基于“質(zhì)-量”雙標的五味子質(zhì)量分析方法研究

秦 妍，李天嬌, 2, 3，包永睿, 2, 3，王 帥, 2, 3，孟憲生, 2, 3*

基于“質(zhì)-量”雙標的五味子質(zhì)量分析方法研究

秦 妍1，李天嬌1, 2, 3，包永睿1, 2, 3，王 帥1, 2, 3，孟憲生1, 2, 3*

1. 遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600 2. 遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600 3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600

建立以對照藥材為基準物質(zhì)的定性和不依賴多種對照品定量的五味子藥材“質(zhì)-量”雙標控制方法。采用HPLC技術(shù)建立五味子對照藥材的特征圖譜，將其與供試藥材圖譜進行比對來辨別藥材的真?zhèn)?，即“質(zhì)”；采用“五味子甲素”作為內(nèi)標物質(zhì)對特征峰化學成分進行相對定量來區(qū)分藥材的優(yōu)劣，即“量”。建立的五味子藥材“質(zhì)-量”分析方法符合方法學考察要求，各供試藥材與對照藥材的相似度均大于0.97；規(guī)定了五味子藥材特征峰化學成分相對含量下限。該方法不依賴多種對照品，能清晰、快速地判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，彌補目前五味子藥材質(zhì)量控制的不足，且操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定、可靠。不僅完善中藥材質(zhì)量控制體系，還能減輕中藥企業(yè)經(jīng)濟負擔，為推動中醫(yī)藥事業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出貢獻。

五味子；對照藥材；質(zhì)量控制；特征圖譜；五味子甲素；五味子醇甲；五味子醇乙；五味子酯甲；五味子酯乙；五味子酯丙

五味子用藥歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》被列為上品，是常見的一味滋補藥，為木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實[1]，其產(chǎn)地主要集中在東北3省。果實呈不規(guī)則球形或扁球形，直徑5～8 mm；表面呈紅色、紫紅色或暗紫紅色[2]?，F(xiàn)階段，臨床用于治療久咳虛喘、失眠盜汗、心悸失眠、津傷口渴等癥狀。五味子中的木質(zhì)素類化合物含量相對較多，且有較強的生物活性，臨床藥理作用相對顯著[3-6]?，F(xiàn)今，五味子藥材質(zhì)量控制方法包括藥典含量測定法以及指紋圖譜與多指標含量聯(lián)合測定法；以上方法均具有靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，能夠為控制五味子藥材質(zhì)量提供量化數(shù)據(jù)，但存在著單一指標不能反映藥材整體特征、多指標含量測定依賴于多種對照品且某些指標成分不能反映藥效、指紋圖譜只能模糊地評價藥材相似性不能清晰地判斷供試品真?zhèn)蝺?yōu)劣的不足。因此在評價藥材質(zhì)量時并不能全面反映五味子藥材的整體質(zhì)量，具有一定的局限性。且中藥復雜體系質(zhì)量評控技術(shù)難度和高額成本給中藥企業(yè)帶來了巨大的壓力，因而對中藥臨床合理用藥和臨床療效提升的指導和支持作用一直難以體現(xiàn)。

針對上述問題，本實驗提出了五味子藥材的“質(zhì)-量”雙標控制方法，以對照藥材為基準物質(zhì)構(gòu)建特征圖譜，并以可代表五味子藥效的有限個代表性成分作為特征峰，評價對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，可以用于判斷五味子的真?zhèn)?；選用保留時間穩(wěn)定且價格低廉易獲得的內(nèi)標物質(zhì)作為定量評價指標，開展基于內(nèi)標物質(zhì)的特征峰化學成分相對定量研究，通過內(nèi)標物質(zhì)化學成分準確定量，計算供試藥材特征峰化學成分的相對含量，可以用于判斷五味子的優(yōu)劣?；凇百|(zhì)-量”雙標的五味子質(zhì)量分析方法可有效解決五味子有效成分同時快速測定和中藥復雜體系質(zhì)量評控成本高的問題。該方法穩(wěn)定性、精密度良好，可以彌補目前質(zhì)量控制方法的不足，以期為中藥材（飲片）質(zhì)量提升提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；Agilent 6550 Q-TOF-MS質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；CP225D電子分析天平（德國Sarto-rius分析天平有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

五味子對照藥材（批號120922-201610，中國食品藥品檢定研究所）。對照品五味子醇甲（批號110857-201916）、五味子酯甲（批號111529-201706）、五味子甲素（批號110764-201915），均由中國食品藥品檢定研究所提供；五味子醇乙（批號B21915，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、五味子酯乙（批號B22917，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、五味子酯丙（批號B21506，質(zhì)量分數(shù)≥95%），均由上海源葉生物有限公司提供。10批五味子樣品，詳細信息見表1，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學張慧教授鑒定，均為木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；水（純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）。

