酶解絮凝耦聯(lián)對咸蛋清脫鹽及理化性質(zhì)的影響

李晶晶，蔡為榮，朱 櫻，王璐

（安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院 安徽蕪湖 241000）

咸鴨蛋清的主要成分是蛋清蛋白，因具有起泡、乳化、保水等功能而在食品加工業(yè)被廣泛應(yīng)用，然而咸蛋清含鹽量高、分子質(zhì)量大、黏度高，不便直接利用，每年約有千萬噸咸鴨蛋清被丟棄[1-3]。研究表明，酶解法在降低蛋清蛋白的分子質(zhì)量及黏度的同時，可以提高蛋清的理化性質(zhì)[4]。如：涂勇剛等[5]利用木瓜蛋白酶提高蛋清蛋白起泡性能。此外，添加多糖也可以提高蛋清理化性質(zhì)。如：Er?elebi等[6]向蛋清中添加不同的多糖，蛋清理化性質(zhì)均有提升。將兩種方法耦聯(lián)，與單一的酶解相比，耦聯(lián)技術(shù)更能提高所得蛋清的理化性質(zhì)。如：Chang等[7]在酶解的蛋清蛋白中添加多糖，所得產(chǎn)物的功能特性均有提升。劉雪[8]向咸鴨蛋蛋清酶解物中添加麥芽糖糊精，同樣得到具有功能性的蛋清粉。

殼聚糖是一種天然高分子絮凝劑，也是一種天然陽離子多糖[9]，因適用范圍廣、無毒等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[10]。對比其它脫鹽方法——膜過濾[11]、離子交換法[12]和電滲析法[13]，以殼聚糖為絮凝劑脫鹽操作簡單，然而相關(guān)文獻研究少?；诖耍狙芯恳韵痰扒迕附庖簽樵?，將酶解與絮凝技術(shù)耦聯(lián)。選取殼聚糖作絮凝劑，優(yōu)化絮凝脫鹽工藝，并測定所得蛋清粉的理化性質(zhì)，評估耦聯(lián)對其影響。本研究旨在得到含鹽量低且具有功能特性的蛋清粉，為咸蛋清回收利用、開發(fā)和應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨蛋、咸鴨蛋，市售；氫氧化鈉（AR）、檸檬酸（AR）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、殼聚糖（脫乙酰度>90%）、橄欖油（CP），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶（Papain，酶活4×104u/g），合肥博美生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

膠體磨，南洋防爆電機有限公司；D-160 手持式均質(zhì)分散儀，大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；CP214 電子天平，奧豪斯儀器有限公司；SB2000數(shù)顯鹽度計，韓國HM 有限公司；UVmini-1280 紫外分光光度計，日本島津有限公司；PHSJ-5 雷磁pH 計，上海雷磁儀器廠；HP-C210 精密色差儀，深圳漢譜有限公司；DSC-60 差示掃描量熱儀，日本島津有限公司；Mastersizer 2000 型激光粒度儀，英國馬爾文有限公司；真空冷凍干燥機，松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 蛋清粉的處理及制備

1.3.1 樣品預(yù)處理 咸鴨蛋、鴨蛋清洗表面后擦干，分離蛋清、蛋黃，蛋清經(jīng)3 層紗布過濾除去顆粒雜質(zhì)，經(jīng)膠體磨（刻度調(diào)制1 μm）均質(zhì)化處理，凍干得咸蛋清粉、鮮蛋清粉。

1.3.2 咸蛋清酶解 酶水解參照文獻[14]，并作一定修改，具體如下：取均質(zhì)后咸鴨蛋蛋清稀釋至500 mL（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），木瓜蛋白酶酶添加量為1×104U/g，55 ℃恒溫酶 解處理，用0.5 mol/L NaOH/檸檬酸保持水解過程中維持pH=7.0±0.1，水解1 h，制備低水解度的酶解液。水解結(jié)束后，于沸水浴15 min 滅酶。取冷卻酶解液，凍干得酶解咸蛋清粉。

水解度（DH）：采用SN-TCA 指數(shù)法測定水解度[15]。

1.3.3 絮凝脫鹽單因素實驗 取100 mL 酶解液調(diào)節(jié)pH 值后，以殼聚糖溶液（1%乙酸為溶劑）作為絮凝劑，磁力攪拌一定時間，于水浴鍋恒溫靜置30 min，4 000 r/min 離心15 min，離心沉淀為回收蛋白，上清液中含鹽量為脫除鹽分記作脫鹽率，含鹽量采用鹽度計測定[16]。以脫鹽率為指標(biāo)，考察攪拌時間（3，5，10，20，30 min）、料液溫度（5，10，20，30，40，50 ℃）、殼聚糖添加量（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g·L-1）、料液pH 值（5，5.5，6，6.5，7，7.5，8）對脫鹽率的影響。

