CRISPR 相關(guān)技術(shù)在肉牛領(lǐng)域的研究進(jìn)展

吳天弋，黨靖宇，王添禎，張路培，高 雪，李俊雅，徐凌洋*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100091；2.富平縣畜牧發(fā)展中心，陜西渭南 711700）

基因編輯技術(shù)是指使用分子生物學(xué)手段對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行刪除、插入和替換等操作的生物工程技術(shù)[1,2]。在其發(fā)展過程中，最重要的成果就是各種基因組編輯器的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。其中又以鋅指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription Activator-Like Endonucleases，TALEN）和成簇而規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）[3]三個(gè)系統(tǒng)最為成熟。但是，與基于蛋白-核酸結(jié)合的ZFN和TALEN 基因組編輯器不同，CRISPR 是最新被發(fā)現(xiàn)、開發(fā)的一種基于堿基互補(bǔ)規(guī)則的基因組編輯器，這使得CRISPR 系統(tǒng)相比前兩者具有更簡(jiǎn)便的設(shè)計(jì)和使用步驟，這一系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)極大的促進(jìn)了基因編輯技術(shù)的發(fā)展。

如今CRISPR 已經(jīng)在疾病治療[4]與動(dòng)植物育種領(lǐng)域取得較大突破，本文簡(jiǎn)單回顧C(jī)RISPR 技術(shù)的開發(fā)現(xiàn)狀，并就CRISPR 技術(shù)在肉牛育種、生產(chǎn)過程中的應(yīng)用現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)進(jìn)行闡述。

1 基于堿基配對(duì)的基因編輯器：CRISPR/Cas9

成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）系統(tǒng)是在細(xì)菌和古生菌內(nèi)天然存在的免疫系統(tǒng)，能夠保護(hù)其免受外源DNA 的入侵[5]。早在1987年，Nakata 和他的團(tuán)隊(duì)就在E.coli 基因組中發(fā)現(xiàn)了這種特別的重復(fù)結(jié)構(gòu)[6]，每2 個(gè)重復(fù)序列間被獨(dú)特的間隔序列所分隔，因此將這種結(jié)構(gòu)命名為成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）。2007 年，人們?cè)谑葻崞咸亚蚓邪l(fā)現(xiàn)CRISPR 中間獨(dú)特的間隔序列來自于噬菌體的攻擊，細(xì)菌可以通過將噬菌體基因組DNA 添加到CRISPR 序列中，再配合 CRISPR 相關(guān)核酸內(nèi)切酶（CRISPR-Associated Endonuclease，Cas）蛋白形成對(duì)特定噬菌體的抗性[7]。如今我們常用的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，來自于對(duì)一種II 型CRISPR系統(tǒng)的改造，該系統(tǒng)來自化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes），由CRISPR 特異性決定RNA（crRNA）、輔助反式激活crRNA（tracrRNA）和核酸酶Cas9 組成[8]。crRNA/tracrRNA 復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9 在crRNA 配對(duì)的DNA 序列靶位點(diǎn)觸發(fā)雙鏈斷裂（Double-Strand Break，DSB），進(jìn)一步的研究通過將crRNA 和tracrRNA 連接融合，形成單引導(dǎo)RNA（Single guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 酶切體系，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了該工具的使用步驟[9]。

