HPTLC 聯(lián)用像素與光密度法快速定量茶飲料中的EGCG

張延杰，胡志高，席興軍，衛(wèi)曉，劉靄莎，李汴生，陳益勝，5*

（1 咀香園健康食品（中山）有限公司 廣東中山528414 2 中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院 北京100191 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫214122 4 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510641 5 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷 030801）

茶鮮葉中富含多酚類物質(zhì)，其含量約占茶鮮葉干質(zhì)量的18%～36%，其中兒茶素含量最高，約占多酚總量的70%。兒茶素化合物屬于黃烷醇類，其基本結(jié)構(gòu)是2-苯基苯并吡喃。從茶葉中分離鑒定的兒茶素多為表型兒茶素，主要有4 種，表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），其中EGCG 在兒茶素中含量最高[1-4]，占兒茶素總量的50%～80%，具有重要的保健功效。

近年來，諸多研究證明綠茶的健康促進(jìn)作用主要歸因于EGCG[5-6]。EGCG 具有抗氧化、殺菌、抑病毒、消炎、減肥等多種功效[7-12]。Azambuja等[13]研究表明，綠茶EGCG 具有抗炎活性，其作用機(jī)制為兒茶素可以清除體內(nèi)活性氧，調(diào)節(jié)炎癥信號通路，抑制炎癥發(fā)生。茶提取物尤其是綠茶提取物和茶多酚可以抑制動物模型中不同器官腫瘤的形成和發(fā)展。有研究表明，茶多酚特別是EGCG，可抑制酶活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞入侵[14]。Suzuki等[15]研究表明，綠茶具有抗癌、抗肥胖、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等活性，這些活性與EGCG的功效密切關(guān)聯(lián)。Al-Basher等[16]研究表明，EGCG可以通過抑制肝臟鐵蓄積來改善鐵超負(fù)荷引起的大鼠肝毒性、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，改善肝臟抗氧化能力[17]。此外，通過測定EGCG 含量，可以進(jìn)行茶葉分級，茶葉處理工藝合理性判斷，茶飲料質(zhì)量辨析等[18]，具有重要的應(yīng)用意義。

目前，已有多種方法用于測定茶葉及茶飲料中的兒茶素，如高效液相色譜-二極管陣列檢測（HPLC-DAD）[19]、高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）[20]，衍生后的氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）[21]等。最常用的方法始終基于HPLC 分離[22-25]，然而，基于HPLC的方法存在分析時間長和溶劑浪費的局限性。需要建立一種通量和性價比高的方法來直觀地表征茶產(chǎn)品中的EGCG。

在前期研究中，曾提出以HPTLC 為平臺，結(jié)合光密度檢測對顯色結(jié)果進(jìn)行掃描定量分析的方法[26-27]。然而，此方法在實際應(yīng)用中存在儀器（光密度掃描儀）單價昂貴和通用性差的問題。使用數(shù)碼相機(jī)對HPTLC 色譜結(jié)果進(jìn)行數(shù)字化成像，是其它色譜工具不具備的獨特優(yōu)勢。這一分析方法不僅為分析者提供了直觀的視覺定量結(jié)果，而且使得基于像素分析定量替代昂貴的光密度掃描定量成為可能[28-29]。

本文以HPTLC 為分離檢測平臺，經(jīng)FeCl3原位衍生顯影和薄層成像后將衍生后的色譜板聯(lián)用光密度掃描定量建立以HPTLC 為分離-分析一體化平臺的檢測方法，此外再聯(lián)用數(shù)字化處理軟件ImageJ 對薄層成像后的圖片進(jìn)行模擬掃描定量，建立一種高效、經(jīng)濟(jì)、可視化薄層色譜像素分析篩檢方法，并將兩種方法進(jìn)行對比。具體操作：將樣品進(jìn)行點樣、展開和分離；使用光密度或成像系統(tǒng)和ImageJ 進(jìn)行平行定量分析，采用目測檢視法進(jìn)行定性分析；最后使用3 種茶飲料來驗證方法的實際應(yīng)用能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶飲料樣品，無錫歐尚超市。EGCG（純度98.0%），阿拉丁公司；無水乙醇、氯仿、丙酮、甲酸、甲醇、三氯化鐵（均為分析純），Sigma 公司；薄層色譜板，G60 F254 硅膠板，硅膠層厚0.2 mm，規(guī)格10 cm×20 cm，德國Merck 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ChromaSpray I 型點樣儀；薄層色譜半自動點樣儀、薄層色譜全自動展開儀、薄層色譜浸漬器、薄層色譜掃描儀，瑞士CAMAG 公司；ProVidoc System-DD70 薄層成像系統(tǒng)，德國Biostep 公司；電子天平（MB104E 型），瑞士Mettler-Toledo 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及衍生溶液制備 EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 燒杯中，用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，得到1 mg/mL EGCG 標(biāo)準(zhǔn)儲備液。在4 ℃冰箱中恒溫避光保藏，使用時按比例稀釋至所需倍數(shù)，有效期為1 周。

