辣椒高多態(tài)性KASP標(biāo)記的開發(fā)

張 濤 常立春 郭春貴 張立國 武 劍 梁建麗 高 杰 王曉武*

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，新疆特色園藝作物種質(zhì)資源與高效生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100081；3 贛州農(nóng)業(yè)學(xué)校，江西贛州341000）

遺傳多樣性是生物體之間遺傳物質(zhì)的差異，并且這種差異可以遺傳給后代?；蚪M學(xué)的飛速發(fā)展實(shí)現(xiàn)了在全基因組范圍大規(guī)模鑒定DNA 序列變異（Batley & Edwards，2009），包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失（InDel）以及更大的結(jié)構(gòu)變異（SV）。其中，SNP 數(shù)量最多，分布最廣泛，非常適合用于開發(fā)分子標(biāo)記。分子標(biāo)記在研究生物的進(jìn)化途徑、分析遺傳多樣性、開展基因圖位克隆時(shí)都是必不可少的研究工具，特別是在作物育種中分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）發(fā)揮了巨大的作用，在多基因聚合、目標(biāo)基因快速導(dǎo)入、遠(yuǎn)緣雜交等育種過程中都能顯著提高育種效率。

辣椒（Capsicumspp.）是茄科（Solanaceae）植物的一員（2n= 24），世界范圍內(nèi)辣椒品種繁多（Kim et al.，2014；Pereira-Dias et al.，2019）。中國市場的辣椒品種遺傳背景較窄，對辣椒的育種改良不利（顧曉振，2016）。對中國市場的辣椒品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，將為辣椒遺傳改良提供指導(dǎo)。前人利用分子標(biāo)記開展了辣椒的遺傳多樣性分析。廖芳芳等（2023）利用果實(shí)性狀與STR 標(biāo)記檢測相結(jié)合的方法對30 份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)地理隔離并未對辣椒的遺傳分化產(chǎn)生顯著影響；張曼等（2020）基于20 個SSR 標(biāo)記對112 份朝天椒種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)總體上材料的多樣性與地理來源存在一定關(guān)聯(lián)，但同時(shí)也存在地區(qū)間的互相滲透。

競爭性等位基因特異PCR（Kompetitive Allele Specific PCR）簡稱為KASP 標(biāo)記，具有標(biāo)記轉(zhuǎn)化成功率高、分型準(zhǔn)確、開發(fā)和檢測費(fèi)用低、檢測通量靈活性強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前開展高通量基因分型的主流標(biāo)記類型（Semagn et al.，2014；王鵬 等，2021；范妍芹 等，2022）。KASP 標(biāo)記是開展遺傳多樣性分析的有力工具。Yang 等（2020）在對4份大白菜重測序的基礎(chǔ)上，鑒定篩選出SNP 位點(diǎn)，選擇在染色體上遺傳位置分布均勻的53 個KASP標(biāo)記，對34 份大白菜材料進(jìn)行基因分型和聚類分析，結(jié)果顯示34 份大白菜可聚為3 簇，與其結(jié)球類型相一致；Shen 等（2021）利用23 份代表性青花菜材料全基因組重測序數(shù)據(jù)，鑒定并篩選了SNP位點(diǎn)，開發(fā)出100 個KASP 標(biāo)記，對372 份青花菜材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，并從中選擇了28 個KASP 標(biāo)記對青花菜材料DNA 指紋圖譜進(jìn)行構(gòu)建；Scholten 等（2016）利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了蔥屬的洋蔥與野蔥和大蔥間具有多態(tài)性的1 100 個KASP標(biāo)記，用于構(gòu)建種間的遺傳連鎖圖譜；任海龍等（2023）從前人開發(fā)的200個蕓薹種KASP 標(biāo)記中，篩選出18 個核心KASP 標(biāo)記，并構(gòu)建了89 份菜薹品種的SNP 指紋圖譜，證明了KASP 技術(shù)在菜薹品種鑒定中的可行性。最近，Zhang 等（2023）基于GWAS 分析的結(jié)果開發(fā)了165 個辣椒疫霉病抗性的KASP 標(biāo)記，經(jīng)驗(yàn)證，其中在抗/感材料之間有多態(tài)性的30 個KASP 標(biāo)記被認(rèn)為與辣椒疫霉病抗性相關(guān)聯(lián)。此外，歐立軍等（2019）開發(fā)了與辣椒素含量緊密連鎖的KASP 標(biāo)記。但是，迄今關(guān)于辣椒全基因組范圍分布的、在資源材料或品種間具有高多態(tài)性、能夠進(jìn)行背景篩選的KASP 標(biāo)記還未見報(bào)道。

