應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記分析煙臺(tái)地區(qū)黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性

滿孝源，王湘懿，張凱歌，胡 凌，陳曉峰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院 山東煙臺(tái) 264670）

黃瓜（Cucumis sativusL.，2n=14）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生植物，是一種世界性蔬菜，又名王瓜、胡瓜、青瓜，在果菜類蔬菜中具有很高的地位[1]。我國(guó)是黃瓜生產(chǎn)大國(guó)，其栽培面積占世界黃瓜栽培總面積的一半以上，產(chǎn)量和規(guī)模均居世界第一位。山東黃瓜地方品種由于栽培歷史較久和引入途徑不同，加之山東省不同地區(qū)氣候差異較大，在長(zhǎng)期自然和人工定向選擇下，形成類型多、品種資源豐富的特點(diǎn)[2-3]。以白黃瓜和地黃瓜為代表的煙臺(tái)地方黃瓜，因其具有品質(zhì)優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富、口感鮮脆等特點(diǎn)，市場(chǎng)地位不斷提高[4-5]。隨著市場(chǎng)需求擴(kuò)大，黃瓜栽培及其選育品種逐漸增多，原優(yōu)良品種在選育過程中純度逐漸降低，在生產(chǎn)中重名現(xiàn)象普遍，煙臺(tái)地區(qū)種質(zhì)資源研究相對(duì)落后，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)種質(zhì)流失嚴(yán)重[6]。

21 世紀(jì)以來，分子生物學(xué)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，越來越多的分子標(biāo)記技術(shù)相繼出現(xiàn)，并逐漸廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種、植物親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建等各個(gè)領(lǐng)域，例如RFLP、ISSR、RAPD、AFLP、SSR 等[7-10]。SSR（Simple Sequence Repeat）稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，具有單基因座、等位基因變異多、多態(tài)性豐富、信息量大、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、進(jìn)化所受選擇壓力小、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]。在眾多的分子標(biāo)記中，SSR 能精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)基因DNA 片段大小，檢測(cè)結(jié)果可靠、穩(wěn)定且準(zhǔn)確，所以SSR 熒光標(biāo)記常應(yīng)用于植物遺傳分析、分子信息身份證的構(gòu)建、品種鑒別等方面的研究[12]。王宇晴等[13]利用22 對(duì)SSR 核心引物，研究了111 份甜菜登記品種的相關(guān)遺傳信息，邱楊等[14]從22 對(duì)引物中篩選出8 對(duì)，構(gòu)建了75 份蘿卜種質(zhì)資源的分子身份證，徐曉丹等[15]用6 對(duì)多態(tài)性引物將36 份小豆品種區(qū)分成4 個(gè)類群。

筆者在本研究中對(duì)膠東地區(qū)主要栽培的黃瓜品種和全國(guó)多地性狀及生長(zhǎng)特點(diǎn)相似的品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用SSR 分子熒光標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建煙臺(tái)地區(qū)黃瓜的遺傳指紋圖譜和分子身份證，再對(duì)其進(jìn)行品種劃分，最后采用聚類分析法確定各黃瓜品種間的親緣關(guān)系，為煙臺(tái)地區(qū)黃瓜的品種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為22 份煙臺(tái)地區(qū)主要栽培的黃瓜種質(zhì)（表1），其中21 份種質(zhì)來自山東、湖南和河北等?。ㄊ校┎煌N業(yè)公司，1 份是中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院自育未授權(quán)品種。2022 年10—12 月，于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院溫室播種黃瓜種子，采用隨機(jī)區(qū)組方式于72 穴盤種植，每份種質(zhì)播6 穴，培育至2 片真葉期后，每份種質(zhì)隨機(jī)取2～3 片真葉用于本研究。

表1 黃瓜種質(zhì)資源及其主要農(nóng)藝性狀Table 1 Germplasm resources and main agronomic characters of cucumber

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取與檢測(cè) 采用上海生物工程有限公司Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒（批號(hào)B518261）提取DNA，取新鮮黃瓜真葉0.5 g，經(jīng)過DNA 提取后，用1.4%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA 的完整性，再用分光光度計(jì)檢測(cè)樣本純度，保證OD260/280在1.8 以上，合格后將所有樣本稀釋，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 SSR 引物篩選 從近年來發(fā)表文獻(xiàn)上選用特異性較好的引物[16-25]，引物篩選遵循擴(kuò)增多態(tài)性原則，挑選30 對(duì)引物。先通過常規(guī)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)各引物的多態(tài)性，選取多態(tài)性較高的9 對(duì)引物（表2）。

