應(yīng)用STR熒光標(biāo)記法分析大白菜品種遺傳多樣性

鐘世超 李瀟萱 樊銘璽 譚浩然 陳曉峰

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái) 264670）

大白菜〔BrassicacampestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕是十字花科蕓薹屬兩年生草本作物，原產(chǎn)于我國北方，其栽培歷史已超過6 000年，是我國第二大蔬菜作物，被稱為“百菜之王”（張曉寧 等，2016；范偉強(qiáng) 等，2021；張鳳蘭 等，2021）。我國大白菜種質(zhì)資源非常豐富，集中分布于華北、東北和西北地區(qū)，尤以山東省大白菜的種植面積最大、品種最多，種質(zhì)資源數(shù)量位居全國首位（張鳳蘭和李建偉，2011；王效睦 等，2016）。煙臺(tái)市是全國卵圓形大白菜的主要產(chǎn)區(qū)，福山的包頭蓮享譽(yù)全國，是卵圓形大白菜中適應(yīng)性最強(qiáng)的品種之一，該品種葉肉肥厚，味道鮮美，具有高產(chǎn)抗病、品質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)、耐貯藏等優(yōu)點(diǎn)（張麗莉 等，2021），因此被長期用作育種材料。但是在長期的品種選育過程中，原種純度逐漸降低，其優(yōu)良性狀也受到了影響，導(dǎo)致原始的包頭蓮逐漸被新品種所取代；加之地方品種研究開發(fā)工作相對(duì)滯后，優(yōu)良種質(zhì)保存和利用堪憂，種質(zhì)資源流失現(xiàn)象嚴(yán)重（李長春，2006）。為了防止當(dāng)?shù)刂髟源蟀撞朔N質(zhì)資源進(jìn)一步流失，煙臺(tái)地區(qū)主栽大白菜種質(zhì)資源的系統(tǒng)性調(diào)查與研究亟需展開。

最近20 年分子生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用，多種分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源的開發(fā)與保護(hù)中發(fā)揮了重要作用，例如RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）、SNP（single nucleotide polymorphisms）、ISSR（inter-simple sequence repeat）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、STR（short tandem repeats）等。其中，STR 具有多態(tài)性豐富、信息含量高、共線性標(biāo)記、操作簡單、經(jīng)濟(jì)方便等特點(diǎn)（羅冉 等，2010），STR 熒光標(biāo)記技術(shù)是熒光測(cè)序技術(shù)和STR 分子標(biāo)記技術(shù)的結(jié)合，在智能化、高通量、快速、精準(zhǔn)鑒別方面優(yōu)勢(shì)顯著（郝晨陽 等，2005），已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種作物的遺傳多樣性研究。陸徐忠等（2014）確定了12 個(gè)水稻STR 核心引物，構(gòu)建了127 個(gè)水稻品種的分子身份證。陳亮等（2016）以STR 標(biāo)記擴(kuò)增的帶型進(jìn)行編碼，構(gòu)建了大豆的指紋圖譜，有效區(qū)分了98 個(gè)大豆品種。秦瑞英等（2017）通過STR 熒光標(biāo)記的毛細(xì)管電泳分析，獲取了160 個(gè)小麥主栽品種的分子指紋信息。

雖然前人已經(jīng)應(yīng)用STR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行過研究（段麗麗 等，2016），但通過構(gòu)建指紋圖譜進(jìn)一步構(gòu)建分子身份證對(duì)大白菜進(jìn)行品種鑒定和遺傳多樣性分析還有待深入研究。本試驗(yàn)對(duì)山東煙臺(tái)地區(qū)主要栽培的19 個(gè)大白菜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用STR 熒光標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建大白菜種質(zhì)資源的指紋圖譜，并進(jìn)一步構(gòu)建其分子身份證，以期通過指紋圖譜和分子身份證對(duì)大白菜品種進(jìn)行劃分，并且通過聚類分析明確大白菜各品種間的親緣關(guān)系，旨在為煙臺(tái)地區(qū)大白菜種質(zhì)的快速鑒定、種群發(fā)育及資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料為19 個(gè)煙臺(tái)地區(qū)主要栽培的大白菜品種（表1），分別來自煙臺(tái)、青島和德州的科研院所以及種業(yè)公司。2022 年11 月于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院的日光溫室中進(jìn)行穴盤育苗，長至兩葉一心時(shí)取樣進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 參試大白菜品種名稱、來源及其主要農(nóng)藝性狀

