地預(yù)測患者預(yù)后[27]。

基于ctDNA的MRD檢測主要分為兩大技術(shù)路線，分別為腫瘤先驗(yàn)的分析和腫瘤未知的分析，目前均處在探索階段[28]。前者先對原發(fā)腫瘤進(jìn)行測序以鑒定患者的特異基因組變異，然后針對腫瘤特異性的克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行個(gè)體化ctDNA檢測，判定MRD的陰性/陽性，敏感性和準(zhǔn)確性高，但檢測成本也較高，且耗時(shí)長；后者采用固定的基因包組合，通過一組預(yù)先選定的ctDNA引物，檢測與腫瘤相關(guān)的已知基因組變異和表觀遺傳學(xué)改變特征，檢測成本較低，周期短，但敏感性略低[29]。

CTC也可作為治療后MRD檢測的指標(biāo)，是晚期NSCLC無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[30]。CTC中驅(qū)動(dòng)基因的突變與ctDNA檢測互補(bǔ)，可以提高M(jìn)RD檢測的敏感性和特異性。

MRD檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值是毋庸置疑的，但目前相關(guān)臨床研究仍處于證據(jù)累積階段，不同研究關(guān)于MRD檢測試劑平臺(tái)、測序深度和陽性判定的閾值定義差異較大，研究結(jié)果難以完全互通。目前，推薦檢測方法必須可穩(wěn)定檢測出豐度≥0.02%的ctDNA[31]。檢測結(jié)果需要排除克隆性造血的干擾。另外，在NSCLC根治性治療后，何時(shí)開始監(jiān)測MRD和監(jiān)測頻率尚未達(dá)成共識(shí)，臨床也應(yīng)關(guān)注。

4 液體活檢的檢測技術(shù)

ctDNA片段化明顯，半衰期短，占cfDNA的比例不到1%，且在早期腫瘤和治療起效后ctDNA比例大幅下降，因此對檢測技術(shù)的靈敏度要求較高。ctDNA突變檢測技術(shù)主要分為兩大類[32-33]。第1類基于PCR技術(shù)，如超級擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（super amplification refractory mutation system，super-ARMS）、基于小珠/乳濁液/擴(kuò)增/磁性技術(shù)（bead，emulsion，amplification and magnetic，BEAMing）、數(shù)字PCR，都已廣泛應(yīng)用于ctDNA的檢測，多重?cái)?shù)字PCR可實(shí)現(xiàn)靶向基因突變多位點(diǎn)同時(shí)檢測。第2類基于下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），如全基因組測序、癌癥個(gè)體化深度測序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPPSeq）。近年來，Lung-CLiP算法等機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域的發(fā)展提高了NGS分析的靈敏度和精準(zhǔn)度[34]。

基于PCR的技術(shù)適用于對已知特定位點(diǎn)進(jìn)行檢測，數(shù)字PCR可以實(shí)現(xiàn)cfDNA突變的絕對定量，分析靈敏度好，但NGS平臺(tái)的檢測范圍更廣泛，在未知突變及多靶點(diǎn)突變的檢測性能上具有獨(dú)到之處。NGS技術(shù)通過增加測序深度、采用UMI分子標(biāo)簽和糾錯(cuò)算法，可顯著提高檢測的靈敏度。鑒于晚期NSCLC需要評估的癌基因靶點(diǎn)眾多，采用經(jīng)臨床驗(yàn)證的NGS平臺(tái)檢測血漿ctDNA，效能優(yōu)于基于PCR的單基因分析方法。在臨床實(shí)踐中，還需綜合考慮是否得到我國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的成熟的商品化試劑盒和檢測成本問題，采用實(shí)驗(yàn)室自建方法，應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行。

