生物培育肉三維培養(yǎng)支架材料研究進(jìn)展

胡海娟，李瑩瑩，楊 峰，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心 北京 100068）

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人口的持續(xù)增長和收入的不斷增加，全球?qū)θ馄返男枨笤诳焖僭黾印Ｂ?lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）對2050 年的預(yù)測顯示，隨著肉類需求持續(xù)增長，全球僅肉類（不包括雞蛋和海鮮）需求在2050 年將達(dá)到4.55億t，與2005 年全球肉類總產(chǎn)量相比，增長了76%[1]。長期以來，養(yǎng)殖、屠宰動(dòng)物是傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)供應(yīng)的唯一途徑，然而，這種肉類獲取方式存在轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化效率低、資源耗費(fèi)大且污染環(huán)境等問題。FAO 報(bào)告顯示，全球約30%的農(nóng)作物被用于畜牧業(yè)飼養(yǎng)動(dòng)物，由于飼料物質(zhì)轉(zhuǎn)化率低，因此整個(gè)生態(tài)鏈條的物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率極低[2]。肉雞養(yǎng)殖業(yè)中每生產(chǎn)1 kg 蛋白質(zhì)，需要飼喂肉雞27～28 kg 干物質(zhì)飼料，轉(zhuǎn)化效率不足4%[3]。為了滿足人類對肉類食品日益擴(kuò)大的消費(fèi)需求，傳統(tǒng)肉制品的生產(chǎn)供應(yīng)方式只能通過大規(guī)模飼養(yǎng)動(dòng)物實(shí)現(xiàn)。全球的養(yǎng)殖業(yè)占用了地球30%可耕土地面積，消耗了全球8%的淡水資源，產(chǎn)生了全球18%的溫室氣體[2]。如果完全依賴大力發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)來滿足肉制品消費(fèi)，會(huì)造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。2022 年3 月6日，習(xí)近平主席參加全國政協(xié)十三屆五次會(huì)議的農(nóng)業(yè)界、社會(huì)福利和社會(huì)保障界委員的聯(lián)組會(huì)指出，要樹立大食物觀，發(fā)展生物科技、生物產(chǎn)業(yè)，向植物、動(dòng)物、微生物要熱量、要蛋白。大食物觀的提出推動(dòng)了肉類替代產(chǎn)品的多途徑研發(fā)，一場追求高效、環(huán)保、可持續(xù)的替代蛋白肉類科技變革正在全球悄然興起，開發(fā)新型肉類產(chǎn)品替代傳統(tǒng)肉類成為一個(gè)亟待解決的問題，生物培育肉應(yīng)運(yùn)而生。

生物培育肉又被稱作培育肉、細(xì)胞培養(yǎng)肉、清潔肉等，是利用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方式控制其快速增殖、定向分化并收集加工而成的一種新型肉類食品[4]。2019 年，該項(xiàng)技術(shù)被《麻省理工科技評論》入選為人類的“十大突破性技術(shù)”之一，被認(rèn)為是最有可能解決未來人類肉品生產(chǎn)和消費(fèi)困境的解決方案之一，具有極高的潛在商業(yè)價(jià)值[3]。根據(jù)生命周期評估分析結(jié)果，相較于傳統(tǒng)牛肉、羊肉和豬肉生產(chǎn)方式，“生物培育肉” 生產(chǎn)單位質(zhì)量肉類可以減少7%～45%的能源消耗，降低78%～96%的溫室氣體排放量，降低99%以上的土地使用，減少82%～96%的用水量等[5]，而且生產(chǎn)效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)畜牧業(yè)。因此，發(fā)展生物培育肉是保障未來肉品供應(yīng)多樣化選擇的重要戰(zhàn)略舉措，是未來食品領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢。