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取與檢測(cè) 每個(gè)品種分別采集真葉0.5 g， 采 用Ezup（EZ-10 Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit）柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司，批號(hào)：B518261〕提取總DNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

利用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA 的質(zhì)量，再利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣本的純度。檢驗(yàn)合格后，將所有樣本均稀釋至25 ng · μL-1，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 STR 引物篩選 大白菜STR 引物篩選參考近年來發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)上已證實(shí)具備特異性的引物，遵循染色體和擴(kuò)增條帶多樣性原則精選出30對(duì)引物；通過常規(guī)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)各引物對(duì)樣本的多態(tài)性區(qū)別度是否符合試驗(yàn)要求，最終選取9 對(duì)引物（表2）用于本試驗(yàn)。

表2 用于大白菜種質(zhì)資源STR 分子標(biāo)記檢測(cè)的引物信息及來源

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系為30 μL：DNA模板1.0 μL（20～50 ng · L-1），2×TaqPCR mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL（10 μmol · L-1），dNTP 0.5 μL（5 μmol · L-1），10×TaqBuffer（MgCl2）2.5 μL，Taq酶0.2 μL（5 U · μL-1），ddH2O 補(bǔ) 足30 μL。

采用Touch-down PCR 反應(yīng)程序（王宇晴等，2022）：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃（Δ℃ = -0.5 ℃），30 s，72 ℃，30 s，循環(huán)10 次；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s、72 ℃，30 s，循環(huán)30 次；72 ℃，10 min；4 ℃保存。

1.2.4 毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè) 將奇數(shù)連鎖群的正向引物5′端加6-FAM 熒光標(biāo)記，將偶數(shù)連鎖群的正向引物5′端加HEX 熒光標(biāo)記，所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。毛細(xì)管電泳檢測(cè)程序：使用連續(xù)加樣器，將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按99∶1 的體積比混合，充分振蕩混勻，加入到96 孔上樣板中，每孔10 μL，1 200 r ·min-1離心15 s；使用12 孔10 μL 排槍，在96 孔板對(duì)應(yīng)的孔中加入1 μL 樣本，1 200 r · min-1離心15 s；使用封板膜密封96 孔板，1 200 r · min-1離心30 s；置于PCR 儀，98 ℃變性5 min，迅速放入冰水中冷卻10 min，1 200 r · min-1離心15 s。采用ABI 3730 遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

從ABI 3730 遺傳分析儀上導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，利用GeneMapper 5.0 軟件進(jìn)行分析并獲得每對(duì)引物在不同樣本上的擴(kuò)增片段長度（秧拯民，2021）。利用DataFormater 軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為PopGen 32 可以識(shí)別的格式，然后導(dǎo)入PopGen32 計(jì)算觀測(cè)等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）（樊文強(qiáng) 等，2016）。利用Power Marker V3.25 軟件統(tǒng)計(jì)基因型數(shù)量和多態(tài)性信息含量（PIC）（Liu & Muse，2005）。

1.4 DNA 分子身份證構(gòu)建

采用STR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)，利用篩選出的9 對(duì)核心引物對(duì)19 個(gè)大白菜樣本進(jìn)行分析，采用ABI 3730 遺傳分析儀讀取擴(kuò)增數(shù)據(jù)，獲得擴(kuò)增片段的精確大小，以數(shù)字加英文字母的組合方式進(jìn)行編碼，得到分子身份證。具體轉(zhuǎn)換方法：將每對(duì)引物在某一樣品上擴(kuò)增出的每一種帶型用個(gè)位阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3……9 編碼表示，為保證每一種帶型只占1 位數(shù)字，帶型數(shù)大于9 時(shí)分別用小寫英文字母表示，如a、b、c 代表10、11、12 種帶型，依次類推，無條帶用0 表示；按照引物擴(kuò)增帶型數(shù)由少到多的順序，將每個(gè)樣品在9 對(duì)引物上的擴(kuò)增帶型數(shù)據(jù)以字符串的形式串聯(lián)起來，即得到每個(gè)大白菜品種以9 位數(shù)字或字母表示的分子身份證（徐雷鋒 等，2014）。

