羥基紅花黃色素A 抗缺氧/復(fù)氧所致神經(jīng)元損傷的作用及機制研究*

賈曉旭，張怡博，袁慶，王碩，朱金墻

（1．鄂爾多斯中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，鄂爾多斯 017010；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

缺血性腦血管疾病嚴(yán)重危害著人類的生命健康，及時恢復(fù)血流以實現(xiàn)再灌注是目前最常用的治療策略，但該策略在挽救患者生命的同時又會產(chǎn)生新?lián)p傷，即腦缺血再灌注損傷（CIRI）[1]。CIRI 是一種復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)性病理生理過程，涉及多種發(fā)病機制。研究表明，CIRI 可損傷神經(jīng)元軸突及突觸結(jié)構(gòu)，進一步導(dǎo)致海馬、大腦皮層等部位神經(jīng)元死亡[2-3]。因此，神經(jīng)元突觸重塑在減輕CIRI 以及神經(jīng)組織修復(fù)方面發(fā)揮重要作用。

具有多環(huán)節(jié)、多靶點、多途徑等作用特點的中藥在防治CIRI 方面具有獨特的作用[4]。中藥紅花（Carthamus tinctorius L．）具有通絡(luò)活血、祛瘀止痛的功效，常用于心腦血管疾?。ㄈ绺哐獕翰　⒐谛牟?、腦血栓）的輔助治療，其主要活性成分為水溶性成分紅花黃色素（SY），其中羥基紅花黃色素A（HSYA）為紅花黃色素中含量較高的成分[5]。藥理研究表明，HSYA 能抗興奮性毒性、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、抗炎、保護血腦屏障和調(diào)節(jié)自噬，還能促進突觸可塑性，從而發(fā)揮抗CIRI 的作用[6-7]。Yu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)HSYA 可增強大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠基底興奮性突觸傳遞，并誘導(dǎo)海馬長時程增強（LTP），增加腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）和GluN2B 的表達，增強突觸可塑性，但是對CIRI 后神經(jīng)元突觸重塑的作用機制尚未研究。

本研究體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，建立缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷模型模擬CIRI，通過考察HSYA 對H/R 損傷后神經(jīng)元活力及乳酸脫氫酶（LDH）的影響，明確其神經(jīng)保護作用；并考察HSYA 對H/R 損傷的神經(jīng)元中BDNF、生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）以及NogoA mRNA 和蛋白表達的影響，初步探討HSYA抗H/R 所致神經(jīng)元損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar 大鼠16 d 孕鼠，清潔級，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥物與主要試劑 HSYA（天津一方科技有限責(zé)任公司，中國），DMEM/F12 培養(yǎng)基、B-27（GIBCO 公司，美國），胰酶1∶250（Ameresco 公司，美國），胎牛血清（FBS，HYCLONE 公司，美國），LDH 檢測試劑盒（北京中生生物工程高技術(shù)公司，中國），四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO）、多聚賴氨酸（SIGMA 公司，美國），青霉素、鏈霉素（市售分析純）、Trizol（上海生工生物技術(shù)有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（寶生物工程有限公司）；BDNF、GAP-43 及Nogo-A 酶聯(lián)免疫試劑盒（R&D 公司），丙三醇、氯仿、無水乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑廠），BDNF、GAP-43 及Nogo-A mRNA的上、下游引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）。

表1 引物序列Tab.1 Primers Sequence

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（THERMO，F(xiàn)ORMA3111 型，美國），倒置相差顯微鏡（LEIClADMIL，德國），三氣培養(yǎng)箱（MODEL 3131，THERMO，美國），酶標(biāo)儀（Multiskan Ascent，THERMO LABSYSTEMS，美國），微量多功能讀板機（NanoQuant，infinite M200，瑞士），ABI 7300 型實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）。

