肺炎支原體RNA檢測用于肺炎患兒疾病診斷和療效監(jiān)測

王慧英 湯 昱 董利利 王 靜

（鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院東區(qū)呼吸科，河南 鄭州 450000）

肺炎支原體（Mycoplasmapneumoniae，MP）是主要依靠飛沫傳播的兒童下呼吸道感染常見病原體，同時也是兒童原發(fā)性非典型肺炎（primary atypical pneumonia，PAP）和社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的常見病原體。門診患兒中，MP感染率為20%～40%，住院CAP患兒MP感染率為10%～20%；MP傳播無季節(jié)性，所致肺炎在人群密集地發(fā)病率較高，傳播相對較快；此外，家庭成員之間易發(fā)生相互傳染[1]。

近年來，我國MP感染在小兒呼吸道感染中的發(fā)生率逐年升高，每3～5年出現(xiàn)1次大流行[2]。MP引起兒童呼吸道感染后，會對患兒肺功能造成不同程度的損傷，且早期缺乏特異性臨床癥狀和體征，胸部影像學檢查圖像缺乏特異性，因此明確MP感染高度依賴病原學檢查。病原學檢查方法主要為培養(yǎng)法、核酸檢測和血清學檢測[4-5]。核酸檢測可分為DNA檢測和RNA檢測，DNA轉(zhuǎn)陰較慢，即使患兒癥狀已經(jīng)消失，DNA依然可為陽性，故診斷兒童MP肺炎的假陽性率較高；此外，在治療效果監(jiān)測上有延遲性，可能導致過度治療。有學者指出，與MPDNA相比，MP-RNA診斷效能更高，可為合理用藥提供指導[6-7]。本研究分析167例疑似MP感染的肺炎患兒資料，探討MP-RNA的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年5月—2021年1月鄭州大學附屬兒童醫(yī)院167例肺炎住院患兒，其中男89例、女78例，年齡9個月～12歲[（4.12±0.54）歲]；病程2～22 d[（5.17±0.23）d]；住院天數(shù)6～29 d[（13.54±1.54）d]。<1歲、1～3歲、4～7歲和≥8歲患兒分別為20、68、54和25例。根據(jù)MPRNA轉(zhuǎn)陰時間，將MP-RNA陽性患兒分為1周、2周、3周和4周組。MP肺炎診斷標準：1）MP培養(yǎng)陽性；2）符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）》[8]和《諸福棠實用兒科學》[9]中的診斷標準，即除CAP外，滿足雙份血清抗體滴度成4倍及以上和入院24 h內(nèi)單次血清抗體滴度≥1∶160任意1項。納入標準：1）臨床確診肺炎；2）臨床資料完整，行MP培養(yǎng)確定為MP肺炎；3）行MP-DNA和MP-RNA檢測；4）法定監(jiān)護人簽署知情同意書。排除標準：1）免疫功能低下；2）患肺結(jié)核；3）使用糖皮質(zhì)激素；4）使用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物；5）對阿奇霉素過敏；6）先天免疫缺陷。本研究獲鄭州大學附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準（2023-K-139）。

1.2 方法

1.2.1 MP-DNA檢測

采集患兒清晨痰樣本2～4 mL至無菌杯內(nèi)，-20 ℃保存待檢，不可反復凍融。檢測前充分解凍樣本，輕輕振蕩使其充分混勻，反復吹打并吸取1 mL樣本至1.5 mL離心管內(nèi)，離心后，去上清液，取沉淀，將5 μL核酸提取液（美國安倍公司）加入沉淀物中，振蕩15 s混勻，100 ℃干浴10 min，離心后，取上清液。

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，RCP）檢測MP-DNA，檢測儀器為ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），試劑購自中山大學達安基因股份有限公司。PCR條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，10個循環(huán)；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30個循環(huán)。嚴格按說明書要求進行操作和結(jié)果判讀。