1.5 聚類分析

采用軟件DataFormater 將GeneMapper 5.0 導(dǎo)出的數(shù)據(jù)保存為NTSYSpc 2.10 可以識(shí)別的格式，采用UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic averages）法對(duì)參試19 個(gè)大白菜品種進(jìn)行聚類分析（匡猛 等，2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜DNA 提取

提取的DNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明（圖1），樣本DNA 主條帶明亮清晰，無降解，無大范圍明顯拖尾，無RNA 污染，DNA 提取完整度較好。

圖1 部分大白菜品種提取DNA 的電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 STR 標(biāo)記多態(tài)性分析

如表3 所示，9 對(duì)STR 引物在19 個(gè)大白菜品種中共檢測(cè)到52 個(gè)等位基因位點(diǎn)，平均每條染色體2.6 個(gè)，每對(duì)引物檢測(cè)出3～8 個(gè)等位基因，平均為5.777 8 個(gè)，平均每對(duì)引物檢測(cè)出基因型數(shù)量為7.444 4 個(gè)；其中引物Nia-m049a 檢測(cè)出的等位基因數(shù)目最多（8 個(gè)），引物Cun-m098a、Cnu-m344a和Cnu-m537a 次之（7 個(gè)），而引物Cnu-m225a最少（3 個(gè)）；有效等位基因（Ne）的變化范圍為1.809 5～4.750 0，平均值3.536 6；觀測(cè)雜合度（Ho）的變化范圍為0.473 7～1.000 0，平均為0.766 1；期望雜合度（He）的變化范圍為0.459 5～0.810 8，平均為0.711 4；香農(nóng)信息指數(shù)（I）的變化范圍為0.714 2～1.668 5，平均為1.378 7；Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）的變化范圍為0.447 4～0.789 5，平均為0.692 7；多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.368 1～0.757 2，平均為0.644 2。一般認(rèn)為，當(dāng)PIC ＜ 0.25 時(shí)，引物的多態(tài)性信息含量較低，當(dāng)PIC ＞ 0.5 時(shí)，引物的多態(tài)性信息含量較高（陳翠萍和劉洋，2022）。表明，本試驗(yàn)篩選出的9 對(duì)STR 引物具有良好的多態(tài)性，參試19 個(gè)大白菜品種具有豐富的遺傳多樣性。圖2 為部分大白菜品種在熒光引物Nia-m049a 中的毛細(xì)管電泳圖。

圖2 6 個(gè)大白菜品種中熒光引物Nia-m049a 的STR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 STR 指紋圖譜的構(gòu)建

對(duì)毛細(xì)管電泳后的數(shù)據(jù)進(jìn)行人工校正，并整理電泳峰圖，讀出等位基因條帶的大小（胡文斌等，2021），獲取19 個(gè)大白菜品種在不同位點(diǎn)的等位基因片段大小，建立19 個(gè)大白菜品種的DNA指紋圖譜（表4）。還可以按照“0，1”陣列為基礎(chǔ)制作DNA 的指紋圖譜，將表4 中的條帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字“0，1”，其中0 代表在相應(yīng)的擴(kuò)增位點(diǎn)無擴(kuò)增條帶，1 則代表有擴(kuò)增條帶（林朦婕 等，2021）（表5）。

表4 19 個(gè)大白菜品種的STR 指紋圖譜

表5 “0，1”矩陣形式的STR 指紋圖譜

2.4 品種分子身份證編碼

按照表2 所示的引物序列，將每對(duì)引物在不同樣本上擴(kuò)增得到的帶型按照由少到多的順序排列，將其編碼進(jìn)行串聯(lián)，得到19 個(gè)大白菜品種的分子身份證（表6）。對(duì)應(yīng)位置編碼相同則表明同一引物在不同樣本上得到了相同的擴(kuò)增帶型。以煙雜3 號(hào)為例，其分子身份證的代碼為476345552，表示第1 個(gè)STR 核心引物Cnu-m123a 的擴(kuò)增帶型為4 號(hào)帶型，第2 個(gè)STR 核心引物Cnu-m046a 的擴(kuò)增帶型為7 號(hào)帶型，第3 個(gè)STR 核心引物Cnum098a 的擴(kuò)增帶型為6 號(hào)帶型，第4 個(gè)STR 核心引物Cnu-m225a 的擴(kuò)增帶型為3 號(hào)帶型，第5 個(gè)STR 核心引物Cnu-m344a 的擴(kuò)增帶型為4 號(hào)帶型，第6 個(gè)STR 核心引物Nia-m049a 的擴(kuò)增帶型為5 號(hào)帶型，第7 個(gè)STR 核心引物Cnu-m182a 的擴(kuò)增帶型為5 號(hào)帶型，第8 個(gè)STR 核心引物Cnum537a 的擴(kuò)增帶型為5 號(hào)帶型，第9 個(gè)STR 核心引物Nia-m088a 的擴(kuò)增帶型為2 號(hào)帶型。