1.3.4 絮凝脫鹽響應(yīng)面優(yōu)化 單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行Box-Behnken 建立模型，選取pH 值（A）、攪拌時間（B）、絮凝溫度（C）、殼聚糖添加量（D）為試驗因素，以脫鹽率為響應(yīng)值進行優(yōu)化。并在工藝參數(shù)下制備脫鹽蛋清粉，凍干得酶解脫鹽蛋清粉。

1.4 蛋清粉理化性質(zhì)的測定

1.4.1 含鹽量及蛋白質(zhì)含量 咸蛋清及絮凝上清液中鹽含量均采用鹽度計測定[16]。蛋清粉中鹽含量測定的具體方法為，將1 g 蛋清粉溶于100 mL超純水中，150 r/min 轉(zhuǎn)速條件下攪拌1 h，用鹽度計測定溶液中鹽含量。本試驗各樣品中氮、蛋白質(zhì)含量均采用GB/T 5009.5-2016 測定。

1.4.2 起泡性 采用機械攪打法評估起泡能力[17]，將各蛋清粉溶于pH=7 的磷酸緩沖液（0.2 mol PBS）配置成不同濃度的樣液，取20 mL 蛋液記作V0，磁力攪拌器攪拌（1 500 r/min，3 min），攪打結(jié)束后立即轉(zhuǎn)入量筒，記錄泡沫體積V1，靜置30 min 后再次記錄泡沫體積V2。起泡能力（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S），按照下式計算：

1.4.3 乳化性 乳化性評估參考Guo等[18]的方法，并略作修改，取不同濃度的樣液，室溫下將樣液與橄欖油（V/V=3∶1）均勻混合，均質(zhì)分散儀分散（18 000 r/min，1 min）后，立即從溶液底部吸取50 μL 乳化液用0.1% SDS 溶液稀釋至5 mL。SDS 溶液作空白對照，于500 nm 處測定其吸光值，靜置10 min 后，重復(fù)上述操作。以0 min 測定吸光度A0表示乳化活性（emulsifying activity，EA）；乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）按下式計算：

式中，A0——0 min 的吸光值；Δt——時間差（10）；Ax——10 min 的吸光值。

1.4.4 熱變性溫度 稱取3～5 mg 待測樣置于鋁盒中，以空鋁盒為空白對照，使用差示掃描量熱儀（DSC）進行測定，測定條件初溫40 ℃，終溫110℃，升溫速率5 ℃/min，樣品吹掃氣20 mL/min[19]。

1.4.5 粒度 取各樣品渦旋振蕩1 min 后再進行粒度分布測定，測定條件：激光粒度儀設(shè)置分散劑為水，轉(zhuǎn)速1 800 r/min，測定模式為手動，分散模式為多分散，每個樣平行測5 組。搖勻樣品，移液槍吸取后緩慢注入分散劑中，直至遮光度在10%～20%之間，開始測定粒度分布狀況[20]。

1.4.6 色度 采用色度計直接測量蛋清粉的L*、a*、b*值（國際照明委員會實驗室色度模式）。L*表示亮度，a*表示紅色（+）或綠色（-），b*表示黃色（+）或藍色（-）。ΔE 為各樣品經(jīng)凍干后與對照樣品（凍干鮮鴨蛋蛋白粉）的色差，按下式計算：

1.4.7 氨基酸組分分析 按照GB/T 5009.124-2016 《食品中氨基酸的測定》 對FDEWP、SDEWP、EH-DDEWP 中氨基酸組分進行分析。

1.5 統(tǒng)計分析

本研究中除特殊說明均做3 次重復(fù)試驗，數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，響應(yīng)面試驗采用Expert-Design 完成，差異性顯著采用ANOVA 分析，圖表繪制采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液的脫鹽