FeCl3衍生溶液：準(zhǔn)確稱取5 g 無水三氯化鐵標(biāo)準(zhǔn)品，加入100 mL 無水乙醇，混合均勻后，4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品預(yù)處理 取3 種茶飲料10 mL 于離心管中，過0.45 μm 水系濾膜后得到樣品溶液，所得溶液可直接用于HPTLC 點樣，或?qū)⑵浞庞? ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.3 硅膠板預(yù)洗 試驗用所有硅膠板，使用前均需進(jìn)行預(yù)洗前處理。取10 cm×20 cm 的硅膠板置于ADC-2 薄層色譜全自動展開儀中，將10 mL色譜級甲醇從儀器上部兩側(cè)槽中注入展開缸，以其作為流動相進(jìn)行展開預(yù)洗，展開至硅膠板頂端后取出，最后用TLC 加熱器III 在120 ℃條件下干燥20 min，降至室溫后，用錫紙包裝，保存于密封袋中。

1.3.4 HPTLC 色譜展開 采用0.5 MPa 氮氣為載體，用ChromaSpray I 型點樣儀精確點樣于10 cm×20 cm 的薄層板上，點樣參數(shù)為：點樣的條帶長度6 mm，條帶距離底部10 mm，距離左端25 mm，條帶間距自動計算。具體操作：將1～25 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 μL 樣品溶液，以100 nL/s 速度和0.2 μL 預(yù)排體積于硅膠板上噴涂。每次取樣前，注射器用甲醇和超純水手動清洗3 次。點樣結(jié)束后用薄層色譜全自動展開儀展開，展開前需在儀器的兩側(cè)槽內(nèi)分別注入10 mL 相應(yīng)的流動相，展開參數(shù)為：氯仿/丙酮/甲酸（12.5/7.5/2.2，體積比），預(yù)平衡5 min，上行展開距離80 mm，展開完成后系統(tǒng)自動結(jié)束。之后將展開完成的硅膠板置于60 ℃TLC 加熱器III 上充分干燥5 min，以揮發(fā)去除薄層板上殘留的有機(jī)溶劑，這對獲得干凈的背景至關(guān)重要。

1.3.5 FeCl3變色反應(yīng)及色譜結(jié)果成像 將完成色譜分離的硅膠板通過自動浸漬裝置浸入FeCl3衍生液中，移動速度3 mm/s，停留時間3 s。然后，將蘸有FeCl3衍生液的硅膠板置于薄層色譜加熱器上50 ℃加熱。當(dāng)硅膠板黃棕色背景出現(xiàn)明顯的黑色斑點后，使用配備佳能EOS 700D 相機(jī)的成像系統(tǒng)對衍生后的硅膠板進(jìn)行成像記錄，相機(jī)參數(shù)設(shè)定為：白光底部透射光源，自動對焦和校正。

1.3.6 熒光光密度掃描定量分析方法 使用TLC Scanner 3 薄層色譜掃描儀進(jìn)行光密度掃描定量，檢測參數(shù)：吸光模式，氘燈和鎢燈，激發(fā)波長620 nm，光柵4.00 mm×0.30 mm（Micro），掃描速度20 mm/s，分辨率100 μm/step。色譜設(shè)備、數(shù)據(jù)采集和處理均使用WinCATS 軟件（1.4.4 版）。