表6 19 個(gè)大白菜品種的分子身份證與二維碼

由表6 還可以看出，19 個(gè)大白菜品種的分子身份證各不相同，即本試驗(yàn)選出的9 對(duì)核心引物可以較好地區(qū)分19 個(gè)參試大白菜品種，這說明本試驗(yàn)選用的9 個(gè)STR 核心引物是可靠且有效的。

按照國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局新發(fā)布的推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33993—2017《商品二維碼》（張成海等，2017）和GB/T 40204—2021《追溯二維碼技術(shù)通則》（董曉文 等，2021）的具體要求，利用二維碼快速生成器生成19 個(gè)大白菜品種身份證的二維碼（表6），掃描后可以直接獲得大白菜的分子身份證信息，既方便又快捷。

2.5 品種間遺傳關(guān)系的聚類分析

采用軟件DataFormater 將GeneMapper 5.0 導(dǎo)出的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為NTSYSpc 2.10 可以識(shí)別的格式，計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)（GS）。由表7 可知，19 個(gè)大白菜品種間的GS 值為0.096 8～0.894 7，其中義和秋和87-114、名古屋5899之間的GS 值最大，均為0.894 7，表明義和秋和87-114、名古屋5899間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最接近；四季奶油28 快菜和秋霸王之間的GS 值最小，為0.096 8，表明二者的遺傳多樣性相對(duì)較廣，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表7 19 個(gè)大白菜品種間的遺傳相似系數(shù)

根據(jù)9 對(duì)引物對(duì)19 個(gè)大白菜品種的擴(kuò)增結(jié)果，利用NTSYSpc 2.10軟件構(gòu)建19 個(gè)大白菜品種的遺傳關(guān)系樹狀圖（圖3）。當(dāng)GS 值為0.66 時(shí)，將19 個(gè)大白菜品種分成3 個(gè)類群。第Ⅰ類群包含10 個(gè)品種，分別為煙福翠玉、煙雜3 號(hào)、名古屋5899、87-114、義和秋、改良青雜3 號(hào)、小義和秋、琴萌騎士、秋霸王、福山包頭蓮。第Ⅱ類群包含8 個(gè)品種，分別為煙福黃悅、煙福金盛、西白13 號(hào)、煙福黃秀、黃金娃娃菜F1、德高盈煌、皇家1 號(hào)、黃心金寶。第Ⅲ類群只有1 個(gè)品種四季奶油28 快菜。在第Ⅰ類群中義和秋和名古屋5899、87-114的親緣關(guān)系最為接近，再加上改良青雜3 號(hào)和小義和秋，都是原產(chǎn)于青島的品種，具有相同或相似的父母本，其中義和秋是由福山包頭蓮和青島地方品種雜種獲得的一代雜種，至于煙福翠玉為何出現(xiàn)在第Ⅰ類群當(dāng)中，推測(cè)可能是福山包頭蓮與青島當(dāng)?shù)仄贩N進(jìn)行雜交選育而成的。第Ⅱ類群中的8 個(gè)大白菜品種大多為煙臺(tái)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的一代雜種，其中煙福黃悅、煙福金盛、煙福黃秀均是由福山包頭蓮與煙臺(tái)地方品種雜交選育獲得的。第Ⅲ類群中的四季奶油28 快菜是苗用大白菜品種，與普通大白菜相比生長周期短、生長速度快，與第Ⅰ和第Ⅱ類群的大白菜品種親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。以上聚類結(jié)果與大白菜品種來源和親緣關(guān)系比較吻合。

圖3 基于9 對(duì)STR 引物的19 個(gè)大白菜品種聚類分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