表1 10批五味子樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 基于對照藥材五味子藥材定性研究

2.1.1 供試品溶液的制備 取五味子對照藥材粉末0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率20 kHz）處理15 min，放至室溫，補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液揮干，70%甲醇定容至5 mL量瓶，搖勻，過0.22 μm濾膜，作為參照物溶液；取供試藥材粉末（過4號篩）0.5 g，按上述方法制成供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子酯丙對照品，精密稱定，加甲醇制成含五味子醇甲34.11 μg/mL、五味子甲素51.34 μg/mL、五味子醇乙50.98 μg/mL、五味子酯乙53.09 μg/mL 、五味子酯丙62.51 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，5%～23% B；3～5 min，23%～50% B；5～17 min，50%～60% B；17～22 min，60%～65% B；22～25 min，65%～95% B；25～30 min，95%～100% B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；DAD檢測器波長230 nm；進樣量5 μL。

2.1.4 特征圖譜的建立 將參照物溶液和供試品溶液，每份樣品平行2次，按色譜條件依次進樣檢測，記錄色譜圖。將230 nm波長下的圖譜數(shù)據(jù)由分析檢測儀器中導入中國藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件（2012.130727版本），獲得10批五味子藥材的HPLC特征圖譜，見圖1。以五味子對照藥材的圖譜為參照譜圖，使用中位數(shù)進行自動匹配，加以多點校正，確定共有色譜峰；共標定13個共有峰，其中13號峰穩(wěn)定性、重復性、分離度好，故以其為參照峰（S）；確定共有色譜峰；將共有模式與對照藥材特征圖譜進行比對，見圖2。供試品色譜中應呈現(xiàn)13個特征峰，并應與對照藥材色譜圖中的13個特征峰保留時間相對應，見表2。

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液進行測定，各主峰與雜質(zhì)峰分離度良好，專屬性強，見圖3。

2.2.2 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（S1）5 μL，按“2.1.3”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算RSD。各色譜峰相對保留時間RSD＜0.60%，相對峰面積RSD＜1.58%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液（S1）5 μL，按“2.1.3”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣6次檢測，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算RSD。各色譜峰相對保留時間RSD＜1.59%，相對峰面積RSD＜2.49%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 10批五味子供試藥材的HPLC疊加圖譜

圖2 對照藥材特征圖譜及供試藥材共有模式

4-五味子醇甲 7-五味子醇乙 10-五味子酯甲 11-五味子酯乙 12-五味子酯丙 13-五味子甲素

表2 特征峰保留時間及相對保留時間

2.2.4 重復性試驗 按供試品溶液制備方法平行制備6份S1供試樣品，按“2.1.3”項下色譜條件，分別進樣檢測，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算RSD。各色譜峰相對保留時間RSD＜0.92%，相對峰面積RSD＜1.69%，表明方法重復性良好。

2.3 相似度評價

采用中國藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”（2012.130727版本）進行數(shù)據(jù)處理，該軟件利用夾角余弦法計算每個色譜圖與對照藥材圖譜相比較的相似度。以五味子對照藥材和供試藥材特征峰的相似度明確五味子藥材真?zhèn)巍９┰囁幉呐c對照藥材的相似度均大于0.973。相似度計算結(jié)果見表3。

2.4 特征峰化學成分解析

采用Q-TOF-MS技術(shù)，通過分析化合物的保留時間、一級離子質(zhì)荷比以及二級離子碎片信息，并與相關(guān)文獻報道信息進行匹配鑒定特征峰。

在初步采用Agilent-1260Ⅱ高效液相色譜儀利用相對保留時間與對照品比對的基礎(chǔ)上，采用Agilent 6550 Q-TOF-MS質(zhì)譜儀，進行質(zhì)譜分析，運用Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件，通過對照品比對的方法對正離子模式進行化學成分解析，進一步明確特征峰的化學成分。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0～2 min，5% B；2～4.5 min，5%～25% B；4.5～6 min，25%～60% B；6～11.5 min，60%～85% B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子模式為電噴霧離子源（Dual AJS ESI），采用正離子檢測模式，毛細管電壓3.5 kV，干燥氣體體積流量（drying gas flow）為13 mL/min，干燥氣體溫度（drying gas temp）為250 ℃，鞘氣氣體溫度（sheath gas temp）為350 ℃，霧化器壓力（neulizer pressure）為45 kPa，碎裂電壓（fragmentor）為125 V，二級質(zhì)譜碰撞電壓20 eV，采集范圍/100～1000。