1.4 方法

1.4.1 神經(jīng)元原代培養(yǎng) 參照本課題組前期實驗方法[9]，取懷孕16 d 的Wistar 大鼠，頸椎脫臼處死，用75%醫(yī)用酒精浸泡3～5 min，于無菌條件下取出胚胎大腦皮層，剔除腦膜及大血管。將皮質(zhì)剪碎約1 mm3大小，加入適量0．25%胰蛋白酶，37 ℃消化5 min。立即加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，并將組織完全吹散。經(jīng)75 μm篩網(wǎng)過濾，收集濾液；800 r/min 離心10 min（本研究所用離心機半徑均為13 cm），棄上清，收集沉淀。用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液將細胞重懸。調(diào)整細胞密度至1×106/mL，接種于預(yù)先涂有0．01%多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，置換為無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)2%B-27，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素）。以后，每2 d 半量換液1 次，細胞生長至第7 天時可用于實驗。

1.4.2 實驗分組及給藥 取接種于6 孔或者96 孔細胞培養(yǎng)板中的神經(jīng)元，每組設(shè)平行6 孔，隨機分為正常對照組、H/R 組、羥基紅花黃色素A 低（5 μg/mL）、中（20 μg/mL）、高（80 μg/mL）劑量組，具體處理方法如下。正常對照組：置換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，不做H/R 處理；H/R 組：置換無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入體積分?jǐn)?shù)分別為0．94 N2、0．05 CO2、0．01 O2的三氣培養(yǎng)箱中缺氧孵育24 h，再于體積分?jǐn)?shù)分別為0．95 空氣、0．05 CO2條件下復(fù)氧孵育24 h；HSYA 低、中、高劑量組：分別置換為含5、20、80 μg/mL HSYA 的無血清培養(yǎng)液，H/R 處理同H/R 組。

1.4.3 指標(biāo)檢測

1.4.3.1 噻唑藍（MTT）法檢測細胞活力 取接種于96 孔板的神經(jīng)元，收集培養(yǎng)上清液（用于LDH 檢測），將MTT 液按0．5 mg/mL 的濃度加入100 μL/孔，繼續(xù)孵育4 h 后，倒置顯微鏡下可見活細胞處有大量紫藍色針狀結(jié)晶，棄上清，加DMSO 100 μL/孔溶解后，酶標(biāo)儀上讀取OD 值，波長為570 nm。

1.4.3.2 LDH 試劑盒檢測細胞上清液中LDH 活性 取細胞上清液，按照試劑盒說明書方法操作，以全自動生化分析儀測定LDH 活性。

1.4.3.3 RT-PCR 檢測BDNF、GAP-43 及Nogo-A mRNA 表達水平 取接種于6 孔板的神經(jīng)元，棄培養(yǎng)液，用冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗2 次，每孔加入1 mL 裂解液TRIzol，反復(fù)吹打，室溫放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加0．2 mL 氯仿，劇烈振蕩，室溫放置15～30 min 后，于4 ℃12 000 r/min離心15 min，將水相轉(zhuǎn)移到新的無RNase 的離心管中，緩慢加入1 倍體積-20 ℃保存的丙三醇，混勻，置-20 ℃2 h 以上，充分沉淀RNA。4 ℃10 000×g 離心10 min，棄上清。沉淀加入75%乙醇1 mL，重新懸浮，4℃8 000×g 離心10 min，棄上清。在超凈臺內(nèi)室溫揮發(fā)5 min，加入適量無RNnase 水輕輕吹打沉淀，使之溶解，用紫外分光光度法檢測RNA 樣品的濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用ABI 7300 實時定量PCR儀分析軟件進行分析，獲得每個樣品每次反應(yīng)的CT值，計算得到其△CT，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計[10]。

1.4.3.4 ELISA 檢測BDNF、GAP-43 及Nogo-A蛋白表達水平 收集各組上清液，1 000 r/min 離心10 min。將50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品、50 μL 樣品加入相應(yīng)反應(yīng)孔，立即加入50 μL 的生物素標(biāo)記的抗體，混勻，37 ℃溫育1 h，洗板3 次，每孔加入60 μL 的親和鏈霉素-HRP，37 ℃溫育30 min，洗板3 次，每孔加入底物A、B 各50 μL，混勻30 s，封板，37 ℃避光溫育10 min，每孔加入終止液50 μL，立即于450 nm 波長處檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 20．0 軟件包進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSYA 對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元活力的影響 與正常對照組比較，H/R 組神經(jīng)元活力顯著降低（P＜0．01）；與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量組神經(jīng)元活力均顯著增強（P＜0．01）。見圖1。