山東煙臺(tái)地區(qū)的大白菜種植面積大，種類多樣，品種混雜，在一般的農(nóng)事生產(chǎn)中往往僅根據(jù)簡單農(nóng)藝性狀進(jìn)行區(qū)分，加之當(dāng)前市場(chǎng)上的大白菜品種良莠不齊，種植戶很容易誤種產(chǎn)量低、品質(zhì)差、抗性差的大白菜品種。此外，單純根據(jù)大白菜農(nóng)藝性狀進(jìn)行品種區(qū)分時(shí)，容易受到外部環(huán)境因素的誤導(dǎo)，致使鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，煙臺(tái)地區(qū)主栽大白菜的鑒定需要從基因?qū)用胬梅肿訕?biāo)記技術(shù)進(jìn)行更為準(zhǔn)確的鑒定。

在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，STR 分子標(biāo)記具有不受外界因素干擾、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于大白菜的遺傳多樣性分析中。孟艷等（2021）利用STR 分子標(biāo)記對(duì)大白菜自交系的群組進(jìn)行劃分，將65 份大白菜自交系聚類劃分為5個(gè)類群。劉小愿等（2023）基于STR 分子標(biāo)記技術(shù)篩選出3 對(duì)表現(xiàn)親本擴(kuò)增特異性的引物，快速鑒定了大白菜新品種的純度，加速了新品種的推廣。段麗麗等（2016）利用30 對(duì)STR 引物對(duì)46 份大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，在遺傳距離為2.5 處分為5 個(gè)類群，說明大白菜遺傳多樣性豐富。原靜云等（2016）應(yīng)用STR 分子標(biāo)記技術(shù)分析了49 對(duì)大白菜自交系的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)多態(tài)引物的頻率達(dá)到66.7%，為大白菜雄性不育系的大面積推廣提供了科學(xué)依據(jù)。秦艷梅等（2013）利用初篩出的21對(duì)STR 引物將78 個(gè)不結(jié)球白菜品種分為4 個(gè)亞類群，證明了不結(jié)球白菜品種內(nèi)部存在著明顯的群體結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)利用篩選出來的9 對(duì)STR 引物對(duì)19個(gè)煙臺(tái)地區(qū)主栽大白菜品種進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，9 對(duì)引物共檢測(cè)到52 個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因5.777 8 個(gè)，多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍為0.368 1～0.757 2，平均為0.644 2，大多屬于高多態(tài)性位點(diǎn)（PIC ＞ 0.5），充分說明本試驗(yàn)所采用的STR 引物多態(tài)性較好。

利用STR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證，以及利用UPGMA 法繪制品種聚類樹均是進(jìn)行作物種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析的有效手段（唐玉娟 等，2023）。二者各有優(yōu)勢(shì)，指紋圖譜和分子身份證將品種間的遺傳信息轉(zhuǎn)化為直觀的數(shù)字信息，可以在短時(shí)間內(nèi)通過數(shù)據(jù)的比對(duì)分析出親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近（趙靚，2019）；而品種聚類樹是由品種間的遺傳系數(shù)繪制而成，可以將大量的種質(zhì)資源分群分類，以聚類樹的形式展現(xiàn)出品種間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。本試驗(yàn)在構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證的同時(shí)，利用NTSYSpc 2.10 軟件繪制了19 個(gè)大白菜品種的聚類樹，結(jié)果顯示19 個(gè)大白菜品種的指紋圖譜和分子身份證各不相同，可以將參試品種完全分開；聚類分析將大白菜品種分成3 個(gè)類群，第Ⅰ類是原產(chǎn)于青島的品種，共10 個(gè)，第Ⅱ類大多是煙臺(tái)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的一代雜種，共8 個(gè)，第Ⅲ類是苗用大白菜品種，與第Ⅰ和第Ⅱ類親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，表明參試19 個(gè)大白菜品種具有較好的地域特性，有效區(qū)分了煙臺(tái)當(dāng)?shù)嘏c外阜的大白菜種質(zhì)資源。本研究形成的指紋圖譜與分子身份證能提供參考，但還不能全面代表煙臺(tái)當(dāng)?shù)刂髟源蟀撞似贩N的信息，因此需要結(jié)合全基因組測(cè)序等方法對(duì)品種進(jìn)行更全面的鑒定。