生物培育肉的目標(biāo)是通過體外培養(yǎng)細(xì)胞，制造1 塊與真正肌肉組織的營養(yǎng)、外觀、質(zhì)構(gòu)和味道高度相似的肉。傳統(tǒng)的細(xì)胞二維培養(yǎng)方法由于無法真正模擬體內(nèi)的微環(huán)境，因此，二維環(huán)境中生長的細(xì)胞形態(tài)不同于體內(nèi)生長的細(xì)胞，并會(huì)造成二者在包括增殖、分化、蛋白質(zhì)和基因表達(dá)在內(nèi)的細(xì)胞過程的差異[6]。細(xì)胞經(jīng)二維培養(yǎng)后只能獲得幾乎看不見的平面薄層細(xì)胞[7]，無法滿足細(xì)胞生長發(fā)育為塊狀肉的要求。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)不同，細(xì)胞的三維培養(yǎng)能夠最大程度地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的情況，重現(xiàn)細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，可以形成氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和可溶信號的梯度，使細(xì)胞呈現(xiàn)出空間立體生長的狀態(tài)[8]。若要在體外構(gòu)建具有真實(shí)質(zhì)感的肌肉組織，需依靠細(xì)胞三維培養(yǎng)支架材料和三維培養(yǎng)體系實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)肌肉組織的體外塑形和構(gòu)建。目前，有研究對生物培育肉三維培養(yǎng)體系構(gòu)建方法進(jìn)行綜述[9]，而生物培育肉所需三維培養(yǎng)支架材料的性能尚未引起廣泛關(guān)注。此外，用于生物培育肉制造的材料應(yīng)符合食品安全監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，具備可食性[10]。目前尚未見有關(guān)生物培育肉三維培養(yǎng)支架材料可食用性的報(bào)道。本文以生物培育肉的生產(chǎn)制造為背景，總結(jié)生物培育肉三維培養(yǎng)支架材料性能及三維體系構(gòu)建方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并對支架材料的可食用性進(jìn)行分析，以期為生物培育肉發(fā)展提供理論參考。

1 生物培育肉三維培養(yǎng)支架材料

1.1 天然三維培養(yǎng)支架材料

在天然肌肉組織中，細(xì)胞外基質(zhì)是動(dòng)物組織的一部分，主要由結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（如膠原蛋白、彈性蛋白）、特殊蛋白質(zhì)（如纖維蛋白）和蛋白多糖組成[11]。一般來說，理想的培育肉三維培養(yǎng)支架材料應(yīng)與自然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能相似，而且需根據(jù)不同類型的細(xì)胞作出調(diào)整，以便更好地促進(jìn)細(xì)胞在其上黏附、生長并發(fā)揮功能。此外，生物培育肉作為一種新型可食替代肉品，其所需理想支架材料除具有上述良好的生物相容性、三維立體多孔結(jié)構(gòu)和一定的機(jī)械強(qiáng)度以外，還需具備可食性或者在培養(yǎng)過程中能夠完全生物降解。

1）動(dòng)物源三維培養(yǎng)支架材料 目前，常見的三維培養(yǎng)動(dòng)物源支架材料主要由蛋白類、多糖類和明膠等生物大分子、自主裝多肽、脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）以及三維細(xì)胞聚集體組成。

纖維蛋白是通過纖維蛋白原和凝血酶的交聯(lián)形成的一種天然存在的凝血蛋白，因生物相容性好、可降解[12]，故常用作肌肉組織工程的水凝膠[13-14]。然而，纖維蛋白的機(jī)械性能差[15]，需與其它生物墨水材料聯(lián)合使用。纖維蛋白與氧化海藻酸鈉通過化學(xué)鍵合形成的天然凝膠結(jié)構(gòu)，可顯著促進(jìn)培養(yǎng)過程中人原代成纖維細(xì)胞的存活率與增殖速率[16]。纖維蛋白由纖維蛋白原水解形成，雖然有研究表明，豬血制備的纖維蛋白原可作為黏結(jié)劑應(yīng)用于重組牛肉加工[17]，但目前我國還未有相關(guān)食品法律法規(guī)允許將纖維蛋白添加到食品中，其在培育肉的應(yīng)用需進(jìn)一步評估。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其中，I型和III 型膠原蛋白在肌肉細(xì)胞中最豐富，其生物相容性好，常被用作3D 打印生物墨水材料[18]。膠原蛋白生物墨水通過調(diào)節(jié)溫度或者pH 值產(chǎn)生交聯(lián)[19]，與未交聯(lián)的膠原蛋白相比，交聯(lián)后膠原蛋白的拉伸強(qiáng)度和黏彈性更高[20-21]。由于膠原蛋白交聯(lián)需在37 ℃至少處理30 min，當(dāng)膠原蛋白被直接用于3D 打印時(shí)，其凝膠狀偏硬，因此需與其它凝膠材料復(fù)配。膠原蛋白-纖維蛋白混合物可用作肌肉再生的水凝膠，被證明可促進(jìn)細(xì)胞增殖和肌管分化[22]。Kim等[23]以膠原蛋白溶液為生物打印墨水，海藻酸鹽溶液作印刷浴中的支撐溶液，成功制備了載有細(xì)胞的膠原蛋白細(xì)絲，該墨水不僅維持C2C12 成肌細(xì)胞的活力，在培養(yǎng)過程中促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞生長發(fā)育，而且最終形成排列整齊的肌管。以牛跟腱膠原蛋白為原料，經(jīng)與殼聚糖復(fù)配可制備可食用微載體支架材料，該材料能夠支持小鼠骨骼C2C12 成肌細(xì)胞、兔平滑肌細(xì)胞、綿羊成纖維細(xì)胞和牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼附和快速增殖，且在9 d 的培養(yǎng)期內(nèi)就能實(shí)現(xiàn)接種細(xì)胞在載體表面的完全覆蓋生長，上述研究結(jié)果顯示膠原蛋白作為未來開發(fā)培養(yǎng)肉制品三維培養(yǎng)支架材料的巨大前景[24]。根據(jù)我國衛(wèi)食新告字[25]第0003 號規(guī)定，膠原蛋白天然存在于魚皮、魚鱗中，是天然的食物成分。以魚皮、魚鱗為原料，經(jīng)菠蘿蛋白酶和枯草芽孢桿菌酶酶解制成的膠原蛋白類物質(zhì)，在我國有一定的食用歷史，可作為普通食品生產(chǎn)經(jīng)營，說明膠原蛋白具備作為可食生物墨水材料應(yīng)用于生物培育肉生產(chǎn)研究的資質(zhì)。

