miR-374靶向下調(diào)TRIM35表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲

王 蓉 邢連翔 黃克亮 李 欣

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院檢驗科，上海 200011；2.上海市臨床檢驗中心，上海 200016）

世界癌癥研究基金會的統(tǒng)計結(jié)果顯示，乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，全球每年有超過45萬例與乳腺癌相關(guān)的死亡病例[1]。盡管臨床目前已廣泛采用根治性手術(shù)和輔助化療對乳腺癌進(jìn)行治療，但遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是乳腺癌預(yù)后不良的主要原因[3]。因此，了解乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的病理機制，并確定具體靶點，有助于準(zhǔn)確診斷乳腺癌，并提供有效的治療策略。

微小RNA（microRNA，miRNA）參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，作為腫瘤抑制因子或癌基因發(fā)揮作用，miRNA的異常表達(dá)已在許多不同類型的惡性腫瘤中得到證實，且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[3]。有研究結(jié)果表明，乳腺癌組織中miR-374表達(dá)顯著升高，可作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物[4]。miR-374是否通過介導(dǎo)靶基因發(fā)揮作用尚不清楚。三基序蛋白35（tripartite motifcontaining protein 35，TRIM35；又稱MAIR或Hls5）是包含三聯(lián)基序的單蛋白E3連接酶家族成員，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性[5]。此外，TRIM35已被確認(rèn)為一種腫瘤抑制因子，可抑制各種惡性腫瘤（如肝細(xì)胞肝癌）細(xì)胞的增殖、克隆形成和致瘤性[6]。目前，關(guān)于miR-374功能的潛在機制尚不明確，本研究團(tuán)隊前期通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-374可能的靶點為TRIM37，但miR-374是否通過靶向TRIM35發(fā)揮作用尚不清楚。本研究擬通過檢測乳腺癌組織中miR-374和TRIM35的表達(dá)，并探討miR-374對MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲的影響，分析miR-374與TRIM35之間的關(guān)系，及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1月—2021年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院確診的乳腺癌患者42例，年齡45～66歲。所有患者均符合中國抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會發(fā)布的《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021年版）》[7]，術(shù)前未接受抗腫瘤治療，無其他惡性腫瘤病史。收集術(shù)中切除的乳腺癌組織和距腫瘤切緣2 cm以上的癌旁組織（經(jīng)病理檢查確認(rèn)）。收集所有患者的臨床資料。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院倫理委員會批準(zhǔn)（2019-001號），所有患者均自愿參加本研究并簽署書面知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫）置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%青霉素-鏈霉素（美國Sigma-Aldrich公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。于細(xì)胞匯合度為80%～90%時傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

將MCF-7細(xì)胞根據(jù)不同處理方法分為3組：對照組（未作任何處理）、干擾組（加入100 nmol/L miR-374抑制劑10 μL，與細(xì)胞共孵育48 h）和空載體組（加入100 nmol/L隨機序列10 μL，與細(xì)胞共孵育48 h）。miR-374抑制劑和隨機序列均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 細(xì)胞增殖試驗

將各組細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTT試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測定細(xì)胞的增殖情況，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。簡要步驟：將10 μL MTT試劑（5 mg/mL）添加到每個孔中，37 ℃溫育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，在振動器上震動10 min，然后采用DNM-9602酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）測量490 nm處的吸光度（A）值。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測 miR-374和TRIM35表達(dá)

采用TRIzol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）從各組細(xì)胞或癌組織、癌旁組織中提取總RNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。將RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶[天根生化科技（北京）有限公司]逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix ExTaq試劑盒（日本TaKaRa公司）在ABI 7300實時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。miR-374和TRIM35引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，36個循環(huán)；74 ℃延長3 min。TRIM35的內(nèi)參為GAPDH，miR-374的內(nèi)參為U6。采用2-ΔΔCt計算miR-374和TRIM35的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 雙熒光素酶報告基因測定

通過Targetscan7.2在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/vert_72/）確認(rèn)TRIM35的3'-非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），包含預(yù)測的miR-374特異性結(jié)合位點，采用PCR從基因組DNA中擴(kuò)增TRIM35的3'-UTR基因片段。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)。正向引物序列為5'-CATCGCCAAGCACAATCAGG-3'，反向引物序列為5'-GCGTTTTCGGCTCTTGTGTT-3'。將擴(kuò)增出的基因片段插入到pMIR-REPORT熒光素酶報告載體中，獲得野生型熒光素酶報告基因質(zhì)粒p-TRIM35-wt，將其與pGL3-對照質(zhì)粒的螢火蟲熒光素酶基因融合，限制性內(nèi)切酶為KpnⅠ和XhoⅠ。使用快速定點突變試劑盒（美國New England Biolabs公司）將2個位點突變（3'-UTR-965A/G和3'-UTR-969T/C）引入WT-TRIM35-3'-UTR，構(gòu)建突變體（MUT）TRIM35-3'-UTR。將TRIM35報告基因質(zhì)粒野生型（p-TRIM35-wt）或突變型（p-TRIM35-mut）分別與miR-374共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系HEK-293T（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），miR-NC采用隨機序列作為miRNA陰性對照。細(xì)胞在含10% FBS（以色列Biological Industries公司）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）（美國ThermoFisher Scientific公司）中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，采用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（美國Promega公司）測定熒光素酶活性。

1.6 Transwell試驗檢測miR-374抑制劑對乳腺癌侵襲性的抑制作用

試驗前48 h將MCF-7細(xì)胞接種到10 cm培養(yǎng)皿中，每個端口2×105個細(xì)胞。試驗前16 h更換無血清培養(yǎng)基。將Matrigel添加到Transwell小室（美國Corning公司）的上室。將3.5×104個細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞小室中，在Transwell小室的下室中加入0.8 mL含10%血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用75%乙醇固定，1.2%結(jié)晶紫染色。在ECLIPSE Ci光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）（×100）下隨機選取3個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估m(xù)iR-374與TRIM35的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和癌旁組織miR-374、TRIM35相對表達(dá)量比較和兩者之間的相關(guān)性