2.1.1 絮凝脫鹽單因素實驗 各因素對殼聚糖絮凝脫鹽效果見圖1，pH=6 時絮凝效果最好，pH值的改變影響了酶解液中蛋白及多肽分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量，溶液接近中性至堿性時，殼聚糖分子表面陽離子減少中和能力下降，絮凝效果也逐漸下降[21]。攪拌時間（圖1b）過長絮凝脫鹽效果反而下降，因此，選取5 min 作為攪拌時間。圖1c中絮凝脫鹽效果隨添加量上升，添加量達到0.3 g/L 時絮凝效果最優(yōu)，當(dāng)殼聚糖添加量超過0.3 g/L絮凝效果開始下降，溶液沉降速度變慢且開始渾濁，絮凝劑濃度過高反而會影響絮凝效果。在許永安等[22]、褚紹霞等[23]利用殼聚糖絮凝分離蛋白的研究中，也得到一致的結(jié)論。圖1d 中溫度對脫鹽率呈先上升后下降的趨勢，30 ℃效果最好。隨著溫度的升高分子運動加強，絮凝劑與蛋白及多肽分子間碰撞增多，發(fā)生脫穩(wěn)沉淀呈現(xiàn)上升趨勢。而殼聚糖的黏度在絮凝中起主要作用，溫度升高其黏度所有下降，絮凝效果及脫鹽率均下降[24]。因此，選取30 ℃作為絮凝溫度。

圖1 pH 值（a）、攪拌時間（b）、絮凝劑添加量（c）、絮凝溫度（d）對脫鹽率的影響Fig.1 Influence of pH（a），stirring time（b），flocculant amount（c）and flocculation temperature（d）on desalination rate

2.1.2 絮凝脫鹽條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 響應(yīng)面模型設(shè)計方案及結(jié)果見表1，回歸方差分析見表2。利用Design-Expert 8.0.6 軟件構(gòu)建各因素pH 值（A）、攪拌時間（B）、絮凝溫度（C）、絮凝劑添加量（D）與脫鹽率（Y）的二次多項回歸方程：Y=93.93+0.37A-0.66B+1.19C-0.32D+0.55AB-0.031AC-0.45AD-0.39BC+0.16BD-0.43CD-0.76A2-0.71B2+0.02C2-0.66D2。

表1 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Box-Behnken experimental design and results

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

如表2 方差分析結(jié)果顯示，模型P＜0.0001，回歸模型極顯著，失擬項P=0.0854＞0.05，模型失擬項水平上不顯著，該回歸方程能較好的擬合模型選擇是較合適的?；貧w方程相關(guān)系數(shù)R2=99.26%、R2Adj=98.53%，表明方程回歸效果較好，且響應(yīng)面數(shù)據(jù)有98.53% 來自表內(nèi)因素，該模型能夠解釋響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測絮凝作用下脫鹽率的變化。各因素對脫鹽率影響的次序為：絮凝溫度>攪拌時間>絮凝劑添加量>pH 值。

2.1.2.2 各因素交互及驗證試驗 通過各因素響應(yīng)面三維圖（圖2），下圖a、圖b、圖c 中，曲面隨絮凝溫度的增加而上升，最高點落在40 ℃處。整個響應(yīng)面曲面呈坡面，3 組交互作用中均含有絮凝溫度因素，3 組交互主要受絮凝溫度影響，最大值落在中心。圖d、圖e、圖f 中各因素變化呈先上升后下降的趨勢，在交互作用下形成的曲面呈拋物形曲面開口向下，等高線閉合最大值落在等高線內(nèi)。各因素交互圖隨著曲面上升顏色均呈現(xiàn)加深趨勢，最佳考察范圍在此范圍內(nèi)。

利用軟件對回歸方程求解得到絮凝的最優(yōu)工藝為：pH=6.04、絮凝溫度為40 ℃、攪拌時間5.56 min、添加量0.27 g/L，脫鹽率為96.0173%。結(jié)合實際情況，將最優(yōu)工藝參數(shù)定為pH=6、絮凝溫度為40 ℃、攪拌時間5.5 min、添加量0.27 g/L。利用上述最優(yōu)工藝重復(fù)3 次進行驗證，產(chǎn)物平均脫鹽率為96.18%，試驗值與理論預(yù)測值基本相吻合，該模型合理有效，得到的工藝參數(shù)有實用價值。

2.2 蛋清粉的理化性質(zhì)

2.2.1 蛋清粉的鹽度及蛋白質(zhì)含量 各蛋清粉中氮含量及含鹽量見表3，未脫鹽的兩種蛋清粉含鹽量均超過30%，酶解蛋清粉經(jīng)脫鹽濃縮干燥后，100 g 蛋清粉含1.4 g NaCl 已經(jīng)處于較低范圍。酶解后蛋清通過絮凝脫鹽含鹽量由30.15 g/100 g低至1.44 g/100 g，處理后蛋清粉中含鹽量約降低了96%，實現(xiàn)對咸蛋清的高效脫鹽。

