河南草莓褐色葉斑病病原菌的鑒定及防治藥劑篩選

袁洪波 王卓妮 覃艮紅 史冰柯 王 麗 侯 琿 鞏文峰 涂洪濤*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009；2 西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000）

草莓褐色葉斑病是一種世界性的真菌病害，在波蘭、巴西、比利時(shí)、美國、伊朗和韓國等地均有報(bào)道。該病由病原菌Pilidiumconcavum或Pilidium lythri引 起（Go??bniak & Jarosz，2004；Lopes et al.，2010；Debode et al.，2011；Fernández-Ortu?o et al.，2014；Karimi et al.，2016；Park et al.，2017），可以為害草莓葉片、果實(shí)等組織，造成葉片壞死和果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國于2012 年在北京地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)草莓褐色葉斑?。℅eng et al.，2012），近年來在貴州地區(qū)也有該病發(fā)生的報(bào)道（熊仕俊 等，2020）。2020—2021 年，筆者對(duì)河南鄭州、新鄉(xiāng)、三門峽等地區(qū)草莓病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，草莓褐色葉斑病的發(fā)病面積呈擴(kuò)大趨勢(shì)，給果農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

P.concavum的寄主范圍較廣，除為害草莓外，還可在牡丹（Paeoniasuffruticosa）、厚葉巖白菜（Bergeniacrassifolia）、草甸水蘭（Hieracium caespitosum）、橄欖（Oleaeuropaea）、虎杖（Fallopia japonica）和歐洲李（Prunusdomestica）上寄生引起植物病害（Duan et al，2010；Bruckart et al，2013；Sayari et al，2013）。目前，已有的研究報(bào)道主要集中在病原菌形態(tài)特征、生物學(xué)特性及細(xì)胞壁降解酶等方面（段亞冰 等，2010；張桂軍 等，2018），而該病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定及對(duì)草莓褐色葉斑病的防治研究報(bào)道較少，國內(nèi)尚無該病害農(nóng)藥登記。因此，為了防止草莓褐色葉斑病的大面積流行和暴發(fā)，亟需對(duì)河南草莓褐色葉斑病病原菌進(jìn)行鑒定，并在此基礎(chǔ)上篩選高效防治藥劑用于生產(chǎn)實(shí)踐。

筆者從河南鄭州草莓產(chǎn)區(qū)采集到草莓褐色葉斑病樣品，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法，明確草莓褐色葉斑病病原菌種類，并進(jìn)行了致病性測(cè)定；同時(shí)，評(píng)價(jià)了該病原菌對(duì)6 種殺菌劑的敏感性，以期為草莓褐色葉斑病的田間防治提供候選殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草莓品種為香野。2021 年12 月9 日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所草莓實(shí)驗(yàn)基地采集發(fā)病植株葉片，用于病原菌的分離。

1.2 病原菌分離與純化

利用組織分離法分離草莓葉片病原菌（王麗等，2020）。具體步驟：從葉片病健交界處切下5 mm × 5 mm 組織，于75%的乙醇中消毒1 min，再用1%次氯酸鈉消毒3 min，經(jīng)無菌水清洗5 次后置于含氨芐青霉素（100 mg · L-1）的PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g · L-1，葡萄糖20 g · L-1，瓊脂粉15 g · L-1）上。

待組織塊周圍長出菌絲，用挑針挑取菌落邊緣菌絲或菌塊，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢純化得到單一菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌鑒定

形態(tài)特征觀察：將病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察病原菌在培養(yǎng)基上的菌落形狀、顏色等，并利用顯微鏡觀察菌絲、孢子形態(tài)等特征，初步確定真菌種屬（魏景超，1979）。

分子生物學(xué)鑒定：使用CTAB 法提取病原菌基因組DNA（M?ller et al.，1992）， 利用ITS 和微管蛋白Tubulin基因通用引物分別擴(kuò)增。ITS 擴(kuò) 增 引 物（White et al.，1990）：ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3＇） 和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）。Tubulin擴(kuò)增引物（Lousie & Donaldson，1995）：Bt2a（5＇-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3＇） 和Bt2b（5＇-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3＇）。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收，送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，得到與其序列同源性較高的相關(guān)模式菌株的序列，采用MEGA 7 軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 致病性離體回接鑒定

選取健康、長勢(shì)一致的離體草莓葉片，經(jīng)無菌水清洗干凈后，用75%乙醇擦拭消毒，再用無菌水清洗，晾干。用直徑為5 mm 的打孔器從生長7 d 的菌落邊緣打取菌塊，用無菌牙簽挑取菌塊，帶菌絲的一面貼于葉片上，以接種空白PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照。接種后，用無菌水浸泡的脫脂棉纏繞葉柄保濕，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中12 h/12 h（光照/黑暗）培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，將發(fā)病葉片進(jìn)行再次分離培養(yǎng)鑒定，檢驗(yàn)是否為鑒定菌株。

1.5 室內(nèi)殺菌劑抑菌效果評(píng)價(jià)