癌組織miR-374相對表達(dá)量（7.21±1.14）顯著高于癌旁組織（3.83±0.81）（P<0.001），TRIM35相對表達(dá)量（9.23±1.26）顯著低于癌旁組織（9.98±0.92）（P<0.001）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-374與TRIM35呈負(fù)相關(guān)（r=-0.114，P<0.01）。見圖1。

圖1 癌組織和癌旁組織miR-374、TRIM35相對表達(dá)量比較和兩者之間的相關(guān)性

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者miR-374相對表達(dá)量比較

不同腫瘤大小和有無淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者之間miR-374相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡和TNM分期的乳腺癌患者之間miR-374相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者miR-374相對表達(dá)量比較

2.3 干擾組、對照組和空載體組miR-374相對表達(dá)量比較

干擾組miR-374相對表達(dá)量為0.41±0.05，顯著低于對照組（0.82±0.04）和空載體組（0.81±0.07）（P<0.001）。見圖2。

圖2 干擾組、對照組和空載體組miR-374相對表達(dá)量比較

2.4 miR-374干擾對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

干擾組培養(yǎng)48、72 h后的MCF-7細(xì)胞增殖率顯著低于空載體組或?qū)φ战M（P<0.001）。見圖3。

圖3 miR-374干擾對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.5 miRNA干擾對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于空載體組和對照組（P<0.001）。見圖4。

圖4 miR-374干擾對MCF-7細(xì)胞侵襲性的影響（×100）

2.6 miR-374干擾對TRIM35表達(dá)的影響

干擾組TRIM35相對表達(dá)量為1.58±0.21，顯著高于空載體組（1.14±0.06）和對照組（1.06±0.03）（P<0.001）。見圖5。

圖5 miR-374干擾對TRIM35相對表達(dá)量的影響

2.7 miR-374對TRIM35轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響

熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，HEK-293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-374和p-TRIM35-wt時，熒光素酶活性被顯著抑制（P<0.001）；共轉(zhuǎn)染miR-374和p-TRIM35-mut時，熒光素酶活性未被抑制（P>0.05）。見圖6。

圖6 miR-374對TRIM35轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響

3 討論

乳腺癌是全球癌癥死亡的第五大原因[8]。盡管隨著手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌患者的死亡率有所下降，但全身治療預(yù)防轉(zhuǎn)移的效果較差[9]，腫瘤轉(zhuǎn)移仍是大多數(shù)乳腺癌患者死亡的根本原因[10]。

miRNA是小的單鏈非編碼RNA（18～22個核苷酸），通過識別特定靶mRNA導(dǎo)致其靶向降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)[4，11]，在診斷和治療中表現(xiàn)出顯著的潛力[12-13]。ZHANG等[14]的研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p表達(dá)上調(diào)，可作為乳腺癌診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。miR-374家族成員（包括miR-374a、miR-374b和miR-374c）作為lncRNA FTX的剪接片段，位于人類染色體 Xq13.2的X失活中心[15]。HE等[16]的研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中miR-374表達(dá)降低，可作為前列腺癌無生化復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)測因子。RAHIMI等[17]的研究結(jié)果顯示，慢性淋巴細(xì)胞白血病患者miRNA-32、miRNA-98和miR-374異常表達(dá)。GAO等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-374通過靶向GATA3抑制SEMA3B表達(dá)，可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織miR-374相對表達(dá)量顯著升高，抑制miR-374表達(dá)可導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的增殖率顯著降低，提示miR-374可能具有致癌基因的作用。

TRIM蛋白家族是E3泛素連接酶RING結(jié)構(gòu)域家族的成員，由1個RING指結(jié)構(gòu)域、2個B-box結(jié)構(gòu)域和1個C-末端結(jié)構(gòu)域組成，充當(dāng)E3泛素連接酶，參與細(xì)胞的各種生理過程[19]。TRIM35是TRIM家族的一員，在腫瘤的惡性進(jìn)展中具有重要作用[20]。TRIM35低表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的惡性增殖[21]，而增加TRIM35的表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[22]。有研究結(jié)果顯示，TRIM35表達(dá)升高可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、克隆形成和致瘤性，提示TRIM35具有抗腫瘤能力[23]。TRIM35可通過增加丙酮酸脫氫酶激酶1的泛素化使蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱Akt）信號失活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。WU等[24]的研究結(jié)果顯示，TRIM35通過泛素化調(diào)節(jié)丙酮酸激酶M1/2蛋白四聚體和二聚體的轉(zhuǎn)變，并通過調(diào)節(jié) Warburg效應(yīng)，影響乳腺癌的惡性生物學(xué)行為。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，TRIM35是miR-374的潛在直接靶標(biāo)，miR-374或可直接負(fù)向調(diào)節(jié)TRIM35 mRNA的表達(dá)。為了證實這一假設(shè)，本研究采用miR-374抑制劑轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，結(jié)果顯示，抑制miR-374可誘導(dǎo)TRIM35表達(dá)增強，表明miR-374可反向調(diào)節(jié)TRIM35表達(dá)；雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果證實miR-374可與TRIM35的3'-UTR直接結(jié)合。由此可見，miR-374可通過靶向TRIM35來增強乳腺癌細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力。

綜上所述，miR-374可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并通過直接結(jié)合其mRNA轉(zhuǎn)錄本負(fù)調(diào)控TRIM35的表達(dá)，提示miR-374可能在乳腺癌的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。