成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/ 相關(guān)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)要求的靶位點(diǎn)都有一個(gè)重要的共同特征，即原間隔物相鄰序列（Protospacer Adjacent Motif，PAM），而其原本作用是細(xì)菌的自我識(shí)別，由于細(xì)菌CRISPR 陣列中不含有PAM，從而避免了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)自身的剪切，一個(gè)典型的PAM 是5’-NGG-3’[9]。通過設(shè)計(jì)sgRNA，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以靶向任意緊鄰PAM 的一段20 個(gè)核苷酸序列，并且允許同時(shí)靶向多個(gè)基因組位點(diǎn)[8]，研究人員甚至可以快速設(shè)計(jì)大量sgRNA 進(jìn)行高通量敲除和基因篩選[10]。目前，CRISPR/Cas9 載體可以通過商業(yè)市場(chǎng)簡(jiǎn)單獲取，通過設(shè)計(jì)特異性引導(dǎo)RNA（gRNA）序列并導(dǎo)入能生產(chǎn)sgRNA 的質(zhì)粒后即可使用。對(duì)于合子階段的基因組編輯，CRISPR/Cas9 展現(xiàn)了與TALEN 一樣高有效性[11]，這讓CRISPR/Cas9載體的細(xì)胞質(zhì)顯微注射（Cytoplasmic Microinjection，CMI）得到了廣泛的運(yùn)用，研究顯示通過在合子階段進(jìn)行CMI 足以導(dǎo)致大多數(shù)（約2/3）出生的后代具有靶基因座的雙等位基因修飾[12]，這使得研究者可以繞過培養(yǎng)、篩選編輯成功的細(xì)胞，以及體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）的步驟，極大的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)基因編輯動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)流程。

2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)展

成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/ 相關(guān)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)自首次發(fā)布至今已有近10 年的時(shí)間了，人們也在開發(fā)應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)了其存在的不足之處，包括原始的Cas9蛋白介導(dǎo)的基因切割效率低、堿基失配導(dǎo)致的非靶標(biāo)位置切割、sgRNA 設(shè)計(jì)時(shí)需要尋找特定PAM 序列等，并通過各種技術(shù)策略做出相應(yīng)的改進(jìn)。

2.1 提高編輯效率

核酸酶對(duì)細(xì)胞基因組的編輯需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，因此為Cas9 蛋白添加核定位序列（NLS）可以優(yōu)化其工作效率[8]，這在如今的商業(yè)化質(zhì)粒中非常常見。又因包括CRISPR/Cas9 在內(nèi)的基因編輯工具本身只能產(chǎn)生DSB，后續(xù)都需要借助細(xì)胞自生的DNA 修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生非同源末端接 合（Non-Homologous End Junctions，NHEJ）和同源定向修復(fù)（Homologous Directed Repair，HDR/HR）[2]，其中HDR 能為細(xì)胞引入受控的突變，因而價(jià)值更大[13]。但是受限于HDR 的效率問題，實(shí)際試驗(yàn)的成功率并不是很高。目前，已有研究證明添加NHEJ 抑制劑SCR7[14]，能有效提高了HDR 效率。另外，由于HDR 發(fā)生在細(xì)胞周期的S 期和G2 期，在另一項(xiàng)研究中，通過多種藥物控制細(xì)胞周期[15]，顯著提高了HDR 比例，其中諾考達(dá)唑（nocodazole）效果最佳。也有研究通過siRNA 或shRNA 介導(dǎo)基因沉默下調(diào)NHEJ，從而間接提高HDR 效率[16]。此外，使用包含單鏈DNA 的特殊不對(duì)稱模板[17]、化學(xué)修飾的sgRNA[18]和一些小分子化合物也可以刺激HDR[19]。

由于染色質(zhì)開放程度的不同，基因編輯效率也有顯著差異，Liu 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)HDACI/II/III抑制劑恩替諾他（entinostat）使基因編輯頻率增加了3.7 倍，而泛HDAC 抑制劑帕比諾他（panobinostat）使效率增加了10.5 倍。

成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/ 相關(guān)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas9）的另一個(gè)常見缺點(diǎn)是它的gRNA 設(shè)計(jì)總是需要緊貼著PAM，這極大的限制了其應(yīng)用范圍。后來通過對(duì)Cas9 蛋白進(jìn)行修飾，分別開發(fā)出了5′-NNG-3′[21]和幾乎無特定PAM 需求[22]的Cas9 蛋白，并證明修飾過的Cas9蛋白與原版有著相似的編輯效率，很好的解決了這一缺點(diǎn)。當(dāng)然，在實(shí)際應(yīng)用過程中，由于CRISPR/Cas9 目前仍然沒有完全解決脫靶問題，因此選擇適當(dāng)?shù)腜AM 序列也能夠提高編輯的精確性，減少堿基錯(cuò)配導(dǎo)致的脫靶事件。

