豬流行性腹瀉病毒檢測方法的研究進展

文│吳紀芬（山東省莒南縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

近年來，豬流行性腹瀉病毒對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重影響。為了有效防控疫情，病毒檢測方法取得了顯著的進展。文章從流行病學、病毒基因組結(jié)構(gòu)、病原學檢測方法、分子生物學、免疫學和血清學等方面對豬流行性腹瀉病毒檢測方法進行概述。實時熒光定量P C R、R TLAMP等分子生物學方法具有高靈敏度和特異性，適用于病原核酸檢測。免疫組織化學、膠體金免疫層析和ELISA等免疫學方法則用于檢測病毒抗原或抗體，具有操作簡便、快速等特點。血清中和試驗作為一種評估抗體水平的方法，可評估動物的免疫狀態(tài)。盡管各種檢測方法都具有優(yōu)缺點，但多種技術的結(jié)合與優(yōu)化可為豬流行性腹瀉病毒的準確檢測和防控提供有力支持。

一、豬流行性腹瀉病流行病學

豬流行性腹瀉病最早于1971年在英格蘭報道，于1978年首次分離得到病毒毒株，命名為CV777毒株。此后在德國、荷蘭、法國、捷克、匈牙利等國家也相繼報道有豬流行性腹瀉病的發(fā)生。1982年，日本首次發(fā)現(xiàn)并報道該病，隨后，韓國、印度等亞洲國家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并報告了該病。在中國，1973年首次報告了豬流行性腹瀉病，而1982年成功分離出了病毒毒株。隨后經(jīng)過一系列的病原調(diào)查，于2010年，該疾病在我國大規(guī)模流行，新生仔豬死亡率高達50%～100%，并且出現(xiàn)毒力比CV777毒株毒力更強的毒株，導致我國養(yǎng)豬業(yè)損失慘重。對此要借助檢測手段對該病進行檢測，及早、及時檢測，并通過有效的疫病防控手段加以防控，減少該病帶來的損失。

二、豬流行性腹瀉病毒基因組結(jié)構(gòu)

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）的α-冠狀病毒屬。PEDV的基因組是一個單鏈正鏈RNA，長度約為28000個核苷酸。病毒基因組具有典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)，包括以下幾個主要基因：5'端的非結(jié)構(gòu)蛋白基因（如ORF1a和ORF1b）、結(jié)構(gòu)蛋白基因和3'端的非結(jié)構(gòu)蛋白基因。其中結(jié)構(gòu)蛋白基因包括：S（Spike）蛋白：S蛋白是病毒表面的突刺狀結(jié)構(gòu)，負責病毒的吸附和進入宿主細胞。S蛋白也是決定病毒毒力、抗原性和宿主范圍的關鍵因素。E（Envelope）蛋白：E 蛋白是一個小型跨膜蛋白，參與病毒組裝和釋放過程。N（Nucleocapsid）蛋白：N蛋白與病毒RNA基因組結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，保護病毒基因組穩(wěn)定性。M（Membrane）蛋白參與病毒的組裝，同時可誘導宿主產(chǎn)生α干擾素和特異性抗體。對此M蛋白與N蛋白也可作為豬流行性腹瀉病毒的分子生物學及血清學檢測對象。而E蛋白因基因序列較小，被稱為是小分子外膜蛋白。且E蛋白基因序列高度保守，由于基因序列過小難以進行研究，且難以得到精準的結(jié)果，因此，目前針對E蛋白有關的檢測方法鮮有報道。

三、豬流行性腹瀉病原學檢測方法

1.病毒分離培養(yǎng)鑒定法。病毒的分離培養(yǎng)常作為病毒診斷技術的黃金標準，也是畜禽病毒傳染病常用的檢測手段，極少量的病毒也可以通過病毒的分離培養(yǎng)檢測出來。該方法主要包括以下步驟。樣品收集：收集疑似感染豬流行性腹瀉病的仔豬糞便、腸內(nèi)容或組織樣品。病毒接種：將處理后的樣品接種到敏感的細胞系上，如Vero細胞。在適宜的條件下（如37℃、5% CO2環(huán)境）進行培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)細胞病變。病變觀察：在一定的時間內(nèi)觀察細胞的形態(tài)變化。若出現(xiàn)細胞病變現(xiàn)象，如細胞融合、變圓、脫落等，說明可能存在病毒感染。病毒鑒定：對病變細胞進行進一步檢測，以確定病毒種類，可以通過實驗室技術如間接免疫熒光（IFA）、聚合酶鏈反應（PCR）、ELISA等方法進行。病毒分離純化：若實驗結(jié)果表明存在豬流行性腹瀉病毒，可以通過多次傳代培養(yǎng)來純化病毒株。病毒分離培養(yǎng)鑒定法是一種基本且常用的病原檢測方法。但這種方法操作煩瑣、耗時較長。因此，在實際應用中，研究者通常會結(jié)合其他快速、高效的檢測方法進行病原學檢測。

2.免疫電鏡檢查法。是一種將抗原-抗體反應與電子顯微鏡相結(jié)合的檢測方法。在豬流行性腹瀉病原學檢測中，免疫電鏡檢查法可以直接觀察病毒顆粒與特異性抗體的結(jié)合，從而實現(xiàn)對病毒的定性分析。這種方法具有較高的靈敏度和特異性。免疫電鏡檢查法步驟包括收集疑似感染豬流行性腹瀉病的樣品并處理、用化學固定劑固定樣品、將固定樣品制成適于電鏡觀察的超薄切片、用特異性抗體與金標記的二抗混合孵育切片、洗滌切片并染色及使用透射電子顯微鏡觀察切片，判斷病毒顆粒與金標記抗體復合物結(jié)合情況。