透明質(zhì)酸是交替組成的帶負(fù)電荷的線性多糖，普遍存在于肌肉細(xì)胞外基質(zhì)，具有良好的黏彈性和高保水性，易于被細(xì)胞重塑和降解，在細(xì)胞遷移和成肌細(xì)胞的成熟期至關(guān)重要[26-27]。透明質(zhì)酸水凝膠可顯著維持人骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的活力，培養(yǎng)21d 后細(xì)胞活力保持在64.4%，并促進(jìn)其成骨分化[28]。透明質(zhì)酸的機(jī)械完整性較差，其形成的水凝膠被歸類為與某些人體軟組織結(jié)構(gòu)相似的軟凝膠[29]。它們的親水性聚合物網(wǎng)絡(luò)具有促進(jìn)葡萄糖和其它營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散，支持細(xì)胞生長的優(yōu)點(diǎn)，因此，通過和其它物質(zhì)復(fù)合，改變水凝膠中透明質(zhì)酸的濃度，是調(diào)整其凝膠機(jī)械性能常用的方法之一。為了提高透明質(zhì)酸生物墨水的機(jī)械性能，接近細(xì)胞體內(nèi)生長環(huán)境，有研究通過將熱敏細(xì)胞外基質(zhì)和甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸結(jié)合，通過光引發(fā)劑誘導(dǎo)交聯(lián)，開發(fā)一種具有合適的機(jī)械支撐和可見光可打印特性的生物相容性生物墨水，該研究結(jié)果表明，添加10 mg/mL 細(xì)胞外基質(zhì)可顯著改善該復(fù)合生物墨水的機(jī)械性能，MC3T3-E1 細(xì)胞在該生物墨水中培養(yǎng)7 d 后，仍可維持較高細(xì)胞活力【（94.27±3.00）%】[30]。我國于2008 年批準(zhǔn)透明質(zhì)酸鈉為新資源食品，使用范圍為保健食品原料。目前透明質(zhì)酸鈉及以其為主要成分的產(chǎn)品在日本、韓國、美國、歐盟、澳大利亞、新西蘭和巴西被允許添加在食品或膳食補(bǔ)充劑中。根據(jù)《食品安全法》和《新食品原料安全性審查管理辦法》，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)委托審評機(jī)構(gòu)依照法定程序，組織專家對透明質(zhì)酸鈉的安全性評估材料進(jìn)行審查且已通過，其有望在培育肉支架領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