隨著年齡的增長，NSCLC患者克隆性造血也會(huì)增加，外周血樣本中檢測到的基因變異可能是造血干細(xì)胞隨機(jī)獲得的突變，而并非腫瘤驅(qū)動(dòng)基因來源的ctDNA變異[35]。區(qū)分ctDNA衍生突變和克隆性造血相關(guān)突變，可以對有核白細(xì)胞進(jìn)行平行深度測序，但會(huì)顯著增加檢測成本。

CTC的分離和鑒定依賴于特殊的設(shè)備和方法，目前主要的方法包括微流控芯片分選、納米磁珠分選、基于抗體的免疫熒光檢測、熒光原位雜交技術(shù)、PCR、測序和細(xì)胞培養(yǎng)后的基因分析[31]。但這些方法尚無法從根本上改善CTC檢出率低的問題，尤其在腫瘤早期，CTC的檢出率極低。CTC計(jì)數(shù)的參考區(qū)間因分離鑒定方式的不同而不同，且不同方法之間差異較大。由于腫瘤存在異質(zhì)性，檢出的單個(gè)CTC不能代表腫瘤的全面狀態(tài)。這些問題使CTC的臨床應(yīng)用仍具有一定的局限性。

分選得到的CTC通常僅有十余個(gè)，其下游腫瘤細(xì)胞分子特征的分析需要單細(xì)胞測序來完成，通過全基因組或全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增極少量的DNA或RNA，以滿足測序所需的檢測極限。目前，多數(shù)采用基于退火和循環(huán)的多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycle，MALBAC）一般均是結(jié)合全基因組測序來進(jìn)行，但尚不能達(dá)到常規(guī)臨床應(yīng)用所需的敏感性和特異性。

5 特殊類型樣本的檢測

除血液外的其他類型體液，如胸腔積液、痰液、唾液，還有肺泡灌洗液，均也可以作為肺癌液體活檢的樣本。中晚期NSCLC惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）中富含腫瘤細(xì)胞，且樣本易于采集，上清液中總cfDNA含量顯著高于血漿。有研究結(jié)果顯示，肺癌伴MPE患者的胸腔積液樣本中檢測到的EGFR突變豐度高于外周血樣本，而且不存在克隆造血的干擾，檢測結(jié)果與組織樣本的一致性達(dá)87.1%[36]。MPE中分離的EV來源的DNA和miRNA含量更高，可用于NSCLC的輔助診斷和鱗癌與腺癌的鑒別[37]。胸腔積液樣本的檢測結(jié)果可以用于NSCLC分子分型、腫瘤耐藥突變分析、精準(zhǔn)靶向治療、預(yù)后評估。然而，在血液以外的其他類型體液樣本中，患者個(gè)體間的差異更大，臨床診斷臨界值的設(shè)置和驗(yàn)證更具挑戰(zhàn)性。

6 總結(jié)

液體活檢技術(shù)具有便捷、無創(chuàng)、可重復(fù)等優(yōu)勢，在NSCLC的篩查和早期診斷、分子分型和靶向藥物篩選、耐藥監(jiān)測、疾病進(jìn)展與轉(zhuǎn)移監(jiān)測、預(yù)后評估等諸多方面都具有獨(dú)特的優(yōu)勢和廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。未來機(jī)器學(xué)習(xí)模型將綜合液體活檢的多組學(xué)檢測，有望進(jìn)一步提高診斷效能。

目前，液體活檢的臨床應(yīng)用推廣都存在著相似的困境：檢測技術(shù)仍需不斷改進(jìn)，以提高敏感性和特異性；檢測方法學(xué)差異大，參考區(qū)間的臨界值取決于各基因包組合和檢測平臺(tái)，較難統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)，檢測成本也是需要考慮的問題。相于液體活檢的大量基礎(chǔ)研究，臨床實(shí)際轉(zhuǎn)化應(yīng)用尚顯不足。

基于液體活檢報(bào)告的復(fù)雜性，需要專門的多學(xué)科分子腫瘤專家組提供具有臨床價(jià)值的結(jié)果解讀，協(xié)助臨床作出治療決策。