表3 各蛋清粉成分Table 3 Composition of each egg white powder

2.2.2 起泡性 除比較咸蛋清粉、鮮蛋清粉、酶解咸蛋清粉、酶解脫鹽蛋清粉4 種蛋清粉外，另根據(jù)絮凝脫鹽優(yōu)化條件制備未經(jīng)酶解的脫鹽蛋清粉。各蛋清粉起泡性能見圖3a，不同濃度下，脫鹽蛋清和咸蛋清起泡性無明顯差距，酶解咸蛋清起泡性較咸蛋清有所提升，酶解可以提高蛋清的起泡性能，如涂勇剛等[5]使用木瓜蛋白酶對蛋清蛋白改性使起泡性提高2.09 倍。而酶解后再添加殼聚糖絮凝脫鹽的樣品起泡性能最優(yōu)，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 g/100 mL 時，鮮蛋清的起泡性達210%，而酶解脫鹽蛋清粉的起泡性達295%。這與劉超[25]的研究，先酶解后添加增稠劑等方法對蛋清蛋白改性得到一致結(jié)論，樣品起泡性也超過100%。

圖3 各蛋清粉起泡能力（a）、泡沫穩(wěn)定性（b）及各蛋清粉乳化活性（c）及乳化穩(wěn)定性（d）Fig.3 Foaming ability（a）and foam stability（b）of each egg white powder and emulsifying activity（c）and emulsion stability（d）of each egg white powder

各蛋清粉形成泡沫穩(wěn)定性見圖3b，酶解咸蛋清粉形成的泡沫穩(wěn)定性最差，泡沫在靜置過程中消失極快，而鮮蛋清粉和酶解脫鹽蛋清粉攪打后形成的氣泡均勻細膩，30 min 后泡沫結(jié)構(gòu)變化不大，穩(wěn)定性分別達到81.6%和88.5%，酶解改變了蛋清結(jié)構(gòu)造成起泡性有所改變，但絮凝劑的添加增加了蛋白質(zhì)的聚集程度提到了其起泡性及泡沫穩(wěn)定性[26]。

2.2.3 乳化性 圖3c 中各蛋清粉乳化活性均隨濃度提高，酶解脫鹽蛋清粉的乳化活性隨樣品濃度呈線性上升的趨勢，樣品質(zhì)量濃度為4 g/100 mL 時，鮮蛋清粉和脫鹽蛋清粉的乳化活性分別為0.65 和0.62。根據(jù)Paulson等[27]的報道，乳化活性與溶解性呈正相關(guān)。添加絮凝劑脫鹽使得樣品溶解度有所降低，可能是酶解脫鹽蛋清粉的乳化活性略低于鮮蛋清的原因。

乳化穩(wěn)定性見圖3d，樣品在形成乳化液后，維持乳狀液的穩(wěn)定主要依靠蛋白質(zhì)的疏水性，疏水性越強乳化液的穩(wěn)定性越強[28]。酶解會釋放蛋白中疏水基團，但酶解咸蛋清粉乳狀液穩(wěn)定性卻較差，可能是因為樣液里含大量的NaCl，大量電子存在破壞了乳狀液穩(wěn)定。酶解脫鹽蛋清粉的乳化穩(wěn)定性則遠高于其它樣品，樣品質(zhì)量濃度為4 g/100mL 時乳化穩(wěn)定性高達392%。

2.2.4 熱變性溫度 蛋清蛋白在吸熱過程中，通常存在卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（61～65 ℃）和卵清蛋白（75～84℃）的特征峰[19]，蛋清粉熱變性曲線見圖4，蛋清粉DSC 數(shù)據(jù)見表4，鮮蛋清粉（b）兩個吸收峰的熱變性溫度分別為63.80，80.39 ℃，咸蛋清粉（c）兩個吸收峰的熱變性溫度分別為60.18，76.94 ℃，咸蛋清的變性溫度向左偏移，可能是咸蛋清中存在大量的NaCl 對蛋清熱變性有誘導(dǎo)作用，有研究表明NaCl 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有擾亂[29]，且在董華偉等[1]的研究中，對咸蛋清通過電滲析脫鹽后，其熱變性溫度也較咸蛋清粉提高，蛋清粉中存在NaCl 會影響蛋清粉的熱穩(wěn)定性。酶解脫鹽蛋清粉（a）的熱變性曲線呈平緩下降趨勢，在溫度范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)變化峰無熱變性溫度，熱穩(wěn)定性提高。

