地衣芽胞桿菌來源的漆酶BlLac的活性和熱穩(wěn)定性改造

黃愛敏,郭忠鵬,李默影,郭自濤,顧正華,張梁,辛瑜

(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

漆酶是一種氧化還原酶,來源廣泛,包括植物、昆蟲、真菌和細(xì)菌等。在分子氧的存在下,漆酶可以通過單電子催化氧化底物,同時(shí)將氧分子還原為水[1-2]。作為催化劑,漆酶具有底物廣泛、無二次污染、效率高等優(yōu)點(diǎn)[3-4],這樣優(yōu)良的催化性能使其被廣泛應(yīng)用于紙漿漂白、環(huán)境處理、生物檢測(cè)、食品加工、有機(jī)合成和生物能源等領(lǐng)域[5-6]。

然而,天然漆酶的穩(wěn)定性低、活性差、易受環(huán)境因素影響、重復(fù)使用困難等缺點(diǎn)限制了其實(shí)際應(yīng)用[7-8]。為了改善這些現(xiàn)狀,研究者們采用了多種改性方法,如蛋白質(zhì)工程、固定化和培養(yǎng)基工程。而蛋白質(zhì)工程已被證明是開發(fā)具有改進(jìn)特性或警示功能的生物催化劑的有效策略。其中理性設(shè)計(jì)是一種可靠的技術(shù),通常用于識(shí)別基于先驗(yàn)結(jié)構(gòu)信息的突變熱點(diǎn)殘基。CHEN等[9]在計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)程序的支持下,采用了定點(diǎn)突變方法來提高短小芽孢桿菌CotA漆酶對(duì)ABTS的特異性,以及其熱穩(wěn)定性。SANTIAGO等[10]成功地將計(jì)算方法與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合,合理設(shè)計(jì)了一種用于聚苯胺生產(chǎn)的改進(jìn)漆酶。經(jīng)過進(jìn)化后,改良型的kcat值提高了2倍。WANG等[11]采用基于親和力的虛擬突變分析出了枯草芽胞桿菌漆酶降解HPAM-3的關(guān)鍵氨基酸殘基。GARCIA等[12]通過在來自色鏈霉菌的小漆酶蛋白(SLac)中引入新的二硫鍵,使該酶對(duì)不可逆熱變性表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抵抗力。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)來自地衣芽胞桿菌的漆酶BlLac進(jìn)行了研究,為了提高它的工業(yè)適用性,我們對(duì)該酶進(jìn)行了理性設(shè)計(jì)改造,在同源建模和與底物ABTS對(duì)接后,采用虛擬氨基酸突變的方法,利用軟件Discovery Studio 4.0計(jì)算突變結(jié)合能變化以及預(yù)設(shè)二硫鍵,通過突變文庫的篩選最后構(gòu)建出優(yōu)化的突變體,并對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,闡明了酶活性提高和熱穩(wěn)定性提升的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

地衣芽胞桿菌來源的漆酶基因BlLac(GenBank:AAU23292.2)的氨基酸序列來自國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI),由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因合成。大腸桿菌EscherichiacoliJM109和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)WB600分別被用于重組質(zhì)粒擴(kuò)增和蛋白表達(dá),質(zhì)粒pMA5被用作表達(dá)載體(啟動(dòng)子已經(jīng)過優(yōu)化)[13],均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與儀器

ABTS、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素(kana)、溶菌酶、木糖,生工生物工程(上海)股份有限公司;Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2 突變?cè)噭┖小ne-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit(12%)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、180 kDa蛋白預(yù)染marker,諾唯贊生物科技有限公司;引物,金唯智生物科技有限公司。

PCR擴(kuò)增儀,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;高速冷凍離心機(jī),日立(中國)有限公司;酶標(biāo)儀,帝肯(上海)貿(mào)易有限公司;恒溫金屬浴,杭州博日科技股份有限公司;凝膠成像系統(tǒng),伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;蛋白純化系統(tǒng),蘇州賽普儀器有限公司;Nano-dsc,美國TA公司;Biologic ALX 250分光光度計(jì),賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,NaCl 10.0,酵母粉5.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

TB(terrific broth)液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12.0、酵母提取物24.0、甘油4 mL、KH2PO42.31、K2HPO416.2,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Tris-HCl緩沖液:2.422 8 g/L Tris,用HCl溶液調(diào)pH至8.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 同源建模與分子對(duì)接

