番茄短節(jié)間基因BRACHYTIC（BR）的精細(xì)定位及其候選基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)

楊沛 寧宇 魏凱 劉曉林 楊孟霞 李珊珊 王孝宣 國艷梅 劉磊 李鑫 杜永臣 李君明 黃澤軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

株高是理想株型的重要指標(biāo)之一。20 世紀(jì)60 年代的“綠色革命”正是源于水稻和小麥矮稈及半矮稈品種的育成和大面積推廣（Sakamoto &Matsuoka，2004；Salas et al.，2009）。番茄（Solanum lycopersicum）是中國乃至世界上最重要的蔬菜作物之一，按照用途可以分為加工番茄和鮮食番茄兩大類。加工番茄目前已經(jīng)基本實現(xiàn)機械化栽培和采收。隨著用工費用增加、勞動力日漸匱乏，種植者也越來越傾向于選擇能夠?qū)崿F(xiàn)輕簡化栽培的鮮食番茄品種（楊斌，2022）。因此，培育株型緊湊、適合輕簡化栽培的番茄新品種已成為趨勢。

番茄株高主要決定于主莖的節(jié)間數(shù)量和節(jié)間長度?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了多個與番茄株高相關(guān)的突變體，如：影響節(jié)間數(shù)量的突變體有self-pruning（sp）（MacArthur，1932）、semideterminate（sdt）（Elkind et al.，1991）和suppressorofsp（ssp）（Park et al.，2014）。其中SP基因是CETS 基因家族成員之一（McGarry & Ayre，2012），編碼1 個開花抑制因子。sp突變體中的SP-interactingG-BOX（SPGB）基因突變會造成ssp表型。影響節(jié)間長度的突變體有brachytic（br）（MacArthur，1931）、dwarf（d）（Bishop et al.，1996）、ElongatedInternode（EI）（Sun et al.，2019）、gibberellindeficient-1（gib-1）、gib-2、gib-3（Koornneef et al.，1990）、procera（pro）（Jupe et al.，1988）、shortinternode（si）（Kwon et al.，2020）和tomatointernodeelongated-1（tie-1）（Schrager-Lavelle et al.，2019）等。其中D基因編碼1 個參與油菜素內(nèi)酯合成的P450 蛋白（Bishop et al.，1996；Bishop et al.，1999；Marti et al.，2006）。短節(jié)間ShortInternode（SI）基因與擬南芥ERECTA（ER）基因同源，編碼一個受體激酶（Kwon et al.，2020）。而EI、tie-1和pro等突變體的節(jié)間伸長、植株變高，與正常植株噴施外源赤霉素后的表型類似。EI與tie-1這兩個突變體是由于SlGA2ox7基因的功能缺失導(dǎo)致活性赤霉素轉(zhuǎn)化為非活性赤霉素的過程受阻、活性赤霉素積累的結(jié)果（Schrager-Lavelle et al.，2019；Sun et al.，2019）。而PRO基因則編碼1 個赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子SlDELLA 蛋白（Bassel et al.，2008）。還有多位研究者挖掘到了多個控制番茄株高的遺傳位點并克隆了幾個主效基因（Zhou et al.，2016；Sun et al.，2019；Liu et al.，2020）。

番茄br突變體已發(fā)現(xiàn)多年，將br位點轉(zhuǎn)育到株高正常的番茄中可以降低株高（MacArthur，1931；Barton et al.，1955；Balint-Kurti et al.，1995）。經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明番茄短節(jié)間br位點位于1 號染色體（MacArthur，1931；Balint-Kurti et al.，1995）。Lee 和Hutton（2018）將br位點定位到分子標(biāo)記brM4 和brM7 之間約763 kb 的區(qū)段內(nèi)。根據(jù)番茄基因組基因注釋ITAG3.2 版本，該區(qū)段編碼55 個基因。本試驗將br位點定位到14.9 kb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間編碼2 個基因，其中1 個基因的大部分序列缺失，根據(jù)該序列差異開發(fā)了1 個共顯性PCR 分子標(biāo)記BRD，試驗結(jié)果將有助于番茄株型分子改良。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及表型調(diào)查