表2 黃瓜種質(zhì)資源SSR 分子標(biāo)記檢測(cè)的引物來源及其序列Table 2 Primers for SSR molecular labeling detection of cucumber germplasm resources

1.2.3 PCR 擴(kuò)增體系 PCR 擴(kuò)增體系如下：1 μL 模板DNA（20～50 ng·μL-1），引物F（10 μmol·L-1）和引物R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，0.5 μL 混合dNTP（5 μmol·L-1），2.5 μL 含MgCl2的Taq緩沖液（10倍），0.2 μLTaq酶（5 U·μL-1），加入ddH2O 至25 μL。PCR 具體反應(yīng)采用Touch-down PCR[26]：94 ℃預(yù)變性5 min；93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 次循環(huán)；93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 次循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸，10 min；4 ℃保存。合成包含F(xiàn)AM（藍(lán)色）、HEX（綠色）、TAMRA（黑色）3 種不同熒光染料的SSR 引物，所用SSR 引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 熒光SSR 引物檢測(cè) 采用連續(xù)加樣器，吸取990 μL HIDI（甲酰胺）和10 μL LIZ-500（分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)）混合均勻，以每孔10 μL 分別加入到96 孔反應(yīng) 板 中。1200 r?min-1離 心15 s 后 每 孔再加入1 μ L 樣品，緊接著再次離心15 s，密封離心30 s 后置于PCR 儀中，98 ℃變性5 min 后立即置于冰水中冷卻，待完全冷卻后離心15 s，使用ABI 3730 XL 型DNA 分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)分析儀毛細(xì)管電泳輸出結(jié)果人工讀取峰值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并保存[27]。使用DataFormater 軟件[28]將整理的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為各相關(guān)軟件可以識(shí)別的格式，并用PopGen32 計(jì)算有效等位基因、等位基因、期望雜合度、觀測(cè)雜合度、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s 信息指數(shù)；用軟件Power Marker 3.2 統(tǒng)計(jì)多態(tài)性信息含量（PIC）和基因型數(shù)量；用UPGMA 法對(duì)22 份黃瓜種質(zhì)進(jìn)行聚類分析[29]。

1.4 DNA分子身份證構(gòu)建

參考武志江等[30]的方法，將9 對(duì)引物的擴(kuò)增帶型按從小到大順序排列，并從“1～9”依次按順序賦值，超過“9”的從小寫字母“a”開始按照字母順序繼續(xù)編碼，將未檢測(cè)出結(jié)果賦值為“0”，最后將9 位數(shù)字串聯(lián)到一起，得出9 位獨(dú)特的字符串即為該種質(zhì)的DNA 分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選

利用初步篩選的30 對(duì)SSR 引物對(duì)22 份種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步挑選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物9 對(duì)，部分SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

由表3 所示，利用9 對(duì)SSR 引物對(duì)22 份黃瓜種質(zhì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共檢測(cè)到40 個(gè)等位基因位點(diǎn)，平均每對(duì)引物檢測(cè)出4.44 個(gè)，檢測(cè)出基因型數(shù)量平均4.78 個(gè)；其中引物SSR10954 擴(kuò)增出的等位基因的數(shù)目最多，為9 個(gè)，引物CSWTAAA01 檢測(cè)出的等位基因的數(shù)目最少，為2 個(gè)；有效等位基因（Ne）的范圍為1.10～3.34，平均2.17；期望雜合度（He）的范圍為0.09～0.72，平均0.48；觀測(cè)雜合度（Ho）的范圍為0.09～0.73，平均0.29；Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）的范圍為0.09～0.70，平均0.47；Shannon’s 信息指數(shù)（I）的范圍為0.22～1.44，平均0.89；多態(tài)性信息含量（PIC）的范圍為0.09～0.66，平均0.42。9 對(duì)引物的平均多態(tài)性較好，適合進(jìn)行相關(guān)遺傳分析和分子身份證的構(gòu)建。部分種質(zhì)的熒光檢測(cè)電泳圖見圖2。