通過同源結(jié)構(gòu)構(gòu)建網(wǎng)站SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/assess),以序列一致性與BlLac達(dá)到99.64%的地衣芽胞桿菌假定蛋白(PDB ID:6DZD)為模板,構(gòu)建3D模型。以ABTS為配體,使用軟件Discovery Studio 2019 CDOKER模塊進(jìn)行蛋白質(zhì)-配體柔性對(duì)接[14]。該配體的三維結(jié)構(gòu)從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載。

1.2.2 突變文庫的構(gòu)建

本研究利用Discovery Studio軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析,通過氫鍵、Pi鍵、鹽橋離子鍵等相互作用力來定義重要氨基酸,使用Mutation Energy模塊對(duì)這些氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行虛擬的定點(diǎn)飽和突變,根據(jù)突變能量(Mutation Energy)變化從低到高對(duì)氨基酸突變的結(jié)果進(jìn)行排序,選擇突變能量較低的突變體,進(jìn)行合理的氨基酸突變,從而提高酶的活力。同時(shí),通過Discovery Studio軟件Predict Disulfide Bridges模塊對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行二硫鍵的預(yù)設(shè),根據(jù)預(yù)測(cè)的每對(duì)二硫鍵對(duì)穩(wěn)定性的影響,同時(shí)考慮到以下參數(shù)條件:能量變化<5.0、過近接觸為0、溫度因子變化>20.0、氨基酸埋藏深度3～8等[15],尋找到相應(yīng)的突變位點(diǎn),以提高該酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.3 突變體的構(gòu)建,表達(dá)和純化

通過(vazyme.com)在線服務(wù)設(shè)計(jì)引物,由金唯智生物科技有限公司合成后進(jìn)行單點(diǎn)突變,并且以單點(diǎn)突變?yōu)榛A(chǔ)進(jìn)行組合突變,具體的突變過程使用Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2 突變?cè)噭┖羞M(jìn)行。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態(tài)中,提取質(zhì)粒并進(jìn)行DNA測(cè)序,然后將測(cè)序成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞中,對(duì)單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,引物如電子增強(qiáng)出版附件1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034552)所示。挑取驗(yàn)證成功的單菌落接種至10 mL LB(kana)(50 μg/mL)培養(yǎng)基中,在37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,后以5%的接種量轉(zhuǎn)接至150 mL TB(kana)(50 μg/mL)培養(yǎng)基中,以37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)10 h左右(待OD600達(dá)到2.0),然后加入終質(zhì)量濃度為20 mg/mL的木糖在37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h,收集的菌體可先儲(chǔ)存-20 ℃?zhèn)溆?。將收到的菌體與20 mmol/L(pH=8)的Tris-HCl 緩沖液以1∶20(g∶mL)的比例重懸,并向重懸液里加入0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的20 mg/mL溶菌酶,在37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置3 h,然后使用超聲細(xì)胞破碎儀在冰上破碎細(xì)胞,所得破碎液在低溫條件下進(jìn)行高速離心。上清液用于蛋白純化,利用鎳柱親和層析柱進(jìn)行純化,將200 mmol/L洗脫下來的蛋白經(jīng)過超濾濃縮,從而得到目的蛋白酶液。采用SDS-PAGE分析蛋白條帶。

1.2.4 蛋白濃度的測(cè)定

以牛血清白蛋白為參照物,采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5 酶活性的檢測(cè)

通過ABTS氧化法測(cè)定該酶的活性。將180 μL,pH 4.5的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液和終濃度為40 μmol/L的ABTS溶液在37 ℃下孵育5 min,該反應(yīng)直接在酶標(biāo)板中進(jìn)行,加入100 μL 的待測(cè)樣品后,立即在420 nm處測(cè)量吸光度的增加。一個(gè)酶活力單位被定義為在37 ℃下1 min能轉(zhuǎn)化1 μmol/L底物的酶量,計(jì)算方法如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

式中:A,420 nm處吸光度值的變化;Vt,反應(yīng)體系的體積,mL;Vs,酶液樣品體積,mL;ε,ABTS陽離子自由基的摩爾消光系數(shù),ε=36(μmol/mL)-1·cm-1;L,光徑,cm;t,反應(yīng)時(shí)間,min。

(2)

