光動力殺菌技術(shù)及其殺滅食源性有害微生物的研究進(jìn)展

鄭雙芝,王曉迪,張蕾,朱軍莉,陸海霞*

1(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,浙江 杭州,310018)2(浙江工商大學(xué) 食品生物工程研究所,浙江 杭州,310018)

食源性疾病是人類長期面對的公共衛(wèi)生難題之一。微生物污染易引起食源性疾病爆發(fā),嚴(yán)重影響人們正常的生活節(jié)奏、阻礙各國經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道[2],全球每年約有42萬人因食源性疾病而死亡。攝入細(xì)菌(如沙門氏菌、單核增生李斯特菌等)、真菌(如黃曲霉菌等)、病毒(如諾如病毒、輪狀病毒等)、寄生蟲(如弓形蟲、牛帶絳蟲等)等污染的食物會引起疾病,全球每年因此生病的人數(shù)多達(dá)6億[2-3]。在我國,大多數(shù)食源性疾病由細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等)引起,食品安全問題不容小覷[4]。另外,由腐敗菌導(dǎo)致的食品腐敗浪費(fèi)也是世界普遍存在的巨大挑戰(zhàn)[5]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的一項(xiàng)研究顯示,供人類食用的糧食有1/3(13億t/年)因腐敗而損失浪費(fèi)[6]。

目前,熱處理是食品工業(yè)中使用最廣泛的微生物滅活方法。然而,熱加工常會破壞食品品質(zhì),包括風(fēng)味、色澤、質(zhì)地、營養(yǎng)價(jià)值等。光動力殺菌技術(shù)(photodynamic anti-microbial technology,PDAT)是一種基于光源、光敏劑和分子氧相結(jié)合的新型非熱殺菌技術(shù)[7],其殺菌作用首次報(bào)道于1984年[8]。PDAT的殺菌機(jī)理是當(dāng)分子氧存在時(shí),光敏劑可被特定波長的光源所激發(fā),而后產(chǎn)生一系列以單線態(tài)氧(1O2)為主的活性氧(reactive oxygen species,ROS),通過持續(xù)的氧化損傷來破壞菌體中核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等生物大分子,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。光敏劑一般具有組織選擇性,能穿透并積累于生長旺盛的腫瘤細(xì)胞或微生物中而不破壞正常組織[10]。由于PDAT的多靶點(diǎn)作用模式,其靶標(biāo)菌不易產(chǎn)生耐藥性[11]。同時(shí),PDAT具有廣譜滅菌、耗能低、無毒副作用、殺菌速度快等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。因此,PDAT有望成為食品非熱殺菌處理的新技術(shù)。

本文主要對PDAT在食品保鮮領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,包括光敏劑、光源的分類、殺菌效果與作用機(jī)理及其在不同種類食品中的應(yīng)用,旨在為生鮮食品的非熱殺菌保鮮技術(shù)提供新思路。

1 PDAT的作用機(jī)制

圖1 光敏劑在光照條件下的光動力殺菌作用機(jī)制Fig.1 Photodynamic anti-microbial mechanism of photosensitizer under light conditions

2 光敏劑與光源

2.1 光敏劑

光敏劑是一類具有光活性的化學(xué)物質(zhì),可以有選擇性地富集在靶細(xì)胞中,由特定的光源來激發(fā)后可以滅活不同種類的微生物。根據(jù)其在生物體中的存在位置又可分為內(nèi)源性和外源性。光敏劑選擇的合適與否會直接影響PDAT的適用范圍、效果和安全性。因此,篩選和評估合適的光敏劑引起了研究者們的廣泛關(guān)注[7]。理想的光敏劑應(yīng)具有以下特點(diǎn):(1)低暗毒性,對環(huán)境友好;(2)在樣品體系中溶解度高;(3)能被特定波長的光源激發(fā),在激發(fā)光譜區(qū)有較高的光吸收系數(shù);(4)具有足夠長的三重態(tài)壽命以確保與周圍物質(zhì)充分反應(yīng);(5)能夠產(chǎn)生高濃度ROS,對目標(biāo)微生物破環(huán)性強(qiáng),對機(jī)體無毒副作用;(6)穩(wěn)定性強(qiáng),易于保存。此外,根據(jù)菌體結(jié)構(gòu)的差異,陽離子光敏劑或光敏劑結(jié)合富含陽離子的試劑可以作用于革蘭氏陰性菌外膜和真菌細(xì)胞壁上的負(fù)電荷,在光激發(fā)后能有效滅菌[17]。