番茄參考基因組測序材料加工番茄Heinz1706和櫻桃番茄VFNT Cherry（syn.LA1221，含br突變位點）的種子來自加利福尼亞州戴維斯番茄遺傳資源中心（Tomato Genetics Resource Center，Davis，CA，USA）。由Heinz1706 和VFNT Cherry 構(gòu)建的F2群體（152 株）于2017 年春季定植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市順義區(qū)楊鎮(zhèn)試驗基地大棚內(nèi)，后代鑒定群體也定植于該基地大棚內(nèi)。

植株采用單干整枝方式，每株保留5～6 穗果。當(dāng)番茄第4 穗果實成熟后，使用卷尺測量地面至第4 穗果的高度作為株高；測量第1 穗果下面第1 片葉著生節(jié)位到第4 穗果下面第1 片葉著生節(jié)位之間的長度，除以之間的節(jié)位數(shù)量，即為節(jié)間長度。

1.2 序列差異分析與分子標(biāo)記開發(fā)

VFNT Cherry 的重測序深度為30×（魏凱 等，2020）。利用BWA 軟件（Li，2013）將測序得到的Clean Data 與參考基因組Heinz1706 進(jìn)行比對，使用Samtools（Li et al.，2009）進(jìn)行排序和索引，使用GATK（McKenna et al.，2010）對基因組進(jìn)行變異分析。根據(jù)兩親本的序列差異，選取適當(dāng)?shù)腎nDel（Insertion/Deletion）和SNP，利用LaserGene（https：//www.dnastar.com）設(shè)計引物，開發(fā)了InDel 和CAPS 標(biāo)記。利用上述標(biāo)記進(jìn)行基因型分析。主要分子標(biāo)記信息見表1。分子標(biāo)記PCR 擴增、酶切和電泳檢測等方法參照魏凱等（2020）。分子標(biāo)記的擴增體系為10 μL：DNA 模板1 μL（100 ng · μL-1）、正向及反向引物各0.2 μL（10 μmol ·L-1）、2×Taqmaster Mix 5 μL（MF002-01，北京聚合美生物科技有限公司）、雙蒸水3.6 μL。PCR 擴增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。InDel 標(biāo)記使用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，CAPS 標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物先酶切然后再使用3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。15 μL酶切體系：PCR 產(chǎn)物10 μL、內(nèi)切酶0.2 μL（10 000 U · mL-1，New England Biolabs，MA，USA）、10×緩沖液1.5 μL、雙蒸水3.3 μL，在最適反應(yīng)溫度下酶切2 h。

表1 試驗所用分子標(biāo)記的信息

1.3 BR 基因的精細(xì)定位

挑選F2群體中94 株無限生長型的植株進(jìn)行表型調(diào)查和基因型分析，確定與株高連鎖的分子標(biāo)記并篩選交換單株。交換單株后代鑒定按下列方法進(jìn)行：每株交換單株的自交種子播種于3 個32 孔穴盤中，常規(guī)日照及水肥管理。在幼苗期，取植株幼嫩葉片于96孔取樣盒中，用CTAB法提取DNA后，用位于雜合區(qū)段的1～3 個分子標(biāo)記進(jìn)行基因型分析。分別選擇基因型為1（與Heinz1706 基因型相同）的植株12 株，基因型為3（與VFNT Cherry基因型相同）的植株12 株，定植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市順義區(qū)楊鎮(zhèn)試驗基地大棚內(nèi)。同時，從這些幼苗中挑選交換單株和雜合植株（如果沒篩選到交換植株則使用雜合植株代替）定植，自交擴繁種子，用于后續(xù)的交換單株篩選或后代鑒定。第4 穗果實成熟后，調(diào)查后代鑒定群體植株的株高和節(jié)間長度。采用Student’st-test 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.4 FPF1 蛋白多重序列比對與進(jìn)化樹分析

擬 南 芥AtFPF1（Y11988） 和AtFLP1（AL353995）、 白芥SaFPF1（Y11987）、 煙草NtFPF1（AY496934）、玉米ZmFPF1（ACG44143）、水 稻OsRAA1（AY659938） 和OsFPFL4（AK120187）、棉花GhFPF1（AHI62966）等FPF1蛋白序列從NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫下載。以擬南芥AtFPF1 蛋白序列為查詢序列，采用BLASTP（e-value ＜ 1 e-10）檢索番茄全基因組蛋白序列（ITAG 4.0 版本），獲得番茄FPF1 蛋白同源序列。利用ClustalX2 進(jìn)行蛋白多序列比對，利用MEGA6 軟件采用鄰接法（NJ，Neighbor-joining）構(gòu)建FPF1 蛋白的進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