圖1 不同濃度HSYA 對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元活力的影響（±s，n=6）Fig.1 Effect of different concentrations of HSYA on neuronal viability after hypoxia/reoxygenation injury（±s，n=6）

2.2 HSYA 對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元LDH 釋放的影響 與正常對照組比較，H/R 組神經(jīng)元LDH 釋放明顯增加（P＜0．05）。與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量組神經(jīng)元LDH 釋放均顯著減少（P＜0．01）。見圖2。

圖2 不同濃度HSYA 對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元LDH 釋放的影響（±s，n=6）Fig.2 Effect of different concentrations of HSYA on LDH release in neurons with hypoxia/reoxygenation injury（±s，n=6）

2.3 HSYA 對H/R 損傷神經(jīng)元中BDNF、GAP-43及Nogo-A mRNA 表達的影響 與正常對照組比較，H/R 組BDNF 及GAP-43 mRNA 表達均顯著降低（P＜0．05），Nogo-A mRNA 表達顯著增加（P＜0．01）；與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量均可顯著促進BDNF mRNA 表達（P＜0．05 或P＜0．01），且抑制Nogo-A mRNA 表達（P＜0．05 或P＜0．01）；HSYA 中、高劑量可顯著促進GAP-43 mRNA 表達（P＜0．05 或P＜0．01）。見圖3、4、5。

圖3 HSYA 對H/R 損傷神經(jīng)元的BDNF mRNA 表達的影響（±s，n=6）Fig.3 Effect of HSYA on BDNF mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖4 HSYA 對H/R 損傷神經(jīng)元的GAP-43 mRNA 表達的影響（±s，n=6）Fig.4 Effect of HSYA on GAP-43 mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖5 HSYA 對H/R 損傷神經(jīng)元的Nogo-A mRNA 表達的影響（±s，n=6）Fig.5 Effect of HSYA on Nogo-A mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

2.4 HYSA 對H/R 損傷CNC 的BDNF、GAP-43 及Nogo-A 蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較，H/R 組BDNF、GAP-43 蛋白表達均顯著降低（P＜0．05），NogoA 蛋白表達水平顯著提高（P＜0．01）；與H/R 組比較，HSYA 低、中、高劑量均可顯著降低BDNF 蛋白表達水平（P＜0．05），且抑制Nogo-A 蛋白表達（P＜0．05 或P＜0．01）；HSYA 中、高劑量可顯著促進GAP-43 mRNA 表達（P＜0．05）。見圖6、7、8。

圖6 HYSA 對H/R 損傷神經(jīng)元BDNF 蛋白表達的影響（±s，n=6）Fig.6 Effect of HYSA on BDNF protein expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖7 HYSA 對H/R 損傷神經(jīng)元GAP-43 蛋白表達的影響（±s，n=6）Fig.7 Effect of HYSA on the expression of GAP-43 protein in H/R injured neurons（±s，n=6）

圖8 HYSA 對H/R 損傷神經(jīng)元Nogo-A 蛋白表達的影響（±s，n=6）Fig.8 Effect of HYSA on the expression of Nogo-A protein in H/R injured neurons（±s，n=6）