2.1.1 內(nèi)源性光敏劑

微生物本身存在內(nèi)源性光敏劑,經(jīng)光激發(fā)后可直接滅活微生物,其化學(xué)本質(zhì)是一類雜環(huán)大分子,包括原卟啉、糞卟啉和尿卟啉[7]。有研究表明,光敏劑的前體物質(zhì)5-氨基酮戊酸可以促進(jìn)內(nèi)源性卟啉的合成[18]。另外,核黃素(維生素B2)也是一種內(nèi)源性光敏劑,可以由470～490 nm波長的光源激發(fā)而發(fā)揮光動力殺菌效果[11]。為了提高食源性病原菌和腐敗菌的失活效率,可以借助一些外源性光敏劑。

2.1.2 外源性光敏劑

外源性光敏劑主要分為人工合成的和天然存在2類。如表1所示,合成的光敏劑主要是卟啉類化合物(細(xì)菌卟吩等)、酞菁及其衍生物[鋅(Ⅱ)酞菁等]和一系列有機(jī)染料(亞甲基藍(lán)、熒光黃等)。天然光敏劑主要包括金絲桃素、竹紅菌素、α-三聯(lián)噻吩(萬壽菊屬)、呋喃香豆素、葉綠素、姜黃素和核黃素。近年來,隨著人們對于食品安全的持續(xù)關(guān)注,天然光敏劑因其毒副作用小、來源廣泛而受研究者的青睞。

表1 用于PDAT的外源性光敏劑Table 1 Exogenous photosensitizers used in PDAT

2.2 光源

光源作為PDAT的三要素之一,常根據(jù)光敏劑的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇[36],同時(shí)要考慮成本、安全性、性能等因素。另外,對于光源的可穿透深度,一般長波長光源比短波長光源對基質(zhì)的穿透深度更深,接近紅外范圍波長的光源在照射時(shí)會出現(xiàn)顯著的熱效應(yīng),可能破壞基質(zhì)外觀和成分而應(yīng)盡量減少使用。目前,PDAT的光源主要包括激光(連續(xù)激光、脈沖激光)、強(qiáng)脈沖光、發(fā)光二極管(light emitting diode, LED)和常規(guī)燈(鹵鎢燈、氙燈等)[11]。激光是一種高能光源,在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,但是成本高、難操作,鮮少用于食品領(lǐng)域。近年來,LED由于其安全無害、成本低廉、可控性強(qiáng),且作為一種冷光源,能有效減少熱效應(yīng)帶給食品基質(zhì)的破壞,在食品加工領(lǐng)域越來越受關(guān)注。另外,LED發(fā)射波長的范圍可以從UV-A(320～400 nm)到近紅外(1 100 nm),輻照度可以高達(dá)150 mW/cm2[37]。除了安全性外,食品領(lǐng)域PDAT研究中常見的問題還有輻照強(qiáng)度不足與照射角度單一,LED憑借其可以陣列排布與多幾何體形組合的特點(diǎn)而較好地解決了上述問題。

3 PDAT對食源性有害微生物的體外滅活作用

PDAT作為一種有潛力的非熱殺菌技術(shù),已被廣泛用于研究滅活各種類型的微生物中,包括細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等[11])、真菌(黃曲霉菌[38]、白色念珠菌[39]等)和病毒(諾如病毒[40]等)。迄今為止與食品相關(guān)的PDAT研究主要集中于滅活食源性有害細(xì)菌,少量為滅活真菌及病毒的研究[41-44],表2總結(jié)了近年來國內(nèi)外PDAT對食源性有害微生物的滅活作用。