海藻酸鹽是一種廉價(jià)的海藻基多糖，具有較好的生物相容性，有利于包載細(xì)胞；海藻酸鹽生物聚合物可以通過形成毛細(xì)管捕獲水和其它分子，允許其從內(nèi)向外擴(kuò)散，是生物打印領(lǐng)域構(gòu)建生物墨水最為常用的材料之一[31-32]。海藻酸鹽是由兩種單體組成的線性聚陰離子型多糖，其中一種與Ca2+相互作用快速交聯(lián)形成水凝膠[33]。海藻酸鹽與鈣離子快速結(jié)合是海藻酸鹽的優(yōu)點(diǎn)，其存在不足之處是，鈣離子在生理環(huán)境下容易與其它單價(jià)離子發(fā)生置換，從而破壞支架的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致支架坍塌，這限制了海藻酸鹽在生物打印中的應(yīng)用。有研究[34]利用聚賴氨酸氨基和海藻酸鹽羧基的電荷相互作用進(jìn)行溫和交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)支架表面電荷可調(diào)控性，進(jìn)而提高海藻酸鹽的穩(wěn)定性；海藻酸鹽/聚賴氨酸生物墨水支架在水溶液中具有很好的穩(wěn)定性，包載細(xì)胞的存活率較高，體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)固定的生長因子或細(xì)胞外基質(zhì)對于干細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控作用。此外，由于海藻酸鈉的化學(xué)結(jié)構(gòu)不利于細(xì)胞黏附，因此導(dǎo)致細(xì)胞黏附力相對較弱，生物相容性差，影響打印后細(xì)胞發(fā)育成組織，需與明膠、甲基丙烯酸?；髂z、膠原蛋白、纖維蛋白原等其它天然聚合物相結(jié)合，才可為細(xì)胞附著提供位點(diǎn)[35-38]。甲基丙烯酰明膠-海藻酸鹽3D生物打印墨水中的成肌細(xì)胞在生物打印后的第28 天仍表現(xiàn)出很高的活力（>85%），并檢測到肌球蛋白和肌節(jié)肌動(dòng)蛋白的表達(dá)[39]。為了真實(shí)模擬牛肉中的組織，海藻酸鹽水凝膠被用作牛脂肪生成的支架，將前脂肪細(xì)胞接種在海藻酸鹽水凝膠支架中，可顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和脂沉積[40]。海藻酸鹽雖不能被細(xì)胞重塑或降解，但可以通過改變其結(jié)構(gòu)來控制降解動(dòng)力學(xué)[33]。根據(jù)我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，海藻酸鈉作為一種增稠劑，在食品生產(chǎn)中可按生產(chǎn)需要適量使用。

瓊脂糖是一種從海藻中提取的海洋多糖，因優(yōu)良的凝膠特性，故是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用途廣泛的聚合物生物墨水之一，具有多種應(yīng)用[41]。雖然瓊脂糖的凝膠特性、機(jī)械性能和生物相容性較好，但其促進(jìn)細(xì)胞生長的能力有限[42]，通常需要對其改性。有研究[43]表明，與天然瓊脂糖水凝膠生物墨水（62%）相比，使用羧基化瓊脂糖熱凝膠作為生物墨水打印的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率（95%）被顯著提高。目前，根據(jù)我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，由瓊脂糖和瓊脂果膠共同組成的瓊脂被允許用于食品加工，而瓊脂糖能否直接用于培育肉生產(chǎn)加工，還需進(jìn)行食品安全性評估。

除上述常見的三維培養(yǎng)動(dòng)物源支架材料外，隨著研究的深入，越來越多的材料也為生物培育肉支架材料提供了更多的選擇。自組裝肽是不同肽通過非共價(jià)相互作用自主形成結(jié)構(gòu)明確且穩(wěn)定的多肽分子，其可以形成具有納米纖維結(jié)構(gòu)的水凝膠，提供類似體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的生物物理環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞生長，是一種新型生物墨水[44-45]。由超短自組裝肽水凝膠構(gòu)成的3D 打印支架高度模擬了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)肌管形成，從而誘導(dǎo)C2C12 成肌細(xì)胞在三維培養(yǎng)中的成肌分化，這證實(shí)了自組裝肽作為3D 生物打印墨水的生物相容性[46]，具有作為培育肉生物墨水的潛力。