四、豬流行性腹瀉病毒分子生物學檢測技術

1.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）。該技術應用于病毒特定RNA片段的體外擴增，結(jié)合了反轉(zhuǎn)錄（RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA）和聚合酶鏈反應（cDNA的擴增），從而實現(xiàn)了對特定RNA序列的高效檢測。該方法操作簡單、特異性強、敏感性高，是檢測核酸的最佳方法，也是實驗室檢測中常用的檢測技術，該方法主要是通過對豬流行性腹瀉病毒特定基因引物設計，建立檢測豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR的方法，能夠根據(jù)特異性引物擴增出來電泳后出現(xiàn)的條帶大小，區(qū)分出不同的毒株。

2.熒光RT-PCR方法。熒光RTPCR技術是通過常規(guī)RT-PCR技術發(fā)展起來的核酸檢測技術，其靈敏性更高、速度更快、特異性更好，可直接觀察擴增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測產(chǎn)物，減少了假陽性出現(xiàn)的風險，而常用的方法有染料法和探針法兩種。通過設計病毒的一對特異性引物，建立熒光PCR檢測方法，可以特異性地檢測豬流行性腹瀉病毒；其次還可以建立多重實時熒光定量PCR方法，可以使用該方法對不同病毒進行同時檢測，該方法特異性好，不會出現(xiàn)交叉反應。

3 . 環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）。該技術具有高效、快速、特異性強等優(yōu)勢，該技術在恒溫條件下進行無需熱循環(huán)儀，因此具有較高的實用性。主要包括以下步驟：設計特異性引物：為豬流行性腹瀉病毒的特定基因區(qū)域設計一組特異性引物，通常包括兩個內(nèi)部引物和兩個外部引物。反轉(zhuǎn)錄：通過反轉(zhuǎn)錄酶將病毒的RNA轉(zhuǎn)換為cDNA。環(huán)介導等溫擴增：在單一恒溫條件下利用特異性引物和DNA聚合酶對cDNA進行擴增。擴增過程中，引物和模板DNA之間形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)快速、高效的擴增。檢測擴增產(chǎn)物：擴增完成后，可以通過凝膠電泳、熒光染料結(jié)合或其他方法檢測擴增產(chǎn)物，從而判斷樣品中是否含有豬流行性腹瀉病毒。

4.基因芯片技術。該技術是一種高通量、高靈敏度的檢測方法，適用于對多種病毒和基因同時進行檢測和分析。芯片技術具有高靈敏度，最低檢測限為106拷貝/微升，特異性也很高，不存在交叉反應。制備好的芯片在4℃條件下至少可以保存2個月。

五、豬流行性腹瀉病免疫學檢測方法

1.免疫熒光法（IF）。免疫熒光法（IF）是一種利用熒光標記的抗體檢測病毒抗原的方法。免疫熒光法用于豬流行性腹瀉病毒檢測，步驟如下：制備感染豬薄片或細胞涂片；用化學固定劑和滲透劑處理樣品；用熒光素標記抗體孵育樣品；洗去未結(jié)合抗體；用熒光顯微鏡觀察熒光信號。此方法靈敏、特異，可快速檢測病毒抗原，助力疫情防控。

2.免疫組織化學（IHC）。免疫組織化學檢測豬流行性腹瀉病毒步驟：制備組織切片、抗原修復、阻斷非特異結(jié)合、抗體孵育、二抗孵育、洗滌、染色、顯微鏡觀察。此方法靈敏度高、特異性強，能準確快速檢測病毒抗原，助力疫情防控。

3.膠體金免疫層析技術。膠體金免疫層析技術是一種簡便、快速的豬流行性腹瀉病毒檢測方法。主要步驟包括制備膠體金-抗體復合物，制作試紙，處理樣品，進行試紙浸潤，判定結(jié)果。此技術操作簡單、速度快、成本低，適用于現(xiàn)場篩查。但靈敏度和特異性相對較低，陽性結(jié)果需進一步實驗室檢測確認。

六、豬流行性腹瀉病血清學檢測技術

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。該方法是一種血清學檢測方法，適用于豬流行性腹瀉病毒抗體檢測。其操作步驟包括血清樣本收集，抗原制備與吸附，阻斷非特異性結(jié)合，樣品孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌、底物顯色、終止反應和光密度測定。ELISA具有較高的靈敏度和特異性，可為疫情防控和免疫評估提供準確、快速的檢測結(jié)果。

2.血清中和試驗。血清中和試驗（SNT）用于檢測豬流行性腹瀉病毒特異性中和抗體。步驟包括采集血清，稀釋，制備病毒，孵育混合物，接種細胞，觀察病變，計算滴度。SNT具有高靈敏度和特異性，但操作煩瑣、耗時長且需細胞培養(yǎng)條件。

七、結(jié)語

豬流行性腹瀉病的檢測診斷是豬流行性腹瀉病防控的關鍵，對此，根據(jù)不同的樣品、場景等使用不同的檢測技術，可以快速、準確、有效地檢測出生豬及環(huán)境是否感染豬流行性腹瀉病，以便及時、有效地提出有針對性的防控措施，保證生豬養(yǎng)殖的健康發(fā)展。