3 討論

CIRI 最核心的問題是神經(jīng)元損害引起的神經(jīng)功能障礙，因此，保護和恢復(fù)受損神經(jīng)元的功能成為治療CIRI 最重要的任務(wù)[11]。近年來，諸多學(xué)者認(rèn)為其治療靶點不應(yīng)僅僅局限于抵抗損傷的因素，而更應(yīng)該著眼于內(nèi)源性的神經(jīng)保護機制和長期的恢復(fù)過程[12]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)和控制神經(jīng)元的生存、生長、遷移以及與其他細胞建立功能性聯(lián)系，并在神經(jīng)再生過程中促進軸突的再生長。神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs）是一類對神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋白質(zhì)，主要分為：1）神經(jīng)營養(yǎng)素（NT）家族，包括神經(jīng)生長因子（NGF）、BDNF、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5（NT-4/5）等。2）膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）。3）睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）。這些蛋白質(zhì)已經(jīng)成為治療神經(jīng)損傷等疾病的潛在藥物標(biāo)靶。其中BDNF 是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子。BDNF 是從豬腦脊液中發(fā)現(xiàn)的一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的堿性蛋白質(zhì)，BDNF 及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，但主要是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達，其中海馬和皮質(zhì)的含量最高。它通過與酪氨酸激酶受體B（TrkB）的結(jié)合而發(fā)揮作用，對神經(jīng)元的生存、分化、生長和神經(jīng)元正常生理功能具有維持和促進作用，而且還有增加突觸可塑性及神經(jīng)再生等作用[13]。本研究結(jié)果顯示，HSYA 可有效抑制H/R 引起的LDH 釋放，明顯增加神經(jīng)元細胞活力，表明HSYA 能有效減輕H/R 引起的神經(jīng)元損傷。為了探究其作用機制，本研究進一步考察了HSYA 對神經(jīng)元表達及分泌BDNF 的影響，結(jié)果表明HSYA 可有效促進神經(jīng)元釋放BDNF。

此外，BDNF 還可以促進突觸成熟，增加突觸可塑性[14-15]。因此，本研究進一步考察HSYA 是否可以通過促進BDNF 表達而增加神經(jīng)元突觸可塑性。GAP-43 是存在于神經(jīng)元軸突生長錐中的一種特異性胞膜磷酸蛋白，廣泛分布于大腦、小腦、脊髓、背根節(jié)以及自主神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)。在發(fā)育中的神經(jīng)元內(nèi)，沿整個軸突表達，在生長錐表達尤其豐富；而在成熟神經(jīng)系統(tǒng)，主要分布于某些特定區(qū)域的神經(jīng)終末中，在促進神經(jīng)細胞生長、軸突再生和突觸重構(gòu)等方面發(fā)揮重要作用，已成為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)等神經(jīng)可塑性的首選分子探針[16-17]。Nogo-A 是一種氨基酸的膜蛋白，是有效的軸突生長抑制因子，不僅表達于少突膠質(zhì)細胞，還廣泛表達于神經(jīng)元，是反映神經(jīng)損傷后是否可再生的指標(biāo)之一[18-19]。在生理狀態(tài)下，Nogo-A 對生長較遲的神經(jīng)纖維起到約束的作用，神經(jīng)纖維只能進入特定的區(qū)域?qū)觾?nèi)。在成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Nogo-A的主要作用是保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)定，防止不必要的出芽，有助于保持神經(jīng)聯(lián)系的特異性，防止形成不必要的、錯誤的投射，通過微管動力學(xué)調(diào)節(jié)參與軸突生長和樹突塑形的進程。Nogo-A 與其他生長抑制因子和神經(jīng)生長促進因子呈平衡狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)外界刺激后，其內(nèi)部平衡被破壞，Nogo-A呈現(xiàn)抑制作用[20-21]。以上兩種蛋白均可一定程度地分泌到細胞外。本研究考察了HSYA 對神經(jīng)元內(nèi)GAP-43 和Nogo-A mRNA 以及細胞上清液中二者蛋白含量的影響，結(jié)果顯示，HSYA 可促進GAP-43 mRNA 及蛋白表達，同時抑制Nogo-A mRNA 及蛋白表達，表明HSYA 能有效增加神經(jīng)元突觸可塑性。

本研究初步表明HSYA 抗H/R 損傷神經(jīng)元的作用機制可能是通過促進BDNF 表達而改善神經(jīng)元生存狀態(tài)，并增加神經(jīng)元突觸可塑性。但該作用還有待從神經(jīng)元突觸微觀形態(tài)學(xué)角度來進一步驗證，其作用機制亦有待圍繞BDNF/酪氨酸激酶B（TrkB）、Nogo-A/Nogo-A 受體（NgR）等信號通路進行深入探討。