明膠基三維培養(yǎng)支架是很重要的一類細(xì)胞三維培養(yǎng)支架材料。明膠是膠原蛋白的部分水解產(chǎn)物，明膠基結(jié)構(gòu)的生物墨水固有的生物活性特征（包括整合素結(jié)合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列和基質(zhì)金屬蛋白酶消化位點(diǎn)）提供細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)和生物降解性，被廣泛用于肌肉結(jié)構(gòu)的生物打印[47]。明膠具有低抗原性和易于加工的優(yōu)勢。有研究[48]表明，將可食用的三維多孔明膠微載體作為細(xì)胞擴(kuò)增支架，能夠促進(jìn)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、小鼠成肌細(xì)胞和小鼠脂肪細(xì)胞的高效生長，利用3D 打印模具，將該豬肉肌肉微組織組裝成厘米級肉丸，其機(jī)械性能和蛋白質(zhì)含量皆優(yōu)于天然豬肉丸。為了增強(qiáng)明膠的可印刷性和支架的機(jī)械穩(wěn)定性，通過將明膠甲基丙烯酸化，使這種材料成為可光交聯(lián)的甲基丙烯酸酯化明膠（GelMA）。GelMA 的可打印性受濃度影響較大[49]。為了將其保持在合適的凝膠狀態(tài)用于骨骼肌3D 打印，可通過與其它不同類型的光交聯(lián)材料混合，以增強(qiáng)其可打印性[50]。甲基丙烯酸海藻酸鹽和甲基丙烯酸羧甲基纖維素以及合成聚乙二醇二丙烯酸酯分別與GelMA 混合后，增強(qiáng)GelMA 可印刷性的同時(shí)，維持了C2C12 成肌細(xì)胞的活性并促進(jìn)了其分化和排列[50]。根據(jù)我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，明膠作為一種添加劑，在食品生產(chǎn)中可按生產(chǎn)需要適量使用，然而目前未見有關(guān)GelMA 的食品許可法規(guī)。此外，光引發(fā)劑不可食用，這些限制了GelMA 在培育肉中的應(yīng)用。明膠通過靜電紡絲技術(shù)處理后可成為明膠纖維，是一種食品安全成分[51]。其具有支持細(xì)胞黏附、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)輸送以及產(chǎn)生排列整齊的纖維促進(jìn)肌肉纖維成熟等特性，可作為培育肉生產(chǎn)的支架材料。例如：利用旋轉(zhuǎn)噴射紡絲的工藝制得豬源明膠制成的納米纖維支架材料，可以較好地模仿天然肌肉組織內(nèi)作結(jié)構(gòu)支架的細(xì)胞外基質(zhì)，其中長度較短的明膠纖維可促進(jìn)細(xì)胞聚集，而長纖維則促進(jìn)排列整齊肌肉組織的形成，培育的肌肉雖然缺乏天然肌肉中觀察到的成熟收縮結(jié)構(gòu)，但擁有真實(shí)肉品的一些結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征[52]。

由于動(dòng)物源明膠價(jià)格較高，因此應(yīng)用于生物培育肉的支架常將其與其它材料復(fù)合以降低培育肉生產(chǎn)成本。有研究[53]表明，通過快速冷凍豬皮源明膠和微生物源透明質(zhì)酸溶液可制得大孔彈性凍凝膠支架，形成的冰晶作為支架中的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，該支架孔徑為200 μm，孔隙率大于90%且具有優(yōu)良的孔貫通性（交聯(lián)度大于99%），體外和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果均表明，其能夠促進(jìn)豬脂肪干細(xì)胞的附著、增殖和成脂分化。這些研究表明明膠作為可食用微載體在培育肉研發(fā)領(lǐng)域有巨大潛力。

與上述從水凝膠構(gòu)建三維組織結(jié)構(gòu)不同，最近把dECM 作為一種生化成分和改進(jìn)的三維細(xì)胞打印工藝，產(chǎn)生原位排列結(jié)構(gòu)[54]。來自動(dòng)物（如豬）組織的dECM 經(jīng)歷脫細(xì)胞和溶解過程后，用于制備dECM 生物墨水。脫細(xì)胞過程后，細(xì)胞和DNA等大部分免疫原性成分被去除，細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸和彈性蛋白在很大程度上被保留下來，是組織微環(huán)境支持細(xì)胞生長、黏附、增殖、遷移和分化的主要組成部分[55]。因此，dECM 成為3D 生物打印皮膚組織所需生物墨水的良好來源，dECM 生物墨水適用于擠壓和噴墨生物打印。有文獻(xiàn)報(bào)道，源自去細(xì)胞化的豬骨骼肌dECM，經(jīng)甲基丙烯酸酯工藝進(jìn)行化學(xué)修飾后可增強(qiáng)其機(jī)械穩(wěn)定性。這種無水凝膠支架接種C2C12 成肌細(xì)胞后，該細(xì)胞排列整齊并分化形成肌管[54]。另一種組織特異型dECM 生物墨水可有效誘導(dǎo)細(xì)胞分化并促進(jìn)組織形成，與傳統(tǒng)膠原蛋白生物墨水相比，這種新的生物墨水可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、生肌基因表達(dá)以及高度成熟肌管的形成[56]。