圖2 部分黃瓜種質(zhì)中熒光引物SSR10954 的SSR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 SSR amplification results of fluorescent primer SSR10954 in partial cucumber germplasms

2.3 SSR指紋圖譜的構(gòu)建

參考黃健婷等[31]的方法，對(duì)電泳后的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和整理，人工讀出等位基因條帶，建立22 份黃瓜種質(zhì)的DNA 指紋圖譜（表4），同時(shí)制作數(shù)字指紋圖譜。將表4 中的條帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字0、1，其中“1”代表有擴(kuò)增條帶，“0”代表在相應(yīng)位點(diǎn)無條帶，“9”代表未檢測(cè)出結(jié)果，同時(shí)按引物編號(hào)順序和擴(kuò)增條帶片段從小到大順序，組成一串?dāng)?shù)字，構(gòu)成數(shù)字指紋圖譜[32]（表5）。

表5 22 份黃瓜種質(zhì)的數(shù)字指紋圖譜Table 5 Digital fingerprint of 22 cucumber germplasms

2.4 構(gòu)建分子身份證

按照表4 所示的引物序列重新排列，將每對(duì)引物在不同樣品上擴(kuò)增得到的帶型按照由少到多的順序排列并將其編碼串聯(lián)得到帶型編號(hào)（表6），進(jìn)一步得出22 份黃瓜種質(zhì)的分子身份證（表7）。其中，奇山壓爬架和大禹爬滿地兩個(gè)品種共用一套分子身份證，具體品種差別需要進(jìn)一步從基因組分析堿基差異，進(jìn)而才能驗(yàn)證是否存在差異和親緣關(guān)系。由表7 可見，21 份黃瓜種質(zhì)的分子身份證均不相同，9 對(duì)SSR 引物能夠區(qū)分21 個(gè)樣本，表明采用的9 對(duì)SSR 引物是合理且有效的。

表6 9 對(duì)引物的擴(kuò)增帶型編號(hào)Table 6 Amplified band number of 9 pairs of primers

按照《商品二維碼》和《追溯二維碼技術(shù)通則》[33-34]的要求，采用二維碼快速生成器生成22 份黃瓜種質(zhì)分子身份證的二維碼（表7）。

2.5 不同種質(zhì)遺傳關(guān)系聚類分析

使用NTSYSpc2.0 計(jì)算不同黃瓜種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（表8）。由表8 可知，22 份黃瓜種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.25～1.00，其中，奇山壓趴架（7）和大禹爬滿地（20）之間的遺傳相似系數(shù)最大，為1.00，表明二者幾乎沒有遺傳差異，具體差別需要進(jìn)一步分析；湘園813（14）和瀏陽(yáng)白皮（13）之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.25，說明二者的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表8 22 份樣本間的遺傳相似系數(shù)Table 8 The variance range of genetic similarity coefficients among 22 samples

根據(jù)9 對(duì)引物對(duì)22 份種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果，用NTSYSpc2.0 分析得出22 份黃瓜種質(zhì)的遺傳關(guān)系樹狀圖（圖3）。分析表明，當(dāng)相關(guān)系數(shù)為0.79 時(shí)，將22份黃瓜種質(zhì)分成六類。第Ⅰ類包含7 個(gè)黃瓜品種，第Ⅱ類包含6 個(gè)黃瓜品種，第Ⅲ類有3 個(gè)品種，第Ⅳ類只有奇山翡翠F1，第Ⅴ類有4 個(gè)品種，第Ⅵ類只有玉女。在第Ⅰ和第Ⅱ類中主要是山東省（尤其是膠東地區(qū)）主栽的黃瓜雜交品種，有著相同或相似的父母本，其中奇山壓趴架和大禹爬滿地的性狀和生長(zhǎng)特點(diǎn)有著比較高的相似度，遺傳差異極??；第Ⅲ類中的3 個(gè)品種，其農(nóng)藝性狀比較相似；第Ⅴ類中的3 個(gè)品種，瀏陽(yáng)白皮、蔬研十二號(hào)和上栗白黃瓜主要是湖南省當(dāng)?shù)仉s交品種，另外一個(gè)湖南省品種湘園813 歸類在第Ⅲ類里，推測(cè)是其育種所采用的父母本與第Ⅲ類黃瓜有著較近的親緣關(guān)系。第Ⅳ類中的奇山翡翠F1 推測(cè)可能是由湖南省品種雜交而成。第Ⅵ類中的玉女雖然屬于山東省培育的黃瓜品種，但與其他幾類的黃瓜親緣關(guān)系皆較遠(yuǎn)。