基因組中SNP 廣泛存在，其中絕大多數(shù)沒有受到選擇壓力，使得它們在進(jìn)化上是中性的，可以更完整地估計(jì)多樣性水平（Edwards et al.，2007）。本研究旨在開發(fā)一套在辣椒基因組中均勻分布、在國內(nèi)辣椒品種中具有高多態(tài)性、普適性強(qiáng)的KASP標(biāo)記集，為開展辣椒資源多樣性評估和育種改良提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯凡牧习残盼纸返腇2代以及來自全國14 個引種地區(qū)的207 份辣椒材料（表1），其中安信沃椒的F2代用于KASP 標(biāo)記的多態(tài)性初步篩選，207 份辣椒材料用于多態(tài)性KASP 標(biāo)記在辣椒品種資源中多態(tài)性驗(yàn)證。全部辣椒材料于2021年4 月播種至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所日光溫室。

表1 207 份供試?yán)苯凡牧弦N名稱及來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取 取辣椒幼嫩葉片，采用磁珠法提取DNA（張立國，2022）。使用NanoDrop1000（Thermo，USA）對DNA 進(jìn)行質(zhì)檢。

1.2.2 KASP 標(biāo)記設(shè)計(jì) 一套KASP 引物包括兩條正向競爭性引物和一條反向通用引物。利用安信沃椒F1代重測序數(shù)據(jù)（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分子遺傳課題組前期已完成）與參考基因組CM334 進(jìn)行比對，獲得變異數(shù)據(jù)集，再根據(jù)辣椒的高密度遺傳圖譜（Zhang et al.，2019）與物理圖譜的對應(yīng)關(guān)系，確定SNP 位點(diǎn)對應(yīng)的遺傳位置，以20 cM 為間距從中篩選出234 個位點(diǎn)用于開發(fā)KASP 標(biāo)記。利用DNAMAN（v6）與Primer 3（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/） 設(shè)計(jì)KASP引物。著絲粒區(qū)域只設(shè)計(jì)1 個標(biāo)記（Zhang et al.，2019）。引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：引物長度20～26 bp，Tm值58～63℃，自身互補(bǔ)性小于5，3′端互補(bǔ)性小于3（Long et al.，2017；Wu et al.，2020；Yang et al.，2020）。

1.2.3 KASP 標(biāo)記多態(tài)性篩選 利用Caliper（Life Sciences，USA） 和QuantStudio 12K Flex（Life Sciences，USA）進(jìn)行引物多態(tài)性篩選。選取30株安信沃椒F2代植株，同時(shí)設(shè)置2 個空白對照（ddH2O）。反應(yīng)體系包括樣本DNA 2.5 μL（濃度為30～50 ng · μL-1）、HiGeno 2 × Probe Mix A（北京嘉程生物科技有限公司）2.5 μL、SNP primer Mix（上海生工生物公司）0.07 μL（100 μmol · L-1，引物配比為A1∶A2∶C = 1∶1∶2.5，其中A1、A2表示兩條正向競爭性引物，C 表示反向通用引物）。

KASP 標(biāo)記的PCR 擴(kuò)增程序：階段1，95 ℃預(yù)變性10 min；階段2，95 ℃變性20 s，61 ℃退火40 s（每個循環(huán)降低0.6 ℃，循環(huán)數(shù)為10）；階段3，95 ℃變性20 s，55 ℃退火40 s（循環(huán)數(shù)為34）。

1.2.4 KASP 標(biāo)記體系轉(zhuǎn)化 為實(shí)現(xiàn)更小的反應(yīng)體系以及適應(yīng)高通量基因分型，反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化為烘干DNA 體系，文中出現(xiàn)的“體系轉(zhuǎn)化”均指引物篩選體系轉(zhuǎn)化為高通量分型體系。反應(yīng)體系包括20～30 ng DNA，SNP primer Mix 0.028 μL，HiGeno 2 × Probe Mix A 1 μL。PCR 擴(kuò)增程序階段3 循環(huán)數(shù)變?yōu)?9，其他條件與1.2.3 相同。

1.2.5 KASP 標(biāo)記在辣椒品種資源中多態(tài)性驗(yàn)證 使用Microsoft Excel 的宏插件GenAlex（6.51 b2）對基因分型原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（Smouse et al.，2017），導(dǎo)出popgen 的輸入文件。使用popgen32計(jì)算引物在引種材料中的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)百分率（Brown et al.，1980；Brown & Feldman，1981）。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒KASP 標(biāo)記開發(fā)