表2 PDAT對食源性有害微生物的滅活作用Table 2 Inactivation of foodborne harmful microorganisms by PDAT

目前,國內(nèi)外已有不少與PDAT滅活多種食源性有害細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道,且其對許多食源性有害菌均有顯著的滅活效果,對于G+菌尤為突出。由于G-菌細(xì)胞壁外有帶負(fù)電荷的致密外膜(主要成分是脂多糖和脂蛋白),能阻擋陰離子光敏劑和中性光敏劑對于菌體穿透與吸附,相較于G+菌,光動力滅活G-菌效果不佳[45]。有研究報(bào)道使用陽離子光敏劑(如卟啉類和吩噻嗪類染料)或利用改造和修飾后的光敏劑可以提高對靶向G-菌的殺菌效果。YUE等[46]利用陽離子多糖殼聚糖(chitosan,CS)和二氫卟吩e6(chlorin e6,Ce6)構(gòu)建了一種新型光敏劑(CS-Ce6偶聯(lián)物),與CS和Ce6相比,CS-Ce6偶聯(lián)物的殺菌效果明顯增強(qiáng)。照射10 min,CS-Ce6偶聯(lián)物在光激發(fā)后可以滅活約7 lg CFU/mL 的金黃色葡萄球菌,滅活大腸桿菌>5 lg CFU/mL。另外,WANG等[47]構(gòu)建了負(fù)載光敏劑Ce6的聚乙烯亞胺基納米膠束。納米粒子與細(xì)菌表面之間的靜電和疏水作用協(xié)同促進(jìn)了納米粒子對目標(biāo)菌的錨定,產(chǎn)生大量的ROS對細(xì)菌外膜造成不可逆損傷,不僅比游離光敏劑的殺菌效率更高,更增強(qiáng)了對G-菌的殺滅作用。此外,相同光動力處理對于不同食源性有害微生物滅活效果不同的問題還有待進(jìn)一步考察。

4 PDAT在不同種類食品基質(zhì)中的應(yīng)用

PDAT由于其成本低、安全環(huán)保、精準(zhǔn)高效,有望成為減少熱效應(yīng)帶給食品感官品質(zhì)嚴(yán)重?fù)p害的一項(xiàng)重要的殺菌技術(shù),已被廣泛用于果蔬制品、奶制品、肉制品以及水產(chǎn)品的保鮮研究中。

4.1 果蔬制品

與新鮮果蔬相關(guān)的食源性疾病的爆發(fā)常常與大腸桿菌、沙門氏菌與單核增生李斯特菌密切相關(guān)[12]。PDAT對番茄、草莓、葡萄和櫻桃等4種水果表面的總菌落數(shù)和大腸菌群數(shù)的滅活率可達(dá)80%以上[61]。CHAI等[62]將鮮切梨浸泡于菌懸液中,10 μmol/L姜黃素介導(dǎo)的PDAT(420 nm LED)使單核增生李斯特菌減少了3.43 lg CFU/g,并保持了梨的色澤、硬度等品質(zhì)。由于細(xì)菌內(nèi)部可能存在內(nèi)源性卟啉,經(jīng)光激發(fā)后也能產(chǎn)生以1O2為主的ROS從而滅活微生物。GHATE等[63]報(bào)道在16 ℃時(shí),460 nm LED照射接種了沙門氏菌的鮮切菠蘿片,沙門氏菌減少1.72 lg CFU/g。

此外,PDAT的殺菌效果與光敏劑濃度、光照時(shí)間、孵育時(shí)間與基質(zhì)狀態(tài)有關(guān),必要時(shí)可以結(jié)合其他殺菌手段(如超聲波等)來提高殺菌效果。王小情等[64]利用葉綠素鎂鈉鹽(10-5mol/L)和400～415 nm LED進(jìn)行光動力處理后,荔枝清汁和濁汁中的金黃色葡萄球菌分別滅活了4.39和0.14 lg CFU/mL。由此可見,液體食品的濁度高可能會干擾光的穿透而降低滅菌效果。為了解決這一問題,BHAVYA等[65]結(jié)合50 W/cm2的超聲波處理,發(fā)現(xiàn)50 μmol/L姜黃素介導(dǎo)的PDAT使得橙汁中的大腸桿菌減少量從1.06 lg CFU/mL提高至4.26 lg CFU/mL。