圖3 基于9 對(duì)SSR 引物的黃瓜種質(zhì)資源聚類分析Fig.3 Cluster analysis of cucumber germplasm resources based on 9 pairs SSR primers

3 討論與結(jié)論

煙臺(tái)地區(qū)的黃瓜栽培歷史悠久，且地方品種特點(diǎn)明顯，種類多樣，如何對(duì)當(dāng)?shù)刂髟云贩N進(jìn)行分類、鑒定，進(jìn)而培育優(yōu)良的地方品種是當(dāng)前黃瓜育種工作的重點(diǎn)。

SSR 分子標(biāo)記由于其具有檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確性高、效率高，多用于種質(zhì)遺傳多樣性的鑒定，在指紋圖譜和分子身份證構(gòu)建上已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。吳仕蔓等[35]通過擴(kuò)增帶型分析，構(gòu)建了22 份柚類種質(zhì)的分子身份證，包括12 條信息獨(dú)特的身份證。唐梅等[36]以48 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了24 個(gè)香稻品種的指紋圖譜。李喬喬等[37]采用37 對(duì)SSR 引物對(duì)33 份多胚甜菜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，將其分成兩大類，說明了該分子標(biāo)記技術(shù)的可靠性。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)同樣在黃瓜的遺傳多樣性分析中有著廣泛的應(yīng)用，崔洪宇等[38]利用其中的24 對(duì)SSR 引物構(gòu)建的指紋圖譜可有效區(qū)分所有16 個(gè)供試品種。王蕾等[2]基于SSR 分子標(biāo)記技術(shù)篩選出17 對(duì)引物，將32 份黃瓜種質(zhì)聚為5 類。史建磊等[39]利用11 對(duì)SSR 特異性引物對(duì)黃瓜自交系進(jìn)行聚類分析，將48 份黃瓜自交系聚為4 個(gè)類群。筆者篩選出9 對(duì)SSR 引物，利用其對(duì)22 份煙臺(tái)主栽黃瓜種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，9 對(duì)引物共篩選出40 個(gè)等位基因，高于史建磊等[39]研究的結(jié)果數(shù)，與王蕾等[2]研究中引物多態(tài)性較為相近，說明本研究所中采用的SSR 引物多態(tài)性良好，可以作為22份種質(zhì)的分類依據(jù)。通過建立的黃瓜聚類分析圖表明，遺傳相似系數(shù)近的種質(zhì)具有類似的性狀特征。在相關(guān)系數(shù)為0.79 時(shí)，可將22 份種質(zhì)分為六類，I 類群的春秋翠玉、奇山白天使、金棚白玉、碧秀、翠玉白葉三和中科白玉F1 均為短棒狀，被聚為一類；V 類群的瀏陽(yáng)白皮、蔬研十二號(hào)和上栗白黃瓜均為中長(zhǎng)棒狀，蔬研十二號(hào)和上栗白黃瓜為黃綠色。聚類分析與性狀特征分類基本符合，與前人[3-4]結(jié)論有一定的相似之處，可以作為依據(jù)進(jìn)一步明確煙臺(tái)地區(qū)現(xiàn)有黃瓜品種間的親緣關(guān)系。

筆者的研究為煙臺(tái)地區(qū)黃瓜的種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)、育種親本選育提供了理論和技術(shù)支撐，對(duì)于保障黃瓜種質(zhì)市場(chǎng)良好發(fā)展以及彌補(bǔ)煙臺(tái)地區(qū)黃瓜的種質(zhì)資源研究、利用和評(píng)價(jià)方法欠缺，為實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新和推動(dòng)黃瓜育種進(jìn)程具有重要意義。但有關(guān)SSR 分子標(biāo)記后續(xù)應(yīng)開發(fā)篩選更多的引物，增加選用的種質(zhì)數(shù)量，進(jìn)一步推動(dòng)種質(zhì)資源的研究利用。