1.2.2 MP-RNA檢測

采集患兒清晨痰樣本2～4 mL至含RNA保存液的專用樣本管內(nèi)。采用MagX全自動核酸提取儀（上海仁度生物科技有限公司）提取MPRNA。七項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒（雙擴增法）購自武漢中幟生物科技股份有限公司，檢測儀器為Cobas z480熒光定量PCR儀（美國Roche公司）。嚴格按照儀器和試劑說明書要求進行操作和結(jié)果判讀。

1.2.3 MP-IgG抗體和MP-IgM抗體檢測

收集患兒清晨痰樣本2～4 mL，采用深圳亞輝龍公司YHLO iFlash 3000化學發(fā)光免疫分析儀和配套試劑（MP-IgG抗體試劑批號為20161201，MP-IgM抗體試劑批號為20161201）檢測MP-IgG抗體、MP-IgM抗體。

1.2.4 治療

所有患兒每日給予阿奇霉素治療（10 mg/kg），第1療程根據(jù)康復情況靜脈滴注5～7 d，每日1次。第2、3、4個療程根據(jù)病情口服或靜脈給予阿奇霉素（批號H10960112，美國輝瑞制藥有限公司），間隔4 d。

1.3 觀察指標

1）觀察167例患兒MP-RNA、MP-DNA、MP-IgM抗體、MP-IgG抗體陽性率；比較MPRNA、MP-IgM抗體、MP-IgG抗體診斷兒童MP肺炎的效能；2）觀察MP-RNA、MP-DNA在治療1、2、3和4周時的轉(zhuǎn)陰情況和陽性率，分析陽性率與治療時間的關(guān)系；3）比較MP-RNA、MP-DNA轉(zhuǎn)陰前后患兒相關(guān)臨床癥狀發(fā)生率；比較MP-RNA不同轉(zhuǎn)陰時間患兒相關(guān)臨床癥狀持續(xù)時間和入院血清C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、白細胞介素8（interleukin-8，IL-8））、白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)差異。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以±s表示，2個組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數(shù)資料用例或率表示，比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關(guān)分析評估MP-RNA、MP-DNA陽性率與治療時間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MP-RNA、MP-DNA、MP-IgG抗體、MPIgM抗體檢測結(jié)果和診斷效能

167例患兒中，臨床確診MP肺炎95例。MPRNA、MP-DNA、MP-IgM抗體、MP-IgG抗體陽性分別為84、78、68、60例。MP-RNA特異性和敏感性均最高。見表1。

表1 MP-RNA、MP-DNA、MP-IgG抗體和MP-IgM抗體檢測結(jié)果和診斷效能

2.2 MP-RNA、MP-DNA轉(zhuǎn)陰率與治療時間的關(guān)系

167例患兒中，MP-RNA陽性90例，陽性率與治療時間呈負相關(guān)（r=-0.901，P=0.017）；MP-DNA陽性109例，陽性率與治療時間呈負相關(guān)（r=-0.601，P=0.031）。治療2、3、4周MP-RNA陽性率均低于MP-DNA（P<0.000 1）。見表2。

表2 MP-RNA、MP-DNA轉(zhuǎn)陰率與治療時間的關(guān)系

2.3 MP-RNA、MR-DNA轉(zhuǎn)陰后患兒臨床癥狀發(fā)生率比較

與MP-DNA比較，MP-RNA轉(zhuǎn)陰后，患兒咳嗽發(fā)生率更高（P<0.000 1）。見表3。

表3 MP-RNA、MR-DNA轉(zhuǎn)陰后患兒臨床癥狀發(fā)生率比較

2.4 MP-RNA不同轉(zhuǎn)陰時間患兒臨床癥狀持續(xù)時間和入院炎癥指標比較

MP-RNA不同轉(zhuǎn)陰時間患兒發(fā)熱、咳嗽、喘息、肺啰音持續(xù)時間和入院血清CRP、IL-8、WBC計數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.000 1）。見表4。