2.2 提高編輯準(zhǔn)確率

脫靶，也即在非目標(biāo)位置引入了計(jì)劃外的基因編輯，是CRISPR 系統(tǒng)最被關(guān)注的問題，因此研究人員通過很多辦法來提高這個(gè)工具的靶向特異性[23]。比如通過對(duì)Cas9 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，他們開發(fā)了eSpCas 9（1.1）[24]、SpCas 9-HF 1[25]、HeFSpCas 9[26]和HypaCas 9[27]等多種具有更高靶向特異性的酶。

另外，配對(duì)酶切是增加靶向特異性的方法。Shen 等[28]設(shè)計(jì)了一種Nickase Cas9（nCas9），這使得每個(gè)gRNA 只能產(chǎn)生一個(gè)對(duì)應(yīng)的DNA 單鏈斷 裂（Single-Strand Break，SSB），每次完成DSB 需要一對(duì)臨近的gRNA 共同引導(dǎo)，有效避免了脫靶編輯，后發(fā)現(xiàn)使用nCas9 可提高6 倍HDR插入效率[29]。也有研究將FokI 內(nèi)切酶連接到酶切活性失活的Cas9（dCas9）上，由于該酶在切割前必須二聚，相比普通Cas9，其靶向特異性提高了140 倍[30,31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用截短的gRNA（16～19nt）也能進(jìn)一步降低Cas9 的脫靶概率進(jìn)而提高其靶向特異性[32,33]。而使用更短的gRNA（<16 nt）（論文中稱為dead-RNAs，dRNAs）允許其僅引導(dǎo)Cas9 蛋白結(jié)合脫靶位點(diǎn)但不進(jìn)行切割，這可以有效保護(hù)這些容易出錯(cuò)的位點(diǎn)[33]。

同時(shí)，通過開發(fā)和應(yīng)用如SeqMap[34]、Cas-OFFinder[35]和sgRNAcas9[36]等脫靶預(yù)測(cè)軟件也可以減少潛在的脫靶位點(diǎn)，進(jìn)而挑選出最佳的gRNA 序列，幫助降低試驗(yàn)中出現(xiàn)脫靶的概率。

2.3 拓展編輯器功能

Komor 等[37]通過將胞苷脫氨酶與dCas9 工程化融合首次實(shí)現(xiàn)在不引入DSB 的前提下完成靶向的C>T 或G>A 轉(zhuǎn)換，該系統(tǒng)被稱為堿基編輯（Base Editing，BE）。根據(jù)不同堿基修飾酶，BE可分為胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor，ABE）[38]，分別完成C-G>T-A 或A-T>G-C 的轉(zhuǎn)換。最新的研究更是成功開發(fā)了一種C>G 的堿基編輯器CGBE1 及其小型化版本miniCGBE1，受控顛換突變（C>G）現(xiàn)在也是可能的[39]。

2019 年，一種名為先導(dǎo)編輯（Primer Editor，PE）的新型基因編輯方式被開發(fā)[40]，這是一種基于CRISPR/Cas9 的基因編輯方式，Andrew[41]通過將nCas9 蛋白與反轉(zhuǎn)錄酶融合，賦予該系統(tǒng)在靶位點(diǎn)切口處基于給定的RNA 模板延伸切口后端DNA 鏈的能力。后續(xù)通過細(xì)胞自身的修復(fù)能力將新的DNA 鏈替換入基因組。通過合理設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄模板鏈，該技術(shù)幾乎可以在基因組的任意位置進(jìn)行1～30bp 長(zhǎng)度的堿基編輯，這極大地拓展了對(duì)基因組中短片段的基因編輯能力，較好的解決了堿基編輯器編輯種類固定和編輯位置限制的問題。