表4 各蛋清粉的DSC 分析結(jié)果Table 4 DSC analysis results of egg white powder

圖4 各蛋清粉的DSC 曲線Fig.4 DSC curves of egg white powders

圖5 各蛋清粉粒徑分布圖Fig.5 Particle size distribution of egg white powder

2.2.5 粒度 表5 中咸蛋清粉、鮮蛋清粉和酶解脫鹽蛋清粉粒徑的中值平均粒徑D50 分別為65.80，51.04 和25.61 μm，咸蛋清粒徑平均粒徑最大，粒徑分布范圍最寬20.73～82.52 μm，D（3，2）和D（4，3）的差值越大，粒度分布越寬[30]?？赡艿扒宸壑懈吆}量會促使蛋清粉中蛋白質(zhì)顆粒變大[29]。酶解后蛋清粉平均粒徑下降，但粒徑分布較寬13.19～41.51 μm，可能不完全酶解或者酶切位點的不同使得酶解得到不同顆粒大小產(chǎn)物。該研究中所得產(chǎn)物粒徑同樣高于其它研究，可能由于蛋清酶解后經(jīng)殼聚糖絮凝與蛋清交聯(lián)，提高了酶解蛋清粉整體粒徑大小。

表5 蛋清粉粒徑分布結(jié)果表（μm）Table 5 Results of particle size distribution of egg white powder（μm）

2.2.6 色度分析 表6 中，鮮蛋清粉相比，脫鹽蛋清粉的L*、a*值均無顯著變化，b*值有所升高，酶解脫鹽后蛋清粉偏黃?？赡苁怯捎谠诿附馓幚頃r，蛋清熱處理過程中產(chǎn)生褐變導(dǎo)致顏色發(fā)生變化；咸鴨蛋清粉的L*、a*值較鮮蛋清粉有所差異可能是由于含鹽量較高，NaCl 是一種白色晶體，提高了咸蛋清粉的亮度。由于△E*均較小，說明與鮮鴨蛋清粉相比顏色均較為接近，樣品在視覺上都是白色，不影響蛋清粉的使用。

表6 蛋清粉的色度分析Table 6 Chroma analysis of egg white powder

2.2.7 氨基酸組分分析 氨基酸組分見表7，咸蛋清粉中NaCl 含量較高，氨基酸總量較低，脫鹽后酶解蛋清粉氨基酸占比增加。3 種蛋清粉中各氨基酸組分占比較為接近，酶解脫鹽蛋清粉的氨基酸組成中每日必須攝入氨基酸的含量與新鮮蛋清基本接近。從氨基酸組分來說，酶解蛋清經(jīng)絮凝脫鹽后，對氨基酸組成的影響不明顯。

表7 蛋清粉的氨基酸分析Table 7 Amino acid analysis of egg white powders

3 結(jié)論

本研究以咸蛋清為原料，使用木瓜蛋白酶制備得低水解度的蛋清酶解液，利用殼聚糖作絮凝劑，將酶解與絮凝技術(shù)耦聯(lián)制備得到酶解脫鹽蛋清粉。殼聚糖絮凝脫鹽經(jīng)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為pH=6、絮凝溫度為40 ℃、攪拌時間5.5 min、添加量0.27 g/L。處理后的蛋清粉含鹽量由咸蛋清粉33.09 g/100 g 低至1.44 g/100 g，含鹽量約降低了96%，實現(xiàn)高效脫鹽。與鮮蛋清粉、咸蛋清粉作對比，酶解絮凝耦聯(lián)制備蛋清粉粒徑較小，樣品質(zhì)量濃度為4 g/100 mL 時，形成的泡沫細密均勻穩(wěn)定性高，起泡性提高2.95 倍，30 min 后還有88%泡沫存在。絮凝后樣品溶解度有所降低，乳化活性略低于鮮蛋清粉為0.62，乳化穩(wěn)定性大幅提升，高達392%。從DSC 熱變性分析和粒度可看出，蛋清粉中NaCl 的存在會降低熱穩(wěn)定性且使樣品顆粒變大，而經(jīng)酶解脫鹽后的蛋清粉熱穩(wěn)定性提高，粒徑變小。蛋清粉顏色視覺上為白色不影響，營養(yǎng)成分也與鮮蛋清接近。通過將酶解與絮凝耦聯(lián)，可以實現(xiàn)高效脫鹽，并得到具有起泡性、乳化性、高熱穩(wěn)定性的改性蛋清粉，為提高咸鴨蛋清利用率及附加值提供了試驗依據(jù)和工藝參考。