在辣椒全基因組范圍共設(shè)計(jì)了234 個KASP 標(biāo)記。所有設(shè)計(jì)引物的Tm 值在57.9～62.9 ℃之間，兩條競爭性引物的Tm 值差值在0～2.3 ℃范圍內(nèi)。引物的序列長度20～26 bp，兩條競爭性引物的序列長度差為0～3 bp。位點(diǎn)的變異類型有12 種，其中堿基互補(bǔ)配對氫鍵數(shù)量變化的有201 個，氫鍵數(shù)目未變化的有33 個。變異位點(diǎn)堿基互補(bǔ)配對氫鍵數(shù)目為三鍵不變時(shí)，每對引物的兩條競爭性引物的長度差均為0；變異位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)配對氫鍵數(shù)目為二鍵不變時(shí)，兩條競爭性引物的長度差為0 的引物數(shù)量僅占43%；變異位點(diǎn)的氫鍵數(shù)目變化時(shí)，兩條競爭性引物的長度差為0 的引物數(shù)量占58.7%。

引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)分為引物自身互補(bǔ)性和3′末端互補(bǔ)性。在234 個標(biāo)記中，引物存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的有119 個，無發(fā)夾結(jié)構(gòu)的有115 個；引物自身互補(bǔ)性為0～5，3′末端互補(bǔ)性為0～3。

2.2 辣椒KASP 標(biāo)記多態(tài)性篩選

234 個KASP 標(biāo)記中，159 個在F2群體中表現(xiàn)多態(tài)性，引物設(shè)計(jì)成功率為67.9%（圖1）。在具有多態(tài)性的標(biāo)記中，包括32 個相同基因型分簇集中的標(biāo)記（圖1-a），這類標(biāo)記為最優(yōu)標(biāo)記；以及67個相同基因型分簇較分散的標(biāo)記（圖1-b），7 個雜合基因型和純合基因型較近并且相同基因型分簇集中的標(biāo)記（圖1-c）和53 個雜合基因型和純合基因型較近并且相同基因型分簇分散的標(biāo)記（圖1-d），這3 類標(biāo)記后續(xù)進(jìn)行種質(zhì)資源或品種材料的遺傳多樣性分析時(shí)存在風(fēng)險(xiǎn)。不可使用的75 個標(biāo)記的分型可分為3 類，無擴(kuò)增的標(biāo)記占比最大，為46 個（圖1-e）；4 個為相同基因型分簇分散的標(biāo)記（圖1-f），這類標(biāo)記雖然可以將樣本聚成3 種基因型，但其過于分散使3 種基因型的分型結(jié)果彼此之間距離太近，容易產(chǎn)生誤判，故將其歸為無法使用；25個為純合基因型與雜合基因型無法區(qū)分的標(biāo)記（圖1-g）。

辣椒的12 條染色體中，每條染色體引物設(shè)計(jì)成功率不同，其中5 號染色體成功率最低，為56.0%；6 號染色體成功率最高，為100.0%（表2）。在115 個引物無發(fā)夾結(jié)構(gòu)的KASP 標(biāo)記中，引物設(shè)計(jì)的成功率為73%，與整體成功率基本相同，說明發(fā)夾結(jié)構(gòu)并不會對多態(tài)性標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)造成大的干擾。

表2 辣椒多態(tài)性KASP 標(biāo)記在12 條染色體上的分布

2.3 KASP 標(biāo)記高通量反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化

根據(jù)分型結(jié)果，從159 個可使用的KASP 標(biāo)記中篩選出141 個標(biāo)記用于體系轉(zhuǎn)化（表3）。篩選原則為：分簇集中優(yōu)于分簇分散；分簇分散優(yōu)于雜合純合靠近；雜合純合靠近的引物中，分簇集中優(yōu)于分簇分散。

表3 KASP 分子標(biāo)記集引物序列

141 個辣椒KASP 標(biāo)記能夠成功用于高通量反應(yīng)體系的有130 個，成功率為92%，這些KASP 標(biāo)記在辣椒染色體上基本均勻分布（圖2）。分型結(jié)果中，有42 個標(biāo)記與進(jìn)行標(biāo)記篩選時(shí)的分型結(jié)果不同，其中31 個標(biāo)記表現(xiàn)為分簇效果提升，10 個標(biāo)記表現(xiàn)為效果下降（表4）。