3 CRISPR 在肉牛育種研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

傳統(tǒng)家畜育種的主要方法包括雜交育種和選擇性育種。當(dāng)下幾乎所有牲畜都是通過雜交和長(zhǎng)期選擇培育出來的[42]。與傳統(tǒng)育種不同，基因編輯育種可以在生物基因組中人為選定精確位點(diǎn)，直接刪除、修改或插入關(guān)鍵調(diào)控基因，從而快速培育出具有特定性狀的家畜新種質(zhì)。與過去的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR 技術(shù)可以有效避免重復(fù)而困難的蛋白設(shè)計(jì)、提純操作，是用于家畜遺傳改良的更有效工具[43]。近些年，研究者們已經(jīng)利用CRISPR 技術(shù)在家畜領(lǐng)域中取得了許多突破性的進(jìn)展[44]。

3.1 抵抗疾病

動(dòng)物傳染病是嚴(yán)重影響世界畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素Gao 等[45]使用基于nCas9 的HDR 技術(shù)將牛的NRAMP1 基因構(gòu)建到了牛的F-A 基因座上，使該基因原位過表達(dá)，顯著提升轉(zhuǎn)基因牛對(duì)牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）的抗病能力。Yuan 等[46]使用CRISPR/Cas9 結(jié)合HMEJ 的方法在牛的ROSA26 基因座中插入NRAMP1 基因，同樣獲得了有結(jié)核病抗性的牛。

3.2 提高產(chǎn)量

成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/ 相關(guān)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas9）技術(shù)已被應(yīng)用于改善肉牛的產(chǎn)肉能力[47]。肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN，或GDF-8）是在牛的雙肌性狀中被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵基因，其被證明能有效抑制肌肉生長(zhǎng)[48]。通過CRISPR/Cas9 敲除MSTN 能提高包括肉牛在內(nèi)的多種畜禽的產(chǎn)肉性能[49-51]。

3.3 改善動(dòng)物福利

在肉牛的養(yǎng)殖過程中，犢牛經(jīng)常被人工去角，以便減少爭(zhēng)斗和被更好的管理，然而去角的過程通常違背動(dòng)物福利原則，因而開展無角牛的育種具有很大的應(yīng)用前景。目前牛角形成的機(jī)制尚不清楚。有研究表明，polled 基因座上的基因突變與牛角形成密切相關(guān)，并且目前已知4 種誘發(fā)無角等位基因的變體，分別為：蒙古無角（PM）[52]、瓜拉尼無角（PG）[53]、弗里斯蘭無角（PF）和凱爾特?zé)o角（PC）[54,55]。Carlson 等[56]使用TALENs 技術(shù)將PC突變引入牛基因組中，成功獲得無角牛。然而Hennig 等[57]通過CRISPR/Cas9 敲除polled 基因座中PC突變的關(guān)鍵序列，以期獲得無角牛，但即使是雙等位基因敲除也沒有成功，這表明polled 基因座中的部分序列缺失并不一定能導(dǎo)致無角表型。因此仍然需要進(jìn)一步針對(duì)無角表型的成因進(jìn)行研究。