三維細(xì)胞聚集體是一種新型生物墨水，既可與支架材料混合制備生物墨水[57]，也可作為無支架生物墨水直接打印[58]。有研究[59]報(bào)道，成肌細(xì)胞球體可以重組并形成排列整齊的多核肌管。目前還未見有關(guān)生物打印骨骼肌細(xì)胞聚集體的研究報(bào)道。考慮到細(xì)胞聚集體對肌管形成的影響，且該打印方式可不使用支架材料，其在生物培育肉相關(guān)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2）植物源三維培養(yǎng)支架材料 由于植物組織具有天然的脈管系統(tǒng)和多孔結(jié)構(gòu)，脫細(xì)胞后可以促進(jìn)氧氣和養(yǎng)分的運(yùn)輸。隨著研究的不斷深入，一些脫細(xì)胞的天然植物組織被用于生物培育肉支架材料的研發(fā)。成肌細(xì)胞分化為肌管是肌肉發(fā)育的一個(gè)基本過程，包括遷移、黏附、伸長、細(xì)胞識別、排列和成肌細(xì)胞膜融合，從而形成肌管。菠菜因廣泛的可利用性、密集的維管結(jié)構(gòu)和寬葉柄而被作為潛力支架材料[60-62]。菠菜葉被報(bào)道可作為生物培育肉支架材料，并且能在14 d 的培養(yǎng)期內(nèi)保證牛衛(wèi)星細(xì)胞的存活，一些細(xì)胞的分化，以及一些樣品中的強(qiáng)定向排列[61]。除菠菜葉外，脫細(xì)胞的芹菜和洋蔥也具有作為培育肉支架材料的潛力。體外試驗(yàn)表明，脫細(xì)胞芹菜支架有利于鼠C2C12 成肌細(xì)胞貼附，并引導(dǎo)其在維管束方向上排列[63]。此外，木質(zhì)部和韌皮部通道直徑為10～100 μm，這是通過接觸引導(dǎo)成肌細(xì)胞排列的最佳直徑，C2C12成肌細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基生長10 d 后，可以觀察到F-肌動(dòng)蛋白絲平行于維管束的縱軸排列，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后，成肌細(xì)胞保持了排列形態(tài)并促進(jìn)了肌管的形成，引導(dǎo)肌肉細(xì)胞排列[63]。這些結(jié)果突出了這種植物衍生支架在體外肌生成研究中的應(yīng)用潛力，其中結(jié)構(gòu)各向異性需要更接近于體內(nèi)條件。脫細(xì)胞青蔥纖維素骨架，尤其是外部白色鱗莖部分，為體外培養(yǎng)骨骼肌提供了一種簡單且低成本的支架。脫細(xì)胞青蔥纖維素支架表面形貌由20 μm 寬、10 μm 深的凹槽重復(fù)組成，該形貌具有促進(jìn)C2C12 和人體骨骼肌細(xì)胞高度融合和排列的效果，且青蔥外部的白色鱗莖部分具有誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞分化成肌管的微結(jié)構(gòu)[64]。脫細(xì)胞草保留了天然的條紋形貌，在無需額外功能化處理的情況下支持鼠C2C12 成肌細(xì)胞的黏附、增殖、排列和分化，是一種培育骨骼肌的天然支架[65]。通過脫細(xì)胞技術(shù)去除蘋果片中原有細(xì)胞后，留下的纖維素骨架可作為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中用到的天然支架，在2 周的培養(yǎng)周期內(nèi)，脫細(xì)胞蘋果纖維素支架的生物相容性高，可顯著促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞的存活與貼附[66]。

組織化大豆蛋白源自大豆油加工過程的副產(chǎn)物，是一種可食用的多孔植物蛋白質(zhì)基生物材料。由于其質(zhì)地和高蛋白含量（50%）特性，常被用于肉品替代物的原材料，可提升終產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值[67]。組織化大豆蛋白的多孔性結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞貼附，還可根據(jù)生物培育肉大規(guī)模生產(chǎn)需求，定制為不同的尺寸和形狀，因此，組織化大豆蛋白是一個(gè)很有前景的3D 支架材料[68]。以色列海法理工學(xué)院Ben-Arye等[69]以組織化大豆蛋白為原料，開發(fā)了一種制備生物培育肉的支架材料，研究結(jié)果表明，該支架可顯著支持細(xì)胞附著和增殖，并被成功用于3D 工程化牛肌肉組織的構(gòu)建。此外，該研究通過比較幾種不同細(xì)胞組合的肌生成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積情況，發(fā)現(xiàn)牛衛(wèi)星細(xì)胞與牛平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)及牛衛(wèi)星細(xì)胞、牛平滑肌細(xì)胞和牛內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組合均能促進(jìn)肌生成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，且與牛衛(wèi)星細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)中提高了細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)。