采用生長速率法（王麗 等，2020）測(cè)定6 種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長的抑制作用（表1）。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)置不同質(zhì)量濃度，其中450 g · L-1咪鮮胺水乳劑、435 g · L-1戊唑醇靈懸浮劑、500 g ·L-1多菌靈懸浮劑、40%百菌清懸浮劑和50%啶酰菌胺水分散粒劑的有效成分終質(zhì)量濃度為1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg · L-1，30%吡唑醚菌酯懸浮劑的有效成分終質(zhì)量濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg · L-1。用直徑為5 mm 的打孔器從生長7 d 的菌落邊緣打取菌塊，將一塊菌落接種到含不同質(zhì)量濃度藥劑的PDA 培養(yǎng)基中央，以常規(guī)PDA 培養(yǎng)基作為對(duì)照，于25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d 后測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理、每次接種3 個(gè)平皿，試驗(yàn)共2 次獨(dú)立重復(fù)。菌絲生長抑制率 = 〔（對(duì)照菌落直徑-處理菌落生直徑）/對(duì)照菌落直徑〕×100%。利用DPS 軟件，以各藥劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的菌絲生長抑制率概率值作回歸分析，計(jì)算各藥劑的抑制中濃度EC50、相關(guān)系數(shù)r以及EC5095%置信區(qū)間。

表1 供試殺菌劑

對(duì)篩選的目標(biāo)藥劑進(jìn)行草莓褐色葉斑病的離體葉片室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，將目標(biāo)藥劑均勻噴施于草莓離體葉片上，待藥液自然風(fēng)干后再接種病原菌，病原菌接種方法參照1.4 的回接方法，無菌水處理作為對(duì)照；接種病原菌7 d 后，采用十字交叉法測(cè)量病斑大小，調(diào)查葉片發(fā)病情況，計(jì)算其防效，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

葉片發(fā)病率 = （發(fā)病點(diǎn)數(shù)/調(diào)查總點(diǎn)數(shù)）×100%

防治效果 = 〔（空白對(duì)照病斑直徑-藥劑處理病斑直徑）/空白對(duì)照病斑直徑〕× 100%

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制圖表，運(yùn)用SPSS 26 計(jì)算顯著性差異，運(yùn)用DPS7.05 進(jìn)行EC50等計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓褐色葉斑病田間病癥

在河南鄭州、三門峽、新鄉(xiāng)等草莓種植基地，草莓褐色葉斑病發(fā)生普遍。發(fā)病初期，草莓葉片出現(xiàn)淺褐色壞死斑（圖1-A），隨著病情的加重，葉片病斑變?yōu)樯詈稚?、干枯，?yán)重時(shí)脫落（圖1-B）。

圖1 草莓褐色葉斑病病癥

2.2 草莓褐色葉斑病病原菌形態(tài)學(xué)特征

采用組織分離法從發(fā)病植株上共分離獲得4 株真菌，編號(hào)分別為CMY2-1、CMY2-4、CMY2-5和CMY2-7，經(jīng)純化后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。4 株真菌菌落形態(tài)相似，菌落生長緩慢，產(chǎn)孢少，菌絲致密、淺褐色至白色，菌落邊緣整齊、呈白色，可見同心紋，無滲出液（圖2-A、B、C、D）；培養(yǎng)基背面呈黃褐色，邊緣淺黃色（圖2-E、F、G、H）。菌絲無色，有隔膜（圖2-I）。分生孢子無色、呈腎性（圖2-J）。根據(jù)形態(tài)學(xué)初步將該病原菌鑒定為P.concavum。

圖2 菌株菌落、菌絲及孢子形態(tài)特征

2.3 草莓褐色葉斑病病原菌分子鑒定

利用通用引物ITS1/ITS4 對(duì)4 個(gè)菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得ITS 片段，測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)這4 個(gè)菌株的ITS 序列完全一致，利用微管蛋白基因Tubulin通用引物Bt2a/Bt2b 對(duì)病原菌進(jìn)行了擴(kuò)增，4 個(gè)條帶在同一大小區(qū)間內(nèi)（圖3）。表明這4 個(gè)菌株為同一個(gè)病原菌。選取菌株CMY2-4 ITS 序列（登錄號(hào)為ON965254）與NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示菌株CMY2-4 與P.concavum（登錄號(hào)為KF646103.1、JX045795.1）和P.lythri（登錄號(hào)為MT555770.1）序列一致性為100%?；贗TS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，菌株CMY2-4與P.concavum、P.lythri和Discohainesiaoenotherae位于同一個(gè)分支（圖4-A）。進(jìn)一步利用微管蛋白基因Tubulin通用引物Bt2a/Bt2b 對(duì)菌株CMY2-4進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，BLAST 比對(duì)分析結(jié)果表明，菌株CMY2-4（ON989665）與P.concavum序列相似性最高為100%（圖4-B）。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定，將該病原菌初步鑒定為P.concavum。

圖3 4 株菌株DNA 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 基于ITS 和Tubulin 序列分別構(gòu)建草莓褐色葉斑病原菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌致病性鑒定