圖2 KASP 標(biāo)記在辣椒染色體上的物理位置與遺傳位置的對應(yīng)關(guān)系

表4 體系轉(zhuǎn)化后分型效果與標(biāo)記篩選時(shí)表現(xiàn)不同的KASP標(biāo)記數(shù)量

2.4 多態(tài)性KASP 標(biāo)記的普適性驗(yàn)證

按照引種來源地將207 份辣椒材料分為14 個群體，通過使用popgen 計(jì)算所有材料的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)百分率來驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物的多態(tài)性和穩(wěn)定性。遺傳多樣性分析結(jié)果表明，130 個KASP 標(biāo)記在辣椒材料中多態(tài)性表現(xiàn)良好，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為24～129 個，多態(tài)性位點(diǎn)百分率范圍為18.46%～99.23%（表5）。

表5 130 個KASP 標(biāo)記在207 份辣椒材料中的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)及百分率

3 討論與結(jié)論

影響KASP 引物設(shè)計(jì)成功的主要因素有4 個：引物自身的Tm 值、序列長度、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和兩條競爭性引物的擴(kuò)增效率。引物的Tm 值決定了引物的特異性結(jié)合的效率，Tm 值越高引物特異性越強(qiáng)，KASP 引物特異性結(jié)合的PCR 反應(yīng)過程是Touchdown PCR，設(shè)定溫度是55～61 ℃，所以引物的Tm 值應(yīng)盡量接近61 ℃。

兩條引物的擴(kuò)增效率主要被兩條競爭性引物的Tm 值差值及序列長度差值影響，SNP 位點(diǎn)變異類型會影響兩條競爭性引物的序列長度差。兩條競爭性引物的Tm 值差值的調(diào)節(jié)可通過增減某一條競爭性引物5′端堿基的數(shù)量實(shí)現(xiàn)，但長度差要盡量小，此時(shí)可盡量選擇SNP位點(diǎn)變異類型為G、C互變的類型。

本試驗(yàn)在引物篩選時(shí)出現(xiàn)的一類特殊的引物分型效果，即雜合基因型與純合基因型混在一起，此類分型效果出現(xiàn)的可能性有二：一是由于引物篩選時(shí)F2代樣本數(shù)量只有30 個，樣本中并未出現(xiàn)第3 種基因型；二是這類標(biāo)記本身是共顯性標(biāo)記，不能區(qū)分雜合子。由于本試驗(yàn)旨在找到高多態(tài)性的共顯性標(biāo)記，所以在多態(tài)性篩選時(shí)將這類標(biāo)記歸為不可使用。

本試驗(yàn)中，烘干DNA 體系反應(yīng)體系更小、通量顯著提高（由篩選引物的Quant Studio 12 k flex的1 板384 孔板提高為20 板384 孔板），而且從分型結(jié)果來看與引物篩選反應(yīng)體系效果基本相同，甚至很大比例的標(biāo)記表現(xiàn)出更好的分型效果，所以干體系的轉(zhuǎn)化十分必要。其中干體系的熒光信號產(chǎn)生PCR 反應(yīng)過程的循環(huán)數(shù)確定需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，從34 個循環(huán)試起，每次增加3 個循環(huán)，觀察分型結(jié)果，使分型結(jié)果盡量集中，但要保證NTC 在原點(diǎn)附近。

對于干體系的分型結(jié)果，標(biāo)記篩選時(shí)表現(xiàn)為分簇分散的在干體系中，有43.7%的標(biāo)記分簇效果顯著提升；標(biāo)記篩選時(shí)表現(xiàn)理想的、分簇分散的、雜合純合較近且聚類集中的標(biāo)記，其分簇情況基本不變；而引物篩選時(shí)表現(xiàn)為雜合純合較近且分簇分散的引物在干體系中分型失敗率較高，由此說明本試驗(yàn)在挑選用于高通量反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化的標(biāo)記時(shí)，所采用的分簇集中優(yōu)于分簇分散，分簇分散優(yōu)于雜合純合靠近，雜合純合靠近的引物中分簇集中優(yōu)于分簇分散的選擇原則是正確的。

通過由207 個辣椒品種組成的群體的基因分型結(jié)果，證明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的130 個辣椒的KASP 標(biāo)記具有高多態(tài)性、強(qiáng)普適性，并且適用于高通量基因分型平臺。

本試驗(yàn)開發(fā)了一組包含130 對辣椒KASP 引物且均勻分布在辣椒12 條染色體上的分子標(biāo)記集，其多態(tài)性高，普適性強(qiáng)，且適用于高通量基因分型。