不同懸液滴加劑量在人類染色體制備中的應(yīng)用

楊麗霞,陳 坤,張 帆,李淑云,齊山芹

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖科,山東濟(jì)南 250001;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250014

染色體常規(guī)G顯帶檢測作為細(xì)胞遺傳學(xué)的經(jīng)典檢測技術(shù),是染色體病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),在產(chǎn)前診斷、輔助生殖等領(lǐng)域也具有重要的作用[1-2]。在染色體制備過程中滴片環(huán)節(jié)是其中重要的步驟之一,制作出高質(zhì)量的標(biāo)本玻片是保障染色體核型診斷準(zhǔn)確的前提和必要條件。本研究使用染色體分散儀制片,在相對固定的溫度及濕度環(huán)境設(shè)定下,采用4種不同劑量細(xì)胞懸液滴加制片,通過制片后自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)采集有效細(xì)胞圖占比、分裂相展開面積、染色體帶紋辨析度等指標(biāo)評(píng)價(jià),以期探討制片環(huán)節(jié)中適宜的細(xì)胞懸液滴加劑量,制作出更加有利于核型分析的標(biāo)本玻片,提高分析效率及診斷準(zhǔn)確性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集 在2021年9-10月山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(以下簡稱本院)10個(gè)不同批次的外周血染色體檢測標(biāo)本中隨機(jī)選取標(biāo)本各1份,共計(jì)選取10份標(biāo)本為研究對象,在正式發(fā)放檢測報(bào)告后剩余的細(xì)胞懸液標(biāo)本用于本研究。

1.2儀器與試劑 主要儀器:染色體分散儀(美國IDEX)、染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)(德國蔡司)、移液槍、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、醫(yī)用冰柜、鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水溫箱等;主要試劑:離心管式T型淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州拜迪)、秋水仙素、胰蛋白酶、吉姆薩染色液、低滲液、甲醇、冰乙酸等,均為國產(chǎn)試劑;玻片:病理級(jí)顯微鏡載玻片(10127107P-G,江蘇世泰)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞懸液制備 采用常規(guī)方法接種及收獲外周血細(xì)胞標(biāo)本:采集外周血標(biāo)本3 mL于肝素抗凝管中,5 mL注射器7號(hào)針頭垂直接種26～28滴于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中,傾斜放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68～72 h,1 mL注射器5號(hào)針頭垂直加入秋水仙素(20 μg/mL)2滴,繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h,再經(jīng)過離心、低滲、預(yù)固定、3次固定后制成細(xì)胞懸液,放置于-18 ℃醫(yī)用冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2滴片 染色體分散儀預(yù)設(shè)參數(shù):溫度為27 ℃,相對濕度為55%,玻片編號(hào)后平置于染色體分散儀內(nèi)鏤空架上,細(xì)胞懸液自低溫冰柜中取出后立即滴片。采用移液槍吸取懸液滴加,每份標(biāo)本調(diào)整4種不同劑量各滴加2張玻片,每張玻片分別在兩端近中心點(diǎn)1/2處各滴加懸液2滴,分別制作10、20、30、40 μL 4組各20張標(biāo)本玻片,共計(jì)制片80張。滴片后靜置15 min,玻片裝入銅質(zhì)染色架放置75 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烤片3 h。

1.3.3常規(guī)G顯帶 參照文獻(xiàn)[3]及《全國染色體病診斷與產(chǎn)前診斷培訓(xùn)班——細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作手冊》[4],進(jìn)行常規(guī)G顯帶操作。

1.3.4掃描分析 采用染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)采集細(xì)胞圖,設(shè)置每張玻片高倍鏡掃描70個(gè)細(xì)胞圖,用于眾數(shù)分析及核型診斷。

1.4評(píng)價(jià)指標(biāo) (1)有效細(xì)胞圖占比,染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)所采集的細(xì)胞圖圖像清晰、細(xì)胞相對完整、可用于分析診斷的細(xì)胞圖作為有效細(xì)胞圖,并計(jì)算有效細(xì)胞圖占比。(2)分裂相展開面積(R值),4組劑量分別選取20個(gè)有效細(xì)胞圖,計(jì)算其R值:R=πab/4AB[5]。(3)染色體帶紋辨析度評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN2016》所示染色體核型示意圖,質(zhì)評(píng)條帶及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[6-7],制訂以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):320～<400條帶計(jì)1分;400～<550條帶計(jì)2分;550條帶計(jì)3分;>550條帶計(jì)4分。