3.4 提高DNA/RNA 鑒定精確性

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）一直是基于DNA 的標(biāo)準(zhǔn)鑒定技術(shù)，但是在實(shí)際生產(chǎn)中，因?yàn)椴襟E繁瑣、儀器限制而難以推廣。CRISPR 技術(shù)可以提供一種37℃恒溫孵育的基于堿基配對(duì)的核酸鑒定方法。CRISPRCas13a 是II 型CRISPR 系統(tǒng)中唯一能夠切割RNA 的蛋白，Yao 等[58]使用CRISPR-Cas13a 技術(shù)開發(fā)了靈敏、特異且簡(jiǎn)單的牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）檢測(cè)方法，該方法是將待測(cè)樣品溶液與反應(yīng)液的混合液置于37℃孵育后使用儀器檢測(cè)熒光亮度，其30min 檢測(cè)靈敏度達(dá)到了1nmol/L，可以幫助用戶快速檢測(cè)特定病原體。另一種方法是將重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）與CRISPR 系統(tǒng)相結(jié)合，從而極大提高檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確性。RPA 是一種由Piepenburg 等[59]在2006 年開發(fā)的相對(duì)較新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可以37℃恒溫下用不到30min 的時(shí)間擴(kuò)增各種生物體中的RNA 和DNA 靶標(biāo)[60]。CRISPR 系統(tǒng)可以通過基于堿基配對(duì)的特異性切割對(duì)RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二次驗(yàn)證，大幅降低由引物錯(cuò)配導(dǎo)致的假陽(yáng)性出現(xiàn)。在植物領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)了多種基于CRISPR/Cas12a 與RPA 結(jié)合的用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，可檢測(cè)樣品中是否含有病原體[61]或轉(zhuǎn)基因[62]的DNA 片段。在動(dòng)物領(lǐng)域也有相關(guān)研究成果，Huang 等[63]使用該技術(shù)在37℃恒溫下45min 內(nèi)完成羊奶粉中的牛奶摻假檢測(cè)，并且靈敏度達(dá)到1%，對(duì)基因組的絕對(duì)靈敏度為10-2ng/μL，并使用這一技術(shù)檢測(cè)購(gòu)買的55 份羊奶粉樣品，共發(fā)現(xiàn)15 份樣品存在牛奶摻假。龍翠鈺[64]使用類似技術(shù)開發(fā)了豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）的核酸檢測(cè)方法，該方法僅需37℃反應(yīng)30min，即可通過在藍(lán)光下觀察肉眼可見的熒光判斷陽(yáng)性樣品，其靈敏度極好，即使模板拷貝數(shù)低至7×100拷貝數(shù)時(shí)，仍能檢測(cè)出目的核酸。上述方法能快速、準(zhǔn)確地鑒定目標(biāo)DNA 和RNA，囊括了絕大多數(shù)生物材料的鑒定需求，未來應(yīng)用前景十分廣闊。

4 CRISPR 技術(shù)的應(yīng)用展望

如今CRISPR 技術(shù)已經(jīng)在改善牛的抗病、動(dòng)物福利和牛肉產(chǎn)量等方面取得多方面的卓越成果。與以前的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR 編輯系統(tǒng)可以顯著提高家畜育種的效率和準(zhǔn)確性，但是仍然需要發(fā)現(xiàn)更多的高價(jià)值基因編輯位點(diǎn)，才能進(jìn)一步開發(fā)CRISPR 編輯系統(tǒng)在基因育種中的巨大潛力。首先，在無角牛的育種中，尚未明確解析無角牛的形成機(jī)制，導(dǎo)致已有的成功案例無法簡(jiǎn)單復(fù)制到其他牛品種中[57]，因此探索牛無角表型的分子機(jī)制，為無角牛編輯找到更有效的基因位點(diǎn)是無角牛育種中的重要工作。其次，在當(dāng)今肉牛育種中，其生長(zhǎng)和胴體性狀是兩類關(guān)鍵性狀，但目前對(duì)調(diào)控這些性狀的分子機(jī)制仍然缺乏研究，通過尋找更多有效的基因或變異位點(diǎn)，能幫助提高肉牛生長(zhǎng)速度和胴體品質(zhì)。再次，對(duì)于高品質(zhì)牛肉的開發(fā)，肌內(nèi)脂肪含量一直是育種工作的重點(diǎn)，但是肌內(nèi)脂肪的沉積往往伴隨大量其他區(qū)域的脂肪，顯著降低了高品質(zhì)牛肉的產(chǎn)出速度，提高了消費(fèi)成本，因此找到調(diào)控肌間脂肪沉積的關(guān)鍵基因具有重要意義。最后，衡量肉牛經(jīng)濟(jì)價(jià)值的另一個(gè)重要指標(biāo)是飼料轉(zhuǎn)換率，飼料在舍飼肉牛養(yǎng)殖成本中占比極高（86%～91%）[65]，因而探索相關(guān)基因和變異位點(diǎn)以提高飼料轉(zhuǎn)化率能顯著降低飼養(yǎng)成本。