1.3.7 圖像數(shù)字化處理軟件定量分析方法 對色譜分離結(jié)果的分析，使用ImageJ 軟件（1.52a 版）中像素灰度轉(zhuǎn)化-積分功能對數(shù)字化圖像進(jìn)行模擬掃描定量。具體操作是：首先將目標(biāo)條帶區(qū)域裁剪并保存為PC 兼容格式（.tif 文件），然后應(yīng)用ImageJ 軟件中的“Image-Color-Split Channels”功能，將原始圖片拆分為3 個顏色通道（紅色、藍(lán)色、綠色），選出最佳顏色通道后，將該通道下裁剪好的目標(biāo)區(qū)域，使用“Analyze-Gels”功能定義一個覆蓋目標(biāo)條帶起始線和結(jié)束線的矩形，然后提取這些矩形在垂直方向上的像素灰度值，并用“Plot Lanes”功能進(jìn)行輪廓分析，然后將圖形結(jié)果轉(zhuǎn)換為可積分色譜圖；最后通過“Straight option”選項繪制基線，使用積分工具“Wand tool”定義色譜圖中峰的面積，所獲取的數(shù)據(jù)峰面積可直接用于定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPTLC-光密度檢測方法的建立

在HPTLC 分離中，對硅膠板分離效果評估的方法一般是目測檢視法。使用0.1 mg/mL EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶 液依次點樣1.5，2，3，5，8，12，17，25 μL，EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)HPTLC 分離，用FeCl3浸漬，F(xiàn)eCl3均勻分布于整塊薄層板上，含有EGCG 的區(qū)域（圖1a 各軌道的變色區(qū)域）由黃棕色變?yōu)楹谏?，而其它區(qū)域保持黃棕色不變。使用不同流動相進(jìn)行HPTLC 分離條件優(yōu)化，結(jié)果表明：流動相為氯仿/丙酮/甲酸時，EGCG 的比移值（Rf）為0.21，同一軌道上的目標(biāo)物質(zhì)與干擾雜質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。將分離浸漬干燥后的結(jié)果圖用薄層色譜掃描儀掃描8 個軌道，結(jié)果見圖1b，發(fā)現(xiàn)視覺極限值為2 號軌道分離斑點，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作舍棄1 號軌道分離斑點，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2 所示，選擇2～8 號軌道的7 個點得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.1762x-178.26，R2=0.9974。選擇2～6 號軌道的5 個點得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.5009x-358.67，R2=0.9997。最終選擇2～6 號軌道5 個點制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系好，能夠滿足定量要求。

圖1 （a）薄層色譜分離衍生（b）光密度掃描結(jié)果圖Fig.1 （a）Thin layer chromatography separation derivation（b）optical density scan result graph

圖2 光密度掃描分析所得EGCG 標(biāo)曲圖Fig.2 EGCG reticlegation obtained by optical density scanning analysis

選取優(yōu)化后的流動相進(jìn)行色譜分離，得到分離結(jié)果見圖3a。將樣品板分離結(jié)果在吸光模式下測量密度。為了確定最佳檢測波長，預(yù)先分析HPTLC 板上EGCG 的全波長掃描光譜。如圖3b所示，顯然EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品在620 nm 處有最大光吸收，同時樣品軌道中的EGCG 條帶顯示相同的光譜輪廓，表明潛在基質(zhì)對EGCG 吸光光譜的影響不顯著。此外，評估了不同光源的性能，包括氘燈、鎢燈、氘燈和鎢燈及汞燈。通過比較，選擇氘燈和鎢燈，因為它不僅提供最高的峰強(qiáng)度，而且有助于色譜圖平滑，如圖3c 所示。因此，將620 nm 光（氘燈和鎢燈）用于定量測定。

圖3 沒食子兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（200，400 和800 ng/斑點）和茶飲料樣品提取物的HPTLC 分離和密度測定Fig.3 HPTLC separation and density determination of gallocatechin gallate standards（200,400 and 800 ng/zone）and rice flour sample extracts

2.2 HPTLC-光密度方法驗證

2.2.1 HPTLC-光密度方法的定量性能 為進(jìn)一步評估優(yōu)化后光密度的定量性能，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上確定方法的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。EGCG 在200～1 200 ng/斑點范圍具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9997）。根據(jù)德國DIN32645方法[30]，以至少95%的置信區(qū)間確定方法的LOD和LOQ。通過計算得出EGCG 的LOD 和LOQ 分別為25 ng/斑點和50 ng/斑點。將樣品提取物的上樣量固定在10 mL，這相當(dāng)于茶飲料樣品中EGCG的LOD 和LOQ 分別為2.5 mg/kg 和5 mg/kg。如果需要，就可通過使用更大的上樣量來增加檢測能力。任何情況下，即使在極低水平下，該檢測能力應(yīng)足以定量檢測EGCG，因為茶飲料中茶多酚（兒茶素類約占20%）的含量一般50～80 mg/kg[30]。同時該方法也取得非常高的精密度（RSD<8.2%），因此建立的HPTLC-光密度方法用于測定EGCG 含量具有很強(qiáng)的實用性。