目前，為了降低培育肉生產(chǎn)成本，也有研究從大型綠藻中提取海藻纖維素作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長的支架，體外試驗(yàn)表明，40 d 的培養(yǎng)期內(nèi)，成纖維細(xì)胞可維持較高的存活率，且此類支架可顯著影響細(xì)胞的細(xì)胞行為和增殖速率[70]。然而，生物培育肉培養(yǎng)條件下，纖維素支架的降解性是一個(gè)待評估的問題。從營養(yǎng)學(xué)角度看，纖維素支架雖不被人體降解，但可以被腸道微生物吸收利用，是一種優(yōu)勢，然而生物培育肉要求支架材料可降解，這是一種劣勢。此外，不同來源和方法制得的纖維素降解程度不同，脫細(xì)胞蘋果纖維素支架的降解速度比細(xì)菌纖維素制得的支架更快，這表明一些纖維素基支架可能比其它支架更容易降解[71-72]。在選擇支架時(shí)應(yīng)盡可能選擇能夠在培養(yǎng)期間被大部分或完全降解的纖維素基支架。

1.2 合成三維培養(yǎng)支架材料

為了開發(fā)用于生物培育肉的支架，材料必須是可食用的或可降解的，且不含有毒副產(chǎn)物。組織過程學(xué)中最常用的合成聚合物支架材料包括聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸乙醇酸共聚物[73]。其中，乳制品副產(chǎn)品中的聚乳酸最近被開發(fā)為可食用薄膜[74]。如果上述材料沒有毒副產(chǎn)物產(chǎn)生，生產(chǎn)對環(huán)境不會(huì)造成很大的影響，且如果吸收速度足夠慢，保證細(xì)胞在成熟之前都可以存活，那么這些材料也是生物培育肉潛在的支架材料。合成聚合物是非生物活性的，并且通常比天然聚合物的生物相容性差[75]，可以考慮和其它天然合成支架混合使用。

微載體是細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中被常用到的一類支架。Modern Meadow 公司申請了一項(xiàng)將果膠和含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）的多肽交聯(lián)制備微載體用作培育肉支架材料的專利[76]。目前RGD 肽在食品中的應(yīng)用尚待批準(zhǔn)[77]。

2 生物培育肉三維培養(yǎng)體系構(gòu)建方法

2.1 3D 生物打印

3D 生物打印技術(shù)是增材制造技術(shù)與生物制造技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，直接為生物醫(yī)療領(lǐng)域服務(wù)的3D 打印可視為3D 生物打印的范疇[10]。狹義上，3D生物打印通常指利用含活細(xì)胞的生物墨水打印出活性結(jié)構(gòu)的過程，利用計(jì)算機(jī)在明確的空間位置上，可同時(shí)精確定點(diǎn)地打印各種種子細(xì)胞、生物活性因子等物質(zhì)[11-12]。該技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀表明，由于3D生物打印能制造具有所需形狀和生理功能的組織模擬結(jié)構(gòu)，有助于實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的3D 成形以及組裝成塊狀的肌肉組織[13]，因此為培育肉生產(chǎn)提供了新途徑，在生物培育肉產(chǎn)業(yè)具有良好的應(yīng)用前景[14]。為了在體外最大程度地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，選擇合適的3D 生物打印方法可以確保通過一種方便且有效的方式模擬構(gòu)建生物培育肉組織結(jié)構(gòu)[65]。

3D 生物打印的主要打印方法可分為擠出式、噴墨式、激光直寫式和光固化式打印[8]。擠出式生物3D 打印是應(yīng)用最為廣泛的生物打印方法，可以打印黏度較高的生物材料。常選用水凝膠作為包裹細(xì)胞的生物材料，然而水凝膠在經(jīng)擠出打印成型后，需要一種固定方法來保證所打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[78]。噴墨打印是最早的3D 生物打印技術(shù)，是成本相對較低的生物打印技術(shù)，打印速度快。然而，該技術(shù)受噴頭驅(qū)動(dòng)壓力和噴墨過程對細(xì)胞產(chǎn)生損傷的限制，對生物材料的黏度要求較高[79]，未能在生物培育肉研究中得到廣泛應(yīng)用。激光直寫式生物3D 打印方法可以避免生物墨水和處理裝置的直接接觸，既不會(huì)對細(xì)胞造成機(jī)械剪切損傷，又可以打印較高黏度的生物材料，而且適用的材料范圍也比噴墨打印廣泛。該技術(shù)目前存在成本高，耗時(shí)，重復(fù)性不佳等缺點(diǎn)[80]。光固化式生物3D打印和激光直寫式打印類似，也是利用光來選擇性交聯(lián)生物墨水，層層固化形成三維結(jié)構(gòu)。雖然光固化式生物3D 打印的效率和精度都比較高且裝置簡單易控制，但其缺點(diǎn)是紫外光及其引發(fā)劑會(huì)對細(xì)胞造成損傷，且光引發(fā)劑不可食用，限制了其在生物培育肉中的應(yīng)用[81]。