采用auto MS/MS模式，利用對照品比對及數(shù)據(jù)庫查詢等方法對特征峰化學成分進行解析。正離子模式鑒定出了6個化學成分，正離子條件下BPC圖見圖4，具體鑒定鑒定結(jié)果見表4。

2.5 基于內(nèi)標物質(zhì)的特征峰化學成分相對定量研究

2.5.1 線性關(guān)系試驗 配制五味子甲素的6個質(zhì)量濃度溶液，按色譜條件，分別進樣檢測，以質(zhì)量為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線并進行線性回歸，得到線性回歸方程=1 845.3－0.985 6、＝0.999 8和線性范圍0.845 6～27.059 2 μg。結(jié)果表明，進樣量范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

4-五味子醇甲 7-五味子醇乙 10-五味子酯甲 11-五味子酯乙 12-五味子酯丙 13-五味子甲素

表4 正離子模式特征峰化學成分解析結(jié)果

*該化合物是由對照品進行指認

*This compound was identified using reference standards

2.5.2 精密度試驗 同“2.2.2”項下方法，計算五味子甲素相對峰面積RSD值均小于1.50%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 同“2.2.3”項下方法，計算五味子甲素相對峰相對峰面積RSD值均小于2.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗 同“2.2.4”項下方法，計算五味子甲素相對峰相對峰面積RSD值均小于1.89%，表明方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱定五味子藥材粉末6份，分別精密加入五味子甲素對照品適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，分別進樣檢測，計算得到五味子甲素的平均加樣回收率為98.69%，RSD為2.51%。

2.5.6 含量測定 根據(jù)《中國藥典》2020年版五味子“含量測定”項下方法檢測，10批產(chǎn)地供試品均符合藥典規(guī)定。14號峰五味子甲素分離效果好、峰面積大、保留時間適中、標準品價格低廉，故以其作為定量評價指標，開展基于特征峰的五味子藥材相對定量研究。取五味子供試品藥材，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液和濃度為2.706 mg/mL的五味子甲素對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件分析測定五味子甲素含量，結(jié)果見表5。計算每個供試品中特征峰化學成分的相對含量[特征峰化學成分相對含量＝特征峰峰面積×(五味子甲素含量/五味子甲素峰面積)]，結(jié)果見表6。取“平均數(shù)－標準差”作為特征峰化學成分相對于內(nèi)標物質(zhì)化學成分的相對含量下限，供試藥材根據(jù)此方法測得的特征峰相對含量不低于該含量下限[7]。

3 討論

中藥化學成分復雜、品種來源寬泛，導致中藥質(zhì)量良莠不齊。完善中藥質(zhì)量控制標準，一直被認為是制約我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重點、難點問題。目前，《中國藥典》2020年版中質(zhì)量控制項對多成分指標進行測定的中藥品種已有上百種，且有些對照品價格昂貴，加大了企業(yè)生產(chǎn)和民眾的用藥成本。

表5 內(nèi)標物質(zhì)的準確定量結(jié)果

表6 基于內(nèi)標物質(zhì)的特征峰相對定量結(jié)果

五味子主要分布于黑龍江、吉林和遼寧的小興安嶺和東部山地及其邊緣丘陵地帶，中醫(yī)藥傳統(tǒng)經(jīng)驗認為道地的五味子產(chǎn)于東北，且東北產(chǎn)五味子木脂素成分含量高、質(zhì)量優(yōu)。而現(xiàn)如今市場上的山西榆社產(chǎn)五味子木脂素成分含量低，容易造成鑒別困難與臨床用藥混亂的現(xiàn)象，影響中藥五味子的臨床合理使用。目前，中藥材（飲片）質(zhì)量控制方法主要包括單指標含量測定法、多指標含量測定法和指紋圖譜與含量測定結(jié)合法，以上方法雖能夠為控制中藥材（飲片）質(zhì)量提供量化數(shù)據(jù)，但存在著單一指標不能反映藥材整體特征、多指標含量測定依賴于多種對照品且某些指標成分不能反映藥效、指紋圖譜只能模糊地評價藥材相似性不能清晰地判斷供試品真?zhèn)蝺?yōu)劣的不足。

為解決以上問題，本研究創(chuàng)新研究思路，不依賴多種對照品，以價格低廉易獲得的對照藥材為基準物質(zhì)的定性和不依賴多種對照品定量的五味子藥材“質(zhì)-量”雙標控制方法。通過構(gòu)建五味子對照藥材及10個不同產(chǎn)地五味子供試藥材的特征圖譜，以對照藥材為基準物質(zhì)，評價對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，可以用于判斷五味子藥材的真?zhèn)?，即“質(zhì)”；同時準確定量1種內(nèi)標物質(zhì)化學成分，計算五味子藥材其余各特征峰的相對含量，確定的各特征峰相對含量的下限能夠區(qū)分五味子藥材優(yōu)劣，即“量”。本研究所提出的五味子藥材的“質(zhì)-量”控制方法能夠有效判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，形成一個科學、可控的中藥質(zhì)量控制體系，旨在為中藥質(zhì)量控制和中藥產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展提供探索性解決方案。