利用離體草莓葉片接種所分離的4 株菌株，接種5 d 后，葉片接種部位出現(xiàn)褐色，并逐漸向外擴(kuò)增。接種7 d 后，接種葉片出現(xiàn)明顯的褐色壞死斑，而對(duì)照葉片顏色正常，無任何發(fā)病癥狀（圖5）。對(duì)發(fā)病葉片的病原菌進(jìn)行了重新分離和分子鑒定，證實(shí)了包括菌株CMY2-4 在內(nèi)的4 個(gè)菌株為草莓褐色葉斑病病原菌。

圖5 接種7 d 后草莓葉片發(fā)病癥狀

2.5 室內(nèi)殺菌劑的篩選

平皿測(cè)定結(jié)果顯示，6 種供試殺菌劑中450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對(duì)病原菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)到100.0%，EC50值為2.449 7 mg · L-1，其次是435 g · L-1戊唑醇懸浮劑，抑制率為67.8%，EC50值為9.499 7 mg · L-1。另外4 種殺菌劑對(duì)草莓褐色葉斑病原菌的抑制能力較弱，抑菌率在15.6%～47.6%，EC50值在46.963 3～743.872 2 之間（表2）。

表2 6 種殺菌劑對(duì)草莓褐色葉斑病病原菌的抑制作用

為了進(jìn)一步檢測(cè)藥劑450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對(duì)草莓褐色葉斑病的防治效果，用終質(zhì)量濃度為0.75 g · L-1的450 g · L-1咪鮮胺水乳劑處理草莓離體葉片，再接種菌株CMY2-4。接種7 d 后調(diào)查發(fā)現(xiàn)（圖6、表3），對(duì)照處理的葉片均表現(xiàn)出褐色病斑，發(fā)病率為100.0%；而450 g · L-1咪鮮胺水乳劑處理后的葉片無發(fā)病癥狀或有輕微發(fā)病癥狀，發(fā)病率為33.3%，平均病斑直徑僅為0.96 mm，顯著低于對(duì)照處理；450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對(duì)草莓褐色葉斑病的防效達(dá)到83%。表明450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對(duì)草莓褐色葉斑病具有較好的防治效果。

圖6 450 g · L-1 咪鮮胺水乳劑對(duì)草莓褐色葉斑病病原菌的防治效果

表3 450 g · L-1 咪鮮胺水乳劑對(duì)草莓褐色葉斑病的防治效果

3 結(jié)論與討論

草莓褐色葉斑病是一種重要的真菌病害，在世界范圍內(nèi)流行。目前，草莓褐色葉斑病只在我國北京和貴州地區(qū)報(bào)道過，其中北京分離的菌株鑒定為P.concavum，而貴州分離的病原菌鑒定為P.lythri（熊仕俊 等，2020；Geng et al.，2012）。P.concavum和Hainesialythri是草莓褐色葉斑病病原菌的共無性型，其有性型為D.oenotherae（Palm，et al.，1991；趙新蘭 等，2010；Rossman et al.，2014）。2014 年，Johnston 等（2014）建議用名稱P.lythri替代P.concavum，但部分學(xué)者仍沿用了名稱P.concavum（Karimi et al.，2016；Park et al.，2017）。本試驗(yàn)中，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察以及ITS 序列和微管蛋白基因Tubulin比對(duì)結(jié)果，初步將河南草莓褐色葉斑病病原菌鑒定為P.concavum。致病性回接鑒定結(jié)果顯示，草莓葉片接種病原菌5 d 出現(xiàn)褐色病斑，與田間發(fā)病表型類似。

草莓褐色葉斑病主要危害草莓葉片，在葉片上形成褐色圓形輪紋，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可侵染果實(shí)，導(dǎo)致草莓產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重降低（熊仕俊 等，2020）。因此，篩選高效的防治藥劑對(duì)于防治該病害的發(fā)生尤為重要（王卓妮 等，2023）。然而關(guān)于該病害的研究主要集中在病原菌的分離、鑒定、形態(tài)特征觀察等方面（段亞冰 等，2010；張桂軍等，2018），而病害防治相關(guān)的研究較少，缺少有效的防治藥劑。耿文龍等（2021）分析了5 種殺菌劑對(duì)P.concavum菌株CMYK-1 菌落生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)百菌清和農(nóng)抗120 的抑制效果最好，但并未進(jìn)一步分析這2 種殺菌劑對(duì)草莓褐色葉斑病的防治效果。本試驗(yàn)分析了6 種殺菌劑對(duì)P.concavum菌株CMY2-4 菌落生長抑制效果。結(jié)果顯示，450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對(duì)菌株CMY2-4的抑制效果最強(qiáng)。進(jìn)一步防效試驗(yàn)結(jié)果顯示，450 g · L-1咪鮮胺水乳劑能有效防治由P.concavum菌株CMY2-4 引起的草莓褐色葉斑病，該結(jié)果將為草莓褐色葉斑病田間防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。