1.2.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

以不同濃度的ABTS來測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù),反應(yīng)體系中ABTS的系列濃度為0.02～0.5 mmoL/L,將反應(yīng)體系中ABTS溶液(20 μL)和0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(180 μL, pH 4.5)置于37 ℃的條件下預(yù)熱,然后加入100 μL 的純酶液測(cè)定5 min內(nèi)OD420值的變化。根據(jù)公式(1)計(jì)算酶活力。動(dòng)力學(xué)參數(shù)由米氏方程擬合。

1.2.7 半衰期的測(cè)定

將稀釋好的酶液放置在40 ℃的水浴鍋中保溫,每隔30 min取一次樣進(jìn)行酶活力測(cè)定,以初始相對(duì)酶活力為100%,根據(jù)指數(shù)衰減定律計(jì)算酶活力下降到50%所需要的時(shí)間。

1.2.8 溫度和pH對(duì)BlLac的影響

為了確定溫度和pH對(duì)該酶的影響,以ABTS為底物在不同溫度(20～80 ℃)和不同pH(3～6.5)下測(cè)定酶活性,從而確定最適溫度和最適pH。通過酶溶液在不同溫度(30、40、50 ℃)下孵育一段時(shí)間后的殘余活性,確定該酶的熱穩(wěn)定性。通過測(cè)量酶在不同pH(3～10.6)、4 ℃下孵育2 h后的殘余活性,確定該酶在酸堿條件下的穩(wěn)定性。各種pH緩沖溶液分別為:Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 3.0～8.0)、甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.6～10.6)。

1.2.9 納米差示掃描量熱(nano differential scanning calorimetry,Nano DSC)分析

采用納米差示掃描量熱法測(cè)定該酶的Tm值。每個(gè)分析樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度控制在1 mg/mL左右,在注入儀器之前,樣品將脫氣10 min。在操作過程中,樣品以1 ℃/min的速率從35 ℃加熱到95 ℃。通過數(shù)據(jù)分析軟件Nano Analyze得到最終結(jié)果。

1.2.10 圓二色光譜(circular dichroism,CD)研究

在20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中,用分光光度計(jì)在室溫下測(cè)定純化漆酶的紫外-CD光譜[16]。在平臺(tái)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用紫外(190～250 nm)CD光譜法測(cè)定酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)[17],利用DichroWeb的SELCON3分析程序(http://dichroweb.cryst bbk.ac.uk/html/process.shtml)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)元素[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的構(gòu)建和篩選

2.1.1 突變文庫一:基于相互作用力的氨基酸突變以提高酶活力

利用軟件Discovery Studio將ABTS對(duì)接至蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)模型(PDB ID:6DZD)中(圖1),獲得酶-底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)。定義距底物5 ?范圍內(nèi)的氨基酸殘基組成催化口袋,包含11個(gè)位點(diǎn):CYS A:189、ARG B:222、ILE B:216、LYS A:226、LYS B:217、GLU A:224、VAL A:245、GLU A:244、ASN A:240、GLU B:218、ARG A:230。將這11 種氨基酸分別進(jìn)行單點(diǎn)突變,使用Discovery Studio的工具欄Macromolecules的Calculate Mutation Energy(Binding)模塊計(jì)算催化口袋220個(gè)單點(diǎn)突變的突變能量,將計(jì)算結(jié)果按照突變能量由低到高排序,選擇突變能量較低,實(shí)現(xiàn)在理論上能夠穩(wěn)定活性位點(diǎn)與酶相互作用的突變,如電子增強(qiáng)出版附件2所示,共包含了35個(gè)單點(diǎn)突變。

圖1 底物ABTS與蛋白對(duì)接結(jié)果Fig.1 Result of substrate ABTS docking with protein

將這35個(gè)單點(diǎn)突變體構(gòu)建并在枯草芽胞桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后,選擇有效突變體測(cè)定其酶活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果如圖2、電子增強(qiáng)出版附件3和附件4所示,發(fā)現(xiàn)其比酶活力與催化效率(kcat/Km)的變化基本一致。突變體C189A、K217F、V245Y、S247F、K226S、E227Y的催化效率(kcat/Km)分別達(dá)到野生型的10.9、5.9、4.3、1.3、22、3.1倍,分析研究數(shù)據(jù)可知,這幾個(gè)突變體由于生成底物的速率都有明顯的提升,因此催化效率都有所提高,而部分優(yōu)秀突變體,如K226S在kcat值明顯提高的同時(shí),Km值顯著下降,對(duì)底物的親和能力也大大提升,所以其對(duì)底物的催化效率也相應(yīng)提高。為了達(dá)到更好的改造效果,本文將催化效率最高的突變體K226S與其他5個(gè)突變體進(jìn)行了組合突變,根據(jù)比酶活力(電子增強(qiáng)出版附件3)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(圖2和電子增強(qiáng)出版附件4)結(jié)果顯示,組合突變均未達(dá)到K226S單點(diǎn)突變的改造效果,而組合雙突變體中,除了K226S/S247F之外,Km值均低于野生型。而本突變文庫針對(duì)結(jié)合能最低化的設(shè)計(jì)就是為了增強(qiáng)底物與酶之間的親和力,因此該組合突變基本達(dá)到了突變目的。但是組合突變可能減緩了反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物的釋放,從而導(dǎo)致kcat值下降,因此整體催化效率提升沒有單突變那么顯著。