4.2 肉制品

目前,國內(nèi)外有關(guān)PDAT作用于肉制品中有害菌的相關(guān)報(bào)道還比較少。其中,CORRA等[42]使用40 μmol/L姜黃素和450 nm LED(15 J/cm2)處理牛肉、雞肉和豬肉,樣品中的金黃色葡萄球菌分別減少了1.5、1.4和0.6 lg CFU/mL。為了提高殺菌效果,王洋等[54]在75 μmol/L姜黃素中加入0.5% EDTA噴灑于豬肉片上,使用460 nm LED照射豬肉樣品20 min后發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌下降了3.23 lg CFU/g,而不添加EDTA的處理組僅下降2.68 lg CFU/g,后續(xù)可以繼續(xù)聯(lián)合其他處理以提高其殺菌效果。

4.3 奶制品

牛奶、奶酪等奶制品在保藏不當(dāng)、殺菌處理不到位時(shí)易造成食物腐敗變質(zhì)甚至引起食源性疾病。食物基質(zhì)的特征往往影響PDAT的殺菌效果,特別是對于光線較難穿透的基質(zhì)類型。奶制品的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,不利于光敏劑的均勻分布以及光線的穿透。SARAIVA等[66]以DMSO或乙醇為增溶劑,用62.5 μg/mL姜黃素介導(dǎo)的PDAT(450 nm LED, 0.81 J/cm2)滅活熒光假單胞菌>7 lg CFU/mL,同時(shí),將姜黃素與食用明膠制成可食涂層體的光動力處理(450 nm, 4.86 J/cm2)對于濕奶酪上的熒光假單胞菌雖然只表現(xiàn)出姜黃素的暗毒性,但也增加了奶酪的咀嚼性。在特定條件下,選擇合適的光敏劑以及復(fù)合處理?xiàng)l件可以使PDAT增效顯著。GALSTYAN等[67]用610 nm氙燈(10 mW/cm2)對10 μmol/L亞甲基藍(lán)或酞硅菁進(jìn)行照射,在牛奶含量為20%時(shí),10 μmol/L酞硅菁介導(dǎo)的PDAT使牛奶中的葡萄球菌數(shù)量減少5個(gè)對數(shù)級以上,同劑量的亞甲基藍(lán)只能使其減少約1個(gè)對數(shù)級。此外,光動力處理后一些營養(yǎng)成分(如脂質(zhì))可能會由于ROS的產(chǎn)生而加速氧化變質(zhì),如何更好地發(fā)揮PDAT在奶制品上的殺菌效果以及保持其品質(zhì)有待進(jìn)一步探索。

4.4 水產(chǎn)品

水產(chǎn)品中也存在許多致病菌和腐敗菌(如副溶血性弧菌、熒光假單胞菌、沙門氏菌等),給人們的健康帶來嚴(yán)重威脅。最近一項(xiàng)研究報(bào)道了150 μmol/L核黃素介導(dǎo)的光動力處理可以滅活體外沙門氏菌>6 lg CFU/mL。當(dāng)光照劑量達(dá)到93.6 J/cm2時(shí),金槍魚表面的沙門氏菌減少了2.1 lg CFU/mL,盡管加速了脂質(zhì)氧化,但是對于魚肉總蛋白和揮發(fā)性鹽基氮無明顯影響[52]。該結(jié)果與GHATE等[63]報(bào)道類似,高光照劑量依然無法改變光動力處理對食品基質(zhì)的滅菌效果比體外滅菌效果差的事實(shí),這與食品基質(zhì)表面幾何形態(tài)各異、光敏劑在基質(zhì)上分布不均勻密切有關(guān)。由于PDAT中光源穿透深度有限,WANG等[68]將400 nmol/g姜黃素介導(dǎo)的PDAT(425 nm LED,30 min)與超聲波(300 W)結(jié)合,證明了兩者復(fù)合處理可以延緩蝦糜中細(xì)菌的生長,同時(shí)減少揮發(fā)性鹽基氮和硫代巴比妥酸反應(yīng)物的產(chǎn)生。因此,PDAT實(shí)際應(yīng)用到水產(chǎn)品中不僅需要研究如何進(jìn)一步提高其殺菌效果,還要深入考察其對于水產(chǎn)品的感官品質(zhì)與營養(yǎng)價(jià)值的影響,減少其給食品帶來的品質(zhì)劣變。