上述生物3D 打印方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，如何合理選擇、利用并開發(fā)新的打印工藝應(yīng)用于生物培育肉的生產(chǎn)，是目前生物3D 打印面臨的問題。由于實(shí)際的肉是連接到肌腱纖維的排列組合，用于收縮和放松，因此，大阪大學(xué)學(xué)者開發(fā)了肌腱凝膠集成3D 生物打印來構(gòu)建肌腱樣凝膠，該團(tuán)隊(duì)通過使用該技術(shù)組裝細(xì)胞纖維來設(shè)計(jì)整塊切肉狀組織，總共構(gòu)建了72 根纖維，包括42 塊肌肉、28 個(gè)脂肪組織和2 根毛細(xì)血管，并通過手工組裝制造直徑5 mm、長度10 mm 的牛排樣肉，上述結(jié)果表明該技術(shù)是一項(xiàng)可用于制造類牛排培養(yǎng)肉的技術(shù)[82]。

2.2 靜電紡絲

靜電紡絲技術(shù)是通過靜電制備連續(xù)納米纖維的一種技術(shù)，具有成本低廉、裝置簡單的優(yōu)勢，也是目前唯一的不需要借助額外的有機(jī)溶劑和溫度控制即可生產(chǎn)納米纖維的方法[83]。2019 年，哈佛大學(xué)Kit Parker 團(tuán)隊(duì)利用靜電旋轉(zhuǎn)噴射紡絲的工藝制得由豬源明膠制成的納米纖維支架材料，并獲得排列整齊的肌肉組織[52]。目前，該技術(shù)在生物培育肉領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

2.3 脫細(xì)胞支架

最近把dECM 作為一種改進(jìn)的三維細(xì)胞打印工藝，因其促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生原位排列結(jié)構(gòu)，故成為皮膚組織工程中支架材料的良好來源[54]。根據(jù)來源不同，可劃分為動(dòng)物源脫細(xì)胞支架和植物源脫細(xì)胞支架。動(dòng)、植物組織經(jīng)脫細(xì)胞過程后，細(xì)胞和DNA 等大部分免疫原性成分被去除，細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸和彈性蛋白在很大程度上被保留下來，是組織微環(huán)境支持細(xì)胞生長、黏附、增殖、遷移和分化的主要組成部分[55]。與動(dòng)物源脫細(xì)胞支架不同，植物組織本身具有的天然脈管系統(tǒng)和多孔結(jié)構(gòu)，脫細(xì)胞后可以促進(jìn)氧氣和養(yǎng)分的運(yùn)輸。隨著研究的不斷深入，一些脫細(xì)胞的天然植物組織在滿足可食用且脫細(xì)胞過程不含有毒材料的前提下，被用于生物培育肉支架材料的研發(fā)[65]。

3 結(jié)論

通過三維培養(yǎng)材料和三維培養(yǎng)體系構(gòu)建技術(shù)的結(jié)合可為細(xì)胞提供生肌的微環(huán)境，使生產(chǎn)生物培育肉成為可能。水凝膠類生物墨水是目前研究最廣泛的一大類生物培育肉三維培養(yǎng)材料，一些脫細(xì)胞的天然植物組織因良好的生物相容性和可引導(dǎo)細(xì)胞排列的特點(diǎn)而成為潛在的新型生物培育肉支架材料。3D 生物打印技術(shù)是現(xiàn)有生物培育肉三維培養(yǎng)體系構(gòu)建方法中較為成熟的一種技術(shù)，在塊狀生物培育肉的生產(chǎn)方面具有較好的應(yīng)用前景。目前應(yīng)用于培育肉的支架材料和方法有限，在單一特點(diǎn)方面均各有利弊。在未來的研究中，開發(fā)可食用、可降解和生物相容性良好的三維培養(yǎng)材料，構(gòu)建高效率的三維培養(yǎng)體系，是生物培育肉制造技術(shù)當(dāng)前亟待解決的難點(diǎn)，也是未來的發(fā)展趨勢。