a-Kcat值的熱圖分析;b-Km值的熱圖分析;c-kcat/Km值的熱圖分析圖2 野生型和突變文庫Ⅰ的突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的熱圖分析Fig.2 Thermal analysis of kinetic parameters of the mutant library I and WT

同時(shí),對(duì)該突變文庫的單點(diǎn)突變體和雙點(diǎn)突變體在40 ℃下測(cè)定了其半衰期,結(jié)果如圖3所示,發(fā)現(xiàn)大部分突變體熱穩(wěn)定性有所下降或趨于同等水平,其中V245R、V245Y的熱穩(wěn)定性分別是野生型的1.8倍和1.4倍,為了得到熱穩(wěn)定性更高的突變體,本文構(gòu)建了另一個(gè)突變文庫進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 野生型和突變文庫Ⅰ的突變體在40 ℃下的半衰期Fig.3 Half-life of the mutant library I and WT at 40 ℃

由于突變文庫一中的突變體K226S、C189A和K217F對(duì)底物的催化效率有較為明顯的提升,本文將選取這3種突變體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 突變文庫二:預(yù)測(cè)突變形成二硫鍵以增強(qiáng)穩(wěn)定性

據(jù)報(bào)道,通過氨基酸突變形成二硫鍵,從而可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[19]。本文使用軟件Discovery Studio對(duì)蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)模型(PDB ID:6DZD)預(yù)設(shè)21對(duì)二硫鍵,根據(jù)模擬結(jié)果和各項(xiàng)打分以及Pymol觀察模擬后,最終確定了4對(duì)較為合理的二硫鍵預(yù)測(cè),其結(jié)果和模擬結(jié)構(gòu)如電子增強(qiáng)出版附件5所示。

采用定點(diǎn)突變構(gòu)建共計(jì)4個(gè)突變體:S251C、G151C、G187C、V1(A156C/K200C)。將野生型與這4個(gè)突變體表達(dá)純化后,測(cè)定其比酶活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果如電子增強(qiáng)出版附件6和表1所示。研究結(jié)果表明,突變體的酶催化效率與野生型相比,大部分有所降低或者處于同樣的水平,分析原因可能是二硫鍵的引入導(dǎo)致酶的柔性部分受阻,從而不能正常發(fā)揮催化活性。測(cè)定其在40 ℃下的半衰期,結(jié)果如圖4所示,在熱穩(wěn)定性上,這4種突變體均具有較為明顯的改造效果,S251C、G151C、G187C、V1在40 ℃下的半衰期分別是野生型的3.2、3.2、2.4、2倍,說明二硫鍵的引入對(duì)該酶的穩(wěn)定性有較好的提升效果。接著將這4種突變體兩兩組合進(jìn)行組合突變,以期得到更好的改造效果,共計(jì)6個(gè)突變體:S251C-V1、S251C-G151C、S251C-G187C、V1-G151C、V1-G187C、G151C-G187C。由電子增強(qiáng)出版附件6和表1可知,可能是由于原本突變體的酶活性不高,該組合突變對(duì)酶活性的改造亦沒有明顯效果。在40 ℃下的半衰期(圖4)結(jié)果表明,組合突變體的熱穩(wěn)定性并沒有原本突變體好,這可能是由于多對(duì)二硫鍵的引入會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)造成影響,從而不利于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此,本文選取突變文庫二中熱穩(wěn)定性較好的突變體S251C和V1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 野生型和突變文庫二的突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of the mutant library Ⅱ and WT

圖4 野生型和突變文庫二的突變體在40 ℃的半衰期。Fig.4 Half-life of the mutant library II and WT at 40 ℃