5 總結(jié)與展望

“民以食為天”,食品質(zhì)量與安全關(guān)系到每個(gè)人的健康,是食品科學(xué)研究和生產(chǎn)加工中的2個(gè)重要方面。PDAT作為一種安全高效、價(jià)格低廉、性能穩(wěn)定的非熱殺菌技術(shù),可以彌補(bǔ)熱處理對食品品質(zhì)帶來的嚴(yán)重影響,并保持感官特性和營養(yǎng)價(jià)值的完整性。此外,消費(fèi)者對健康、新鮮和高品質(zhì)食品的需求也在增加,不含化學(xué)防腐劑的食品也更受消費(fèi)者的青睞。鑒于此,以金絲桃素和姜黃素等天然光敏劑介導(dǎo)的PDAT有望成為替代熱處理的重要非熱殺菌方式之一。目前,已有不少有關(guān)天然光敏劑介導(dǎo)的PDAT滅活不同微生物的文獻(xiàn)報(bào)道,而大多數(shù)研究集中于使用某一種天然光敏劑。不難發(fā)現(xiàn),不論是對于不同種類與數(shù)量的微生物進(jìn)行相同條件的光動力處理,還是對于同種微生物進(jìn)行不同條件的光動力處理,均會得到顯著的殺菌效果。在后續(xù)的PDAT研究中,可以進(jìn)一步考察光動力處理?xiàng)l件以及不同種類與數(shù)量的微生物對于PDAT殺菌效果的關(guān)聯(lián)性,以強(qiáng)殺菌效果為導(dǎo)向,挖掘更多安全、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的光敏劑以豐富食品級光敏劑寶庫。此外,也可以嘗試使用多種光敏劑和不同光源結(jié)合的復(fù)合光動力處理來擴(kuò)大PDAT的殺菌譜。

另一方面,PDAT可多方位直接照射目標(biāo)樣品,特別是使用LED可以進(jìn)行多種三維陣列排序,對于不同形狀食品基質(zhì)表面、食品包裝表面與加工設(shè)備的殺菌效果較為理想,而對于固體、半固體以及渾濁液體食品的內(nèi)部(食品表面除外)而言,由于光照穿透力不足、光敏劑在樣品中的溶解度不高、穩(wěn)定性不強(qiáng)等因素,往往達(dá)不到預(yù)期的殺菌效果。現(xiàn)有的研究主要是利用微波、超聲波等輔助殺菌技術(shù)以及對光敏劑本身進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性、結(jié)合其他材料進(jìn)行改造與修飾(如形成納米顆粒、復(fù)合脂質(zhì)體、光敏劑/β-環(huán)糊精包合物)等方式來提高PDAT的殺菌性能。雖然殺菌性能有了明顯提升,但對于食品本身色澤、硬度等感官品質(zhì)以及對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分影響的研究不深入。目前PDAT殺菌過程中存在引起食物褐變,產(chǎn)生ROS氧化破壞食品中的脂質(zhì)和抗環(huán)血酸等成分,難以對貨架期進(jìn)行評估等問題。此外,大多數(shù)食品領(lǐng)域的光動力殺菌研究都在體外和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的,盡管已取得一定成效,但是還要考慮放大技術(shù),優(yōu)化光動力殺菌設(shè)備,建立規(guī)范的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與管理體系,使之能夠更好地投入于食品工業(yè)化應(yīng)用場景中。