表4 MP-RNA不同轉(zhuǎn)陰時間患兒臨床癥狀持續(xù)時間和入院炎癥指標比較

3 討論

MP肺炎屬于兒童輕微自限性疾病，但進展后可形成嚴重并發(fā)癥，包括肺后遺癥、心肌炎、肝炎、腦炎、腎炎。臨床多用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物治療，通過干擾MP蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑菌作用。但目前全球大環(huán)內(nèi)酯類耐藥MP逐漸流行，我國MP耐藥率已經(jīng)達66%～100%，傳統(tǒng)方法學難以滿足MP治療監(jiān)測需求，實時熒光定量PCR等分子生物學方法成為MP感染核酸定量分析的主要方法[10-11]。

本研究患兒以<8歲為主（85.0%），與劉金榮等[10]<8歲MP感染患兒占88.7%的報道一致。學齡前兒童是MP感染的主要人群，這與該年齡段兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠成熟、免疫能力相對較低，在感染MP后更容易出現(xiàn)呼吸道感染有關(guān)。本研究不同年齡患兒MP-DNA、MP-IgM抗體、MP-IgG抗體、MP-RNA陽性率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。相較于≤3歲的患兒，≥4歲的患兒4項指標陽性率較高，考慮與其主要在學校、幼兒園等人員密集場所活動，容易發(fā)生交叉感染有關(guān)。

培養(yǎng)法是診斷MP感染的金標準，但培養(yǎng)周期長，操作復雜。MP-RNA、MP-DNA、MPIgG抗體或MP-IgM抗體水平能反映MP在患兒體內(nèi)感染情況，結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他指標可以對患兒病情作出評估，從而有針對性地及時調(diào)整用藥方案，達到預期療效[12-13]。MP-IgG抗體和MP-IgM抗體是近年來報道較多的診斷MP感染的參考指標，本研究中，MP-IgG抗體的敏感性和特異性最低，假陽性的原因可能是既往感染MP，MP-IgG抗體體內(nèi)留存時間較長所致；MP-IgM抗體是MP感染早期指標，但持續(xù)時間較短，可能導致假陰性[14-15]。與MP-IgG抗體和MPIgM抗體比較，MP-RNA和MP-DNA臨床診斷價值更高，但在PCR擴增DNA片段時，操作不規(guī)范會導致污染，可能出現(xiàn)假陽性。

實時熒光核酸恒溫擴增作為一種新型核酸檢測技術(shù)，以活體RNA為靶目標，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶等進行恒溫擴增，檢測活的病原菌RNA，特異性更強，目前在腸道病毒、結(jié)核分枝桿菌等檢測中效果較好[16]。本研究中，MP-RNA作為特異性和敏感性最好的指標，陽性率隨治療時間顯著下降，且較MPDNA更顯著，在一些臨床癥狀尚未消失時，MPRNA已經(jīng)出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)陰，而MR-DNA在許多癥狀已經(jīng)消失后依然未能轉(zhuǎn)陰。提示MP-RNA在監(jiān)測病情和治療效果上更敏感。其機制可能為RNA只存在于病原菌活體中，MP細胞死亡后，細胞中RNA也快速降解，而DNA降解周期較RNA長。本研究進一步觀察了MP-RNA不同轉(zhuǎn)陰時間患兒臨床癥狀持續(xù)情況，發(fā)現(xiàn)更早轉(zhuǎn)陰的患兒發(fā)熱等癥狀持續(xù)時間更短（P<0.000 1），入院血清CRP、IL-8和WBC計數(shù)更低（P<0.000 1）。CRP、IL-8、WBC與炎癥反應有關(guān)，水平越高提示病情越嚴重，同時也是療效監(jiān)測的重要指標。本研究這一結(jié)果進一步說明MP-RNA能輔助療效監(jiān)測。余楚烈等[17]對比了MP-RNA和MPDNA診斷兒童MP感染的效能，發(fā)現(xiàn)前者特異性為91.89%，敏感性為88.43%；張新星等[18]發(fā)現(xiàn)，MP-RNA診斷效能優(yōu)于MP-IgM、MP-IgG，在滿足MP-RNA檢測條件時，MP-RNA可提高診斷準確性；均與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，MP-RNA、MP-DNA對兒童MP肺炎有一定的診斷價值。MP-DNA適用于診斷兒童MP肺炎，而MP-RNA更適用于兒童MP肺炎的療效監(jiān)測。