2.1.3 突變文庫一與突變文庫二的組合突變

基于2.1.1節(jié)和2.1.2節(jié)分別篩選出來的優(yōu)質(zhì)突變體,為了使該酶的活力和熱穩(wěn)定性同時(shí)提升,本研究選取突變文庫一中的3種優(yōu)異突變體K226S、C189A、K217F與突變文庫二中的2種優(yōu)異突變體S251C和V1進(jìn)行組合突變,獲得6種組合突變體:K226S-S251C、K226S-V1、C189A-S251C、C189A-V1、K217F-S251C、K217F-V1。同樣,對(duì)組合突變體的比酶活力、動(dòng)力學(xué)參數(shù)和在40 ℃下的半衰期進(jìn)行測(cè)定,研究結(jié)果(電子增強(qiáng)出版附件7、表2和圖5)顯示,相對(duì)于野生型,組合突變體C189A-S251C在底物催化效率提高了5.3倍的同時(shí),在40 ℃下的熱穩(wěn)定性也提高了1.2倍,展現(xiàn)出了較好的底物催化效率和比較高的熱穩(wěn)定性,因此,本文篩選出最優(yōu)突變體C189A-S251C進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

表2 組合突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of combined mutants

圖5 組合突變體在40 ℃下的半衰期Fig.5 Half-life of the combined mutants at 40 ℃

2.2 溫度和pH對(duì)野生型和突變體的影響

2.2.1 野生型和突變體的最適溫度和最適pH

首先,在20～80 ℃下測(cè)定野生型和突變體C189A-S251C的酶活力,如圖6-a所示,在30～55 ℃,兩者都檢測(cè)到比較高的活性,而突變體C189A-S251C的最適溫度為50 ℃,比野生型的最適溫度37 ℃要高,且該突變體在80 ℃下仍能檢測(cè)到55%左右的活性,分析由于該突變體內(nèi)含的二硫鍵使其穩(wěn)定性提高,使最適溫度也相應(yīng)提升。

a-最適溫度;b-最適pH圖6 野生型和突變體C189A-S251C的最適溫度和最適pHFig.6 Optimal temperature and pH for wild-type and its mutant C189A-S251C

然后,采用不同的pH緩沖液測(cè)定該酶在37 ℃下的最適pH。如圖6-b所示,含有100 mmol/L檸檬酸的緩沖液pH為4.0～4.5,檢測(cè)到較高的活性,并且野生型和突變體的酶活力均在pH值為4.5時(shí)最高。此結(jié)果表明,最適反應(yīng)pH不受該突變的影響。

2.2.2 野生型和突變體的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性

pH穩(wěn)定性的結(jié)果表明,該酶在改造之后,在酸性溶液中的穩(wěn)定性增強(qiáng)了(圖7-a)。野生型在pH 6.5時(shí)穩(wěn)定,而突變體C189A-S251C在pH 5.5時(shí)穩(wěn)定。并且與野生型相比,突變體在pH 3.0下孵育2 h后保持了約52%的殘余酶活力。

a-pH穩(wěn)定性;b-30 ℃下溫度穩(wěn)定性;c-40 ℃下溫度穩(wěn)定性;d-50 ℃下溫度穩(wěn)定性圖7 野生型和突變體C189A-S251C的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性Fig.7 pH and temperature stability of wild-type and its mutant C189A-S251C

根據(jù)熱穩(wěn)定性研究(圖7-b～圖7-d),突變體C189A-S251C的溫度穩(wěn)定性要優(yōu)于野生型,尤其在50 ℃下的野生型孵育40 min后,其剩余酶活力幾乎為0,而突變體C189A-S251C的剩余酶活力在50%左右。

2.3 Nano DSC分析

如表3所示,原始酶的Tm值為54.23 ℃,而突變體C189A-S251C的Tm值為57.39 ℃,上升了約3 ℃,說明該突變體的熱穩(wěn)定性高于野生型。而焓變(ΔH)則反映了蛋白質(zhì)分子的聚集程度和疏水性/親水性,該突變體的焓變值要低于野生型,說明經(jīng)過突變,該蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水作用力減弱,使得分子的聚集程度降低。該結(jié)果與上述研究結(jié)果相對(duì)應(yīng),且為該突變體熱穩(wěn)定性的提高提供了理論依據(jù)。

表3 野生型和突變體C189A-S251C的Tm值Table 3 Tm values of wild-type and its mutant C189A-S251C