已有的研究表明CRISPR/Cas12a 與Cas13a 蛋白在細(xì)胞外能在對(duì)應(yīng)的crRNA 引導(dǎo)下分別靶向與非靶向地切割目標(biāo)及其附近的DNA（Cas12a）[64]或RNA（Cas13a）[58]。將這一特性應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)能實(shí)現(xiàn)便捷、精準(zhǔn)且高靈敏度的快速檢測(cè)，比如快速檢測(cè)牛肉中的其他肉類混合，或者在牛的血液中檢測(cè)各種可能的病原微生物，這將極大地降低生物樣品的檢測(cè)門檻。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步完善相關(guān)技術(shù)的開發(fā)，在保持可靠性的同時(shí)降低核酸檢測(cè)的試驗(yàn)門檻與使用價(jià)格，才能讓這一技術(shù)真正服務(wù)于生產(chǎn)。

但是CRISPR 技術(shù)發(fā)展至今仍然有許多缺點(diǎn)需要優(yōu)化。進(jìn)一步提高基因編輯的效率仍然是CRISPR 技術(shù)的研發(fā)重點(diǎn)，Allen 等[66]最新研究發(fā)現(xiàn)，通過將敲入位點(diǎn)選擇在GAPDH 這樣的必需基因的外顯子內(nèi)，并結(jié)合特殊設(shè)計(jì)的質(zhì)粒載體，實(shí)現(xiàn)了90%以上的基因敲入效率，這一技術(shù)為特定的基因敲入提供了高效的選擇，極大地縮短了基因編輯動(dòng)物的獲取時(shí)間。但是與選擇在基因間區(qū)的“安全港”插入目的基因相比，這一技術(shù)因?yàn)樯婕爸匾墓δ芑颍部赡茉黾悠渌粗娘L(fēng)險(xiǎn)。

降低基因編輯帶來的不確定風(fēng)險(xiǎn)同樣值得關(guān)注，Xin 等[67]研究首先發(fā)現(xiàn)在多種CRISPR 系統(tǒng)編輯后的細(xì)胞中存在染色體易位、染色體大片段缺失，特別是Cas9 進(jìn)行的基因編輯中，5.2%的受編輯細(xì)胞中產(chǎn)生了外源性DNA 片段（來源于載體）插入，這些不確定性始終是該技術(shù)應(yīng)用于基因編輯動(dòng)物生產(chǎn)的巨大障礙。目前，解決此障礙的方式有2 種。一是研發(fā)具有更高特異性和安全性的核酸酶，例如Cas12f。二是使用無DNA技術(shù)進(jìn)行基因編輯，即直接使用Cas9 蛋白與sgRNA 復(fù)合物（RNP）進(jìn)行編輯，從而排除外源DNA 片段插入的風(fēng)險(xiǎn)。

最后，確保農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不會(huì)對(duì)人類健康或環(huán)境造成危害是我國(guó)推進(jìn)基因編輯育種的重要前提。因此基因編輯動(dòng)物的肉質(zhì)安全不容忽視，Zhao 等[68]研究結(jié)果表明，MSTN 和FGF5 雙基因敲除的羊肉對(duì)大鼠的健康無影響。同時(shí)使用引物延伸介導(dǎo)測(cè)序（PEM-seq）和基因組深度測(cè)序等技術(shù)精確鑒別轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的靶外事件也是這些動(dòng)物產(chǎn)品流向大眾前的重要安全保證。

綜上所述，CRISPR 技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種與核酸檢測(cè)方面展現(xiàn)了巨大的價(jià)值，極大地推動(dòng)著肉牛領(lǐng)域的研究。我們應(yīng)當(dāng)思考如何更好地開發(fā)、應(yīng)用和監(jiān)管這一技術(shù)以加速我國(guó)肉牛育種和生產(chǎn)水平的進(jìn)步。