2 結(jié) 果

2.14組有效細(xì)胞圖占比比較 染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)采集有效細(xì)胞圖占比隨著滴加劑量增大而降低:10 μL組、20 μL組、30 μL組采集有效細(xì)胞圖占比均大于40 μL組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10 μL組與40 μL組比較χ2=17.106,P<0.001;20 μL組與40 μL組比較χ2=11.683,P=0.001;30 μL組與40 μL組比較χ2=13.378,P<0.001)。10 μL組、20 μL組、30 μL組采集有效細(xì)胞圖占比比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組有效細(xì)胞圖占比比較

2.24組R值比較 10 μL組、20 μL組、30 μL組、40 μL組R值分別為0.16±0.03、0.21±0.04、0.25±0.07、0.28±0.08,4組R值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.059,P<0.001)。10 μL組與20 μL、30 μL、40 μL組R值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);20 μL組與40 μL組R值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);20 μL組與30 μL組R值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);30 μL組與40 μL組R值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著懸液滴加劑量增加,R值隨之增加,但是達(dá)到一定閾值后,展開面積過大,將影響掃描系統(tǒng)采集到完整的細(xì)胞圖。見圖1。

注:A為10 μL組;B為20 μL組;C為30 μL組;D為40 μL組。

2.3染色體帶紋辨析度比較 10 μL組、20 μL組、30 μL組、40 μL組染色體帶紋質(zhì)量評(píng)分分別為(1.60±0.60)、(2.25±0.72)、(2.45±0.83)、(2.65±0.81)分,隨滴加劑量增大而逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.493,P<0.001)。40 μL組染色體帶紋質(zhì)量評(píng)分與30 μL組、20 μL組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);20 μL組染色體帶紋質(zhì)量評(píng)分與30 μL組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10 μL組染色體帶紋質(zhì)量評(píng)分低于其他3組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注:A為10 μL組;B為20 μL組;C為30 μL組;D為40 μL組。

3 討 論

近年來,遺傳學(xué)檢測在優(yōu)生優(yōu)育及產(chǎn)前診斷、染色體疾病診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,染色體核型分析目前仍然是遺傳學(xué)診斷重要的檢測方法之一[8]。外周血染色體檢測技術(shù)在1960年由MOORHEAD等建立,是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。如何制備出高質(zhì)量的染色體標(biāo)本,提高分析效率及核型診斷的準(zhǔn)確性,以便給予臨床診斷及治療更加精準(zhǔn)的參考指標(biāo),是各個(gè)細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室不斷追求的目標(biāo)。染色體制備步驟繁瑣,影響因素較多,制備過程中的實(shí)驗(yàn)室條件控制,尤其是制片環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)化及可重復(fù)性條件的建立是研究的重點(diǎn)之一[9-10]。SPURBECK等[11]首次提出了染色體分散動(dòng)力學(xué)理論,為解決染色體分散問題提供了理論基礎(chǔ)。依據(jù)染色體分散動(dòng)力學(xué)原理設(shè)計(jì)的染色體分散儀在染色體制備中的應(yīng)用,為實(shí)驗(yàn)室制片環(huán)節(jié)的條件控制提供了可能性。在滴片時(shí)可設(shè)定相對穩(wěn)定的溫度及相對濕度等參數(shù),從而保證染色體制備的重復(fù)性和一致性。盡管如此,不同的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置參數(shù)也略有差異[9,12-13],溫度波動(dòng)范圍為25～30 ℃,相對濕度波動(dòng)范圍為50%～55%。本研究采用染色體分散儀滴片時(shí)設(shè)定溫度為27 ℃,相對濕度為55%。但是即使對染色體分散儀進(jìn)行相對穩(wěn)定的參數(shù)設(shè)置,不同實(shí)驗(yàn)人員制片及不同批次制片效果仍有差異。因此,制片環(huán)節(jié)中只對滴片環(huán)境溫度及濕度的控制尚不足以保證穩(wěn)定的制片效果,如何進(jìn)一步完善制片環(huán)節(jié)中的條件設(shè)定,以保證制片效果的穩(wěn)定性是急需解決的問題。