以VFNT Cherry（含br突變位點，無限生長型）為輪回親本，Heinz1706（有限生長型）為供體，利用BR基因定位區(qū)間內(nèi)的分子標(biāo)記輔助選擇，回交5 代后自交2 代，構(gòu)建了BR基因近等基因系NIL-WT 和NIL-br，兩者的株高（4 穗果高度）分別為58.6 cm 和45.9 cm，節(jié)間長度分別為4.3 cm和3.7 cm，差異顯著（圖1）。

圖1 近等基因系NIL-WT 和NIL-br 植株

2.2 BR 基因的精細(xì)定位

利用番茄1 號染色體上的分子標(biāo)記對F2群體中的94 株無限生長型植株進(jìn)行基因分析，結(jié)合其表型數(shù)據(jù)，經(jīng)過單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記HP1797 與控制株高性狀br位點連鎖較為緊密。挑選11 株交換位點位于分子標(biāo)記HP1797 兩側(cè)的交換單株，收集自交種子。2018 年春季，對上述11株交換單株進(jìn)行后代鑒定，將br位點定位到分子標(biāo)記HP1737 和HP1797 之間。隨后經(jīng)過2018 年秋季、2019 年春季、2019 年秋季和2020 年春季4 輪的交換單株后代鑒定，最終將br位點定位到分子標(biāo)記HP5589 和ZP273 之間、物理距離約為14.9 kb的區(qū)段內(nèi)（圖2）。

圖2 br 的精細(xì)定位

2.3 候選基因分析

根據(jù)番茄參考基因組基因注釋ITAG 4.0版本，br位點精細(xì)定位區(qū)間編碼2 個基因：Solyc01g066970和Solyc01g066980（圖2）。功能注釋顯示這兩個基因均為開花促進(jìn)因子（Flowering PromotingFactor1，F(xiàn)PF1）的同源基因（表2）。多重序列比對和進(jìn)化樹分析表明，Solyc01g066970和Solyc01g066980與已經(jīng)報道的開花促進(jìn)因子FPF1及其同源基因，擬南芥AtFPF1和AtFLP1、白芥SaFPF1、煙草NtFPF1、棉花GhFPF1、水稻OsRAA1和OsFPFL4、玉米ZmFPF1為同源基因（圖3）。結(jié)合第2 代重測序分析，發(fā)現(xiàn)VFNT Cherry 的Solyc01g066980基因大部分序列缺失（圖4）。PCR產(chǎn)物測序證明VFNT Cherry 中缺失了1 個607 bp的片段，具體物理位置為SL4.0ch01：68064387-68064993（圖5）。故推測Solyc01g066980基因為BR的候選基因。

圖3 FPF1 蛋白多重序列比對（A）及進(jìn)化樹分析（B）

圖4 br 精細(xì)定位區(qū)間的序列多態(tài)性分析

圖5 BR 候選基因Solyc01g066980 的序列變異（A）及分子標(biāo)記BRD PCR 產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果（B）

表2 br 候選基因及其注釋信息

2.4 候選基因特異性分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

基于VFNT Cherry 中Solyc01g066980基因的缺失序列（圖5），設(shè)計了3 條引物（表1，圖5），開發(fā)了1 個共顯性PCR 分子標(biāo)記BRD。PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，含有短節(jié)間（br）純合突變位點的VFNT Cherry 的電泳條帶長度為416 bp，br位點為正常純合（野生型）的Heinz1706 的電泳條帶長度為296 bp。VFNT Cherry和Heinz1706 組配的分離群體中，呈現(xiàn)出3 種基因型，其中雜合單株的PCR 產(chǎn)物同時含有上述2 條條帶（圖5）。番茄遺傳育種課題組以VFNT Cherry為供體、大果型番茄高代育種材料ZS768 為輪回親本，利用BRD 進(jìn)行分子標(biāo)記輔助回交6 次、自交2 次后，得到轉(zhuǎn)育了br位點的高代育種材料ZS768br。與ZS768 相比，ZS768br 株高（4 穗果高度）約降低13%。