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化研究

利用CD技術(shù)分析了由突變引起的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,該酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含α-螺旋,β-折疊比較缺乏。突變體C189A-S251C導(dǎo)致了α-螺旋的下降和β-折疊的上升,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量基本不變,分別保持在20%和30%左右的水平。本文推斷,該二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也是引起突變體酶活力上升和熱穩(wěn)定性提高的原因之一。結(jié)果如表4和圖8所示。

表4 野生型和突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 4 Secondary structures of wild-type and mutants

圖8 WT和突變體C189A-S251C的CD光譜Fig.8 CD spectra of WT and its mutant C189A-S215C

2.5 突變體的模擬結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步探究突變體C189A-S251C催化活性和熱穩(wěn)定性提高的原因,本研究利用軟件Pymol對(duì)野生型和突變體與底物ABTS對(duì)接后的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。氫鍵在配體識(shí)別和結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用[20],并且氫鍵網(wǎng)絡(luò)的合理改變可能引起酶的構(gòu)象變化,從而提高酶的活性或穩(wěn)定性[21]。如圖9所示,該突變改變了突變位點(diǎn)附近的氫鍵與配體的相互作用。一方面,與野生型相比,突變體C189A-S251C與底物ABTS形成的氫鍵相互作用減少,ARG B:222與底物ABTS相互作用的鍵長由1.76 ?變?yōu)?.04 ?,這些改變將增加酶的靈活性,使催化中心更容易接近底物[22]。另一方面,突變酶與底物之間形成了新的氫鍵,如CYS B:190與底物ABTS之間的氫鍵,距離為3.04 ?,這種必需殘基與配體之間相對(duì)較短的距離可以提高酶的催化效率[23],使催化通道底部的位點(diǎn)和配體結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用更加積極,此外,新形成端的氫鍵可能有助于穩(wěn)定酶[24]。

a-野生型與底物對(duì)接的相互作用力;b-突變體C189A-S251C與底物對(duì)接的相互作用力;c-野生型與底物對(duì)接的三維結(jié)構(gòu)模擬;d-突變體C189A-S251C與底物對(duì)接的三維結(jié)構(gòu)模擬圖9 野生型與突變體C189A-S215C的二維和三維結(jié)構(gòu)模擬Fig.9 Structural simulation of wild type and its mutant C189A-S215C注:三維結(jié)構(gòu)模擬中黃色棍棒結(jié)構(gòu)代表底物,綠色虛線代表氫鍵,黃色虛線代表距離。

對(duì)于突變體C189A-S251C,二硫鍵的引入也可使其變得更加穩(wěn)定。經(jīng)過原子測(cè)距發(fā)現(xiàn),突變之前,殘基SER A:251與CYS A:190之間的距離為3.4 ?,突變之后CYS A:190與CYS A:190兩個(gè)硫原子之間的距離為3.7 ?,空間距離適中,且由2.1.2節(jié)可知其他影響因素(如立體位阻、氨基酸埋藏深度等)都處于比較合理的數(shù)值,有利于二硫鍵的形成。因此,由較好的熱穩(wěn)定性的提升推測(cè),二硫鍵得以成功引入。

綜上所述,分子間相互作用的改變可能導(dǎo)致酶的內(nèi)腔發(fā)生適當(dāng)?shù)淖兓?增強(qiáng)酶與底物的相互作用,從而提高結(jié)合效率和催化效率[25-27]。而二硫鍵的引入可以提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的剛性,有利于酶熱穩(wěn)定性的提高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)構(gòu)模擬,針對(duì)突變能量的高低和二硫鍵預(yù)測(cè)分別構(gòu)建了2個(gè)突變文庫,并實(shí)現(xiàn)了突變文庫之間的組合突變,一共對(duì)56種突變體進(jìn)行了篩選,成功提升了該酶對(duì)底物ABTS的催化活性,同時(shí)較好地提高了該酶的熱穩(wěn)定性,證明了該實(shí)驗(yàn)策略的有效性和可靠性,為今后的突變改造策略提供了依據(jù),避免了氨基酸突變選擇的盲目性。

結(jié)果表明,最終突變體C189A-S251C對(duì)底物的催化效率可達(dá)到野生型的5.3倍,并且在40 ℃的半衰期較野生型提高了1.2倍,同時(shí)提高了該酶在酸性環(huán)境下的耐受力,最適溫度和Tm值也有所上升,這一改造結(jié)果也為BlLac漆酶在生物技術(shù)和環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力提供了技術(shù)支持。