染色體制備環(huán)節(jié)中滴加懸液劑量對制片效果影響的研究較少提及,本實(shí)驗(yàn)室在染色體制備的各個(gè)環(huán)節(jié),如標(biāo)本接種、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞收獲、顯帶等保持常規(guī)操作的前提下,制作本研究所用標(biāo)本玻片,在滴片環(huán)節(jié)采用同一臺(tái)染色體分散儀、在同一時(shí)間、由同一名實(shí)驗(yàn)室人員制片,分別采用10、20、30、40 μL 4種不同的懸液劑量,在相同滴片環(huán)境中制作4組染色體玻片,通過比較4組標(biāo)本玻片中染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)所采集有效細(xì)胞圖占比、R值、染色體帶紋辨析度等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)在相同或者相近的溫度、濕度條件下滴片時(shí),細(xì)胞懸液滴加劑量不同,染色體制片效果不同:低劑量懸液滴片有效細(xì)胞圖占比高于高劑量懸液滴片;隨著劑量逐漸增加,R值隨之增加,染色體帶紋辨析度也隨之增高,但是劑量增加到一定程度時(shí),因過度分散,易造成掃描系統(tǒng)采集細(xì)胞不完整,使有效細(xì)胞圖數(shù)量減少,從而影響分析效率及診斷準(zhǔn)確性。

有研究者認(rèn)為,中期染色體分散質(zhì)量主要取決于載玻片上固定液的揮發(fā)過程,通過溫度及濕度的協(xié)同作用,以保證最佳的分散效果[14]。本研究中滴片環(huán)節(jié)是在染色體分散儀中進(jìn)行,設(shè)置了相對穩(wěn)定的溫度及濕度條件,4組不同懸液劑量制片均由一名實(shí)驗(yàn)室人員在同一時(shí)間內(nèi)完成,出現(xiàn)分散效果的不同,考慮是由于劑量效應(yīng)使玻片表面固定液的揮發(fā)速度產(chǎn)生差異:滴加劑量小的玻片表面固定液在同等溫度及濕度條件下,干燥時(shí)間相對較短,分散過程也相應(yīng)縮短,R值較小,染色體伸展不充分;而滴加劑量大的玻片表面固定液在同等溫度及濕度條件下則干燥時(shí)間相對較長,染色體分散過程相應(yīng)延長,展開面積也增大,染色體伸展充分。因此,增加懸液滴加劑量在同等溫度及濕度設(shè)定條件下可提高染色體的分散程度及帶紋辨析度。但是劑量增加到一定程度,細(xì)胞過于分散可造成掃描系統(tǒng)采集完整的細(xì)胞圖數(shù)量減少,反而不利于核型分析。本研究中,在染色體分散儀設(shè)定溫度為27 ℃,相對濕度為55%的條件下,20 μL組、30 μL組制片效果優(yōu)于10 μL組、40 μL組,能夠在保證足量的有效細(xì)胞圖被采集的前提下,獲得適度分散及高質(zhì)量帶紋辨析度的中期染色體,以滿足核型分析的需要。

本研究通過評(píng)價(jià)不同懸液滴加劑量在染色體分散儀制片中的效果,旨在探索染色體制片環(huán)節(jié)中重復(fù)性好、一致性程度高的條件設(shè)定,在以后的實(shí)驗(yàn)室推廣中結(jié)合自動(dòng)化設(shè)備的引進(jìn)[15],不斷完善染色體制備標(biāo)準(zhǔn)化流程,獲得高質(zhì)量的中期染色體核型,提高分析效率及核型診斷準(zhǔn)確性,為臨床診斷及治療提供更加科學(xué)的參考指標(biāo),以利于精準(zhǔn)醫(yī)療的深入開展。