3 討論

株高是一個重要的農(nóng)藝性狀，對種植密度、水肥管理、抗倒伏能力、機械化采收等都有影響，因此理想株高成為了重要的育種目標(biāo)（宋蒙飛 等，2022；馬彩娥 等，2023；郭江怡 等，2023）。番茄株高主要由節(jié)間數(shù)量和節(jié)間長度決定。突變體sp、sdt和ssp主要影響節(jié)間數(shù)量（MacArthur，1932；Elkind et al.，1991；Park et al.，2014），突變體br、d、EI、gib-1、gib-2、gib-3、pro、si和tie-1則影響節(jié)間長度（MacArthur，1931；Jupe et al.，1988；Koornneef et al.，1990；Bishop et al.，1996；Sun et al.，2019；Schrager-Lavelle et al.，2019；Kwon et al.，2020）。 且qtph1.1、EI、h4t2a、h4t3a和h4t7a等控制株高的QTL 位點也逐漸被發(fā)現(xiàn)（周慧等，2015；Sun et al.，2019；Liu et al.，2020）。然而，可用于番茄株高改良的分子標(biāo)記報道較少。

番茄br突變體已發(fā)現(xiàn)多年，其可以降低株高，且對單果質(zhì)量沒有影響，已經(jīng)用于番茄育種（MacArthur，1931；Barton et al.，1955；Balint-Kurti et al.，1995）。然而，br是隱性突變體，通過表型進(jìn)行選擇，育種效率較低。本試驗將br位點定位到14.9 kb 的區(qū)間內(nèi)，根據(jù)番茄參考基因組基因注釋ITAG 4.0 版本，該區(qū)間編碼2 個基因：Solyc01g066970和Solyc01g066980。其中含br突變位點的VFNT Cherry 中Solyc01g066980基因大部分序列缺失。Lee 等（2022）對Solyc01g066980進(jìn)行基因編輯后，可以降低番茄株高。因此，可以確定Solyc01g066980為BR的候選基因。

根據(jù)ITAG 4.0 的注釋信息，Solyc01g066980為開花促進(jìn)因子（FloweringPromotingFactor1，F(xiàn)PF1）的同源基因。FPF1基因家族成員參與開花調(diào)控和株高調(diào)控（韓琳和王佳偉，2018）。多重序列比對和進(jìn)化樹分析表明，Solyc01g066980與已經(jīng)報道的開花促進(jìn)因子FPF1及其同源基因，擬南芥AtFPF1和AtFLP1（Kania et al.，1997）、 白芥SaFPF1（Kania et al.，1997）、煙草NtFPF1（Smykal et al.，2004）、棉花GhFPF1（Wang et al.，2014）、水稻OsRAA1和OsFPFL4（Ge et al.，2004；Guo et al.，2020）、 玉 米ZmFPF1（Su et al.，2018）為同源基因。FPF1基因家族成員SaFPF1、AtFPF1、GhFPF1和OsRAA1在擬南芥中過量表達(dá)，均呈現(xiàn)出下胚軸伸長和早開花等表型。掃描電鏡分析表明，AtFPF1在擬南芥中過量表達(dá)可使下胚軸細(xì)胞伸長（Kania et al.，1997）。進(jìn)一步的分析表明，AtFPF1可能通過提高植株對赤霉素的敏感性而促進(jìn)開花（Kania et al.，1997）。與此相似，NtFPF1在煙草中過量表達(dá)也可以促進(jìn)開花并使植株節(jié)間伸長。經(jīng)外源赤霉素處理，NtFPF1過量表達(dá)植株的早開花和節(jié)間伸長表型更加明顯（Smykal et al.，2004）。因此，在擬南芥和煙草中，F(xiàn)PF1基因可能參與赤霉素信號途徑，從而調(diào)節(jié)株高。Lee等（2022）分析br突變體在外源GA 處理下的轉(zhuǎn)錄組，推測番茄FPF1可能在抑制根部GA 的生物合成中起作用，但是具體分子機理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

番茄株型矮化緊湊有利于輕簡化栽培。本試驗將已經(jīng)用于番茄矮化育種的短節(jié)間br位點定位到14.9 kb 的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間編碼2 個基因：Solyc01g066970和Solyc01g066980。其中含br突變位點的VFNT Cherry 中Solyc01g066980基因大部分序列缺失。推測Solyc01g066980為BR的候選基因。同時根據(jù)br位點的Solyc01g066980基因序列變異開發(fā)了1 個共顯性PCR 分子標(biāo)記BRD，該標(biāo)記將有助于番茄株高的分子改良。