2.2.2 HPTLC-光密度方法的準(zhǔn)確性 為進(jìn)一步評估優(yōu)化后HPTLC-光密度方法的準(zhǔn)確性，選取3種茶飲料進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗。在選取的茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 樣品中分別添加20，40，80 mg/kg 的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見表2。添加不同濃度的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 的回收率分別在103.5%～110.8%，95.3%～111.2%，99.3%～111.2%之間，表明HPTLC-光密度方法測定樣品中的EGCG 具有較高的準(zhǔn)確性。因此，以上結(jié)果證明所建立的方法可以用于篩檢茶飲料中EGCG 的含量，這對一款茶飲料價值的評估起到積極作用。

表1 HPTLC-光密度的準(zhǔn)確性和精密度評估Table 1 Accuracy and precision evaluation of HPTLC-densitometometric analysis

表2 HPTLC-ImageJ 的準(zhǔn)確性和精密度評估Table 2 Accuracy and precision evaluation of HPTLC-ImageJ

表3 方法對比Table 3 Method comparison

2.3 HPTLC-ImageJ 定量方法的建立

經(jīng)ImageJ 軟件將HPTLC 分離結(jié)果圖拆分為“藍(lán)、紅、綠”3 個顏色通道，如圖4 所示，（a）“藍(lán)色”通道下目標(biāo)斑點不顯現(xiàn)，于是，選擇“紅，綠”兩種顏色通道制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5 所示，取2～6軌道的5 個點制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在“紅色”通道下，200～1 200 ng/斑點范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.87x-1 961.2，R2=0.9983；在“綠色”通道下，200～1 200 ng/斑點范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=14.535x-1 619.9，R2=0.9995，因此選擇相關(guān)性更高的綠色通道下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線做后續(xù)分析。

圖4 經(jīng)ImageJ 拆分成3 個顏色通道Fig.4 Split into three color layers by ImageJ

圖5 （a）紅色和（b）綠色通道下的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curves of EGCG under the red layer（a）and the green layer（b）

2.4 HPTLC-ImageJ 方法驗證

2.4.1 HPTLC-ImageJ 定量方法驗證 在200～1 200 ng/斑點范圍，綠色顏色通道下，EGCG 具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9995）。根據(jù)德國DIN32645方法[31]，以至少95%的置信區(qū)間確定方法的LOD和LOQ。通過計算得出EGCG 的LOD 和LOQ 分別為34 ng/斑點和68 ng/斑點。將樣品提取物的上樣量固定在10 mL，這相當(dāng)于茶飲料樣品中EGCG的LOD 和LOQ 分別為3.4 mg/kg 和6.8 mg/kg。如果需要，可使用更大的上樣量來增加檢測性能。

2.4.2 HPTLC-ImageJ 方法的準(zhǔn)確性 在選取的茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 樣品中分別添加20，40 mg/kg 和80 mg/kg 的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見表2。添加不同濃度的EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液后，茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 的回收率分別在102.4%～110.8%，102.3%～118.8%，100.3%～113.5%之間，表明HPTLC-光密度掃描對樣品中EGCG 的測定有較高的準(zhǔn)確性。3 次平行分析所得RSD<6.7%，證明所建方法具有良好的精密度。

2.5 兩種方法對比

HPTLC-ImageJ 和HPTLC-光密度的線性相關(guān)系數(shù)相差不大且均在0.999 以上。兩種方法的回收率均滿足要求，具有良好的準(zhǔn)確性。兩種方法的精密度相差不大，HPTLC-ImageJ 略優(yōu)于HPTLC-光密度掃描。綜上，HPTLC-ImageJ 可以代替HPTLC-光密度掃描，其準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效。

3 結(jié)論

本章建立了HPTLC-ImageJ 和HPTLC-光密度兩種快速檢測茶飲料中活性物質(zhì)EGCG 含量的方法。HPTLC-ImageJ 方法中“藍(lán)色”通道下像素分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性系數(shù)高于“紅色”通道，因此，本試驗分析在“綠色”通道下進(jìn)行。對比兩種方法，它們的線性、準(zhǔn)確度和精密度非常接近，使用ImageJ 圖像數(shù)字化處理軟件代替光密度掃描儀節(jié)省了成本，具有實際應(yīng)用意義。