本實驗采用質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)指認出10個化學成分，其中有8種均為木脂素類成分。五味子醇甲、五味子醇乙可增強小鼠肝細胞抵抗CCl4毒性的能力，從而對肝臟起到保護作用[8]；五味子酯甲和五味子酯乙對缺氧復氧心肌細胞具有保護作用，同時通過調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/ARE抗氧化通路能夠改善小鼠的疲勞作用[9]；五味子酯丙通過抑制A549人肺癌細胞的G0/G1細胞周期，發(fā)揮明顯的抗增殖作用[10]；五味子甲素對逆轉(zhuǎn)錄酶活性有一定的抑制作用[11]；五味子乙素作為一種強效的抗自由基活性劑，有助于提高大鼠皮膚的谷胱甘肽[12]；五味子丙素在研究中具有顯著的抗炎、抗病毒作用[13]。上述內(nèi)容與五味子的保肝養(yǎng)心功效相關(guān)，從而夠進一步證明本方法特征峰的選擇能夠較科學地闡述五味子的藥效。

本實驗所收集的市面所售不同產(chǎn)地供試品，旨在建立基于“質(zhì)-量”雙標的五味子質(zhì)量分析方法，所收集的五味子供試藥材與五味子對照藥材的相似度均大于0.97，說明所收集的五味子供試藥材的特征峰化學成分基本一致，但僅采用10批不同產(chǎn)地的藥材規(guī)定特征峰相對含量下限，缺乏全面性，因此，需要更進一步大量收集不同產(chǎn)地、不同批次的藥材，完善該套方法，形成一個科學、可控的中藥質(zhì)量控制體系。目前，《中國藥典》2020年版中質(zhì)量控制項對多成分進行測定的品種已有上百種，且其中有些對照品價格昂貴，給企業(yè)帶來了沉重的工作和經(jīng)濟負擔。本方法使用價格低廉的對照藥材和1種內(nèi)標物質(zhì)，滿足藥材多項質(zhì)量控制項的同時減輕了企業(yè)的經(jīng)濟壓力，以期推動中醫(yī)藥事業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on quality analysis method ofbased on “quality-quantity” double standard

QIN Yan1, LI Tian-jiao1, 2, 3, BAO Yong-rui1, 2, 3, WANG Shuai1, 2, 3, MENG Xian-sheng1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China 2. Liaoning Multi-dimensional Analysis of Traditional Chinese Medicine Technical Innovation Center, Dalian 116600, China 3. Liaoning Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory, Dalian 116600, China

To establish a “quality-quantity” double standard control method for Wuweizi (), which is qualitative based on the reference traditional Chinese medicinal materials (TCMM) as standard substances and quantitative without relying on a variety of reference substances.The characteristic spectrum of the reference TCMM ofwas established by HPLC technology, and it was compared with the spectrum of the test TCMM to identify the authenticity of the medicinal material, that is, “quality”; “Schisandrin A” was used as the internal standard substance to relatively quantify the chemical composition of the characteristic peaks to distinguish the quality of medicinal materials, that is, “quantity”.The established “quality-quantity” analysis method ofmet the requirements of the methodological investigation, and the similarity between the tested TCMM and the reference TCMM was greater than 0.97; the lower limit of the relative content of the chemical components of the characteristic peaks ofwas specified.The method can judge the authenticity of medicinal materials clearly and quickly without many reference substances, and make up for the lack of quality control of. The operation is simple, and the results are stable and reliable. It will not only improve the quality control system of TCMM, but also reduce the economic burden of traditional Chinese medicine enterprises and contribute to the sustainable development of traditional Chinese medicine.

; reference traditional Chinese medicinal materials; quality control; characteristic chromatogram; schisandrin A; schisandrin; schisandrol B; schisantherin A; schisantherin B; schisantherin C

R286.2

A

0253 - 2670(2023)22 - 7300 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.004

2023-05-06

遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（LT2017015）

秦 妍，女，碩士研究生，主要從事藥物分析研究。Tel: 18943541576 E-mail: 1840956602@qq.com

通信作者：孟憲生，男，博士生導師，主要從事藥效物質(zhì)組學和作用機制整合研究。E-mail: mxsvvv@126.com

[責任編輯 時圣明]