口蹄疫病原學(xué)及化學(xué)發(fā)光方法國內(nèi)外研究進(jìn)展

肖 敏，肖 蕾，徐崢嶸，薛慧文

（1.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046；2.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅蘭州 730046；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州 730070）

1 口蹄疫病原學(xué)國內(nèi)外研究進(jìn)展

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的豬、牛、羊等偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染性疾病。全世界均有分布，宿主范圍廣，主要特征是口、鼻、蹄及乳頭等部位發(fā)生水皰、潰瘍、爛斑。該病的致病性和感染性特別強，可快速傳播，感染發(fā)病率可達(dá)100%，使得病畜生產(chǎn)能力下降，畜牧養(yǎng)殖損失慘重。我國將其列為一類動物疫病之首[1]。

1.1 病原

口蹄疫病毒屬微RNA 病毒目、微RNA 病毒科、口蹄疫病毒屬，此病毒共分為A 型、O 型、C 型、Asia1 型、SAT1 型、SAT2 型和SAT3 型7個血清型，同一血清型還分為不同的基因型，各血清型之間無交叉免疫，給口蹄疫防控帶來巨大的困難[2]。口蹄疫由4 個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）組成病毒衣殼蛋白，保護(hù)RNA 免遭核酸酶降解，10 個非結(jié)構(gòu)蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB、3ABC）構(gòu)成，非結(jié)構(gòu)蛋白的主要功能是參與RNA 復(fù)制、多聚蛋白的裂解以及結(jié)構(gòu)蛋白的折疊和裝配過程[3]。FMDV 為無囊膜的病毒粒子，病毒衣殼結(jié)構(gòu)是由20 面體組成，VP1、VP2、VP3 位于衣殼 外部，表面有重要的中和抗原表位刺激機體產(chǎn)生抗體。VP1 和VP3 是不對稱蛋白，組裝成核衣殼保護(hù)內(nèi)部核酸不受傷害?？谔阋弑砦谎芯康闹攸cVP4 位于衣殼內(nèi)部。

1.2 口蹄疫病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能

口蹄疫病毒基因組為單股正鏈RNA，約由8500 個核苷酸組成。FMDV 呈球形，為無囊膜的二十面體結(jié)構(gòu)?；蚪M的5’UTR 較長，最長的約有1300nts，有豐富的二級結(jié)構(gòu)，第一個核苷酸為U，能與VPg 以共價鍵的形式結(jié)合。5’UTR沒有帽子結(jié)構(gòu)，有幾個十分保守的閱讀框，調(diào)控著病毒蛋白的合成與RNA 的復(fù)制。5’UTR 中還有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點，調(diào)控著翻譯的起始作用。3’UTR 由兩部分組成，一部分位于非結(jié)構(gòu)蛋白3D 之后，大約為100 個氨基酸，另一部分為poly（A）結(jié)構(gòu)，主要是RNA 聚合酶3D 識別的信號[4]?？谔阋卟《綜 殘基的同聚體位于RNA的S-片段3’測，被稱為poly（C）段，這是口蹄疫病毒和大多數(shù)病毒基因組的共同特征。poly（C）的長度在不同毒株之間有較大的差異。在口蹄疫病毒RNA 中，有一段序列位于poly（C）和IRES 原件之間，包含著許多假結(jié)節(jié)，位于poly（C）段的5’端側(cè)，參與poly（C）段的連接功能。

1.3 口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白及其功能

口蹄疫病毒病毒的衣殼是由VP1、VP2、VP3、VP4 等4 種結(jié)構(gòu)蛋白形成的五聚體單位構(gòu)成的。4 種結(jié)構(gòu)蛋白借助組氨酸聚合成病毒衣殼，決定了病毒在酸性條件下很穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)蛋白中只有VP4 位于核衣殼的內(nèi)部，VP1、VP2 和VP3 都位于衣殼表面。由于VP1 能使機體產(chǎn)生抗體，達(dá)到保護(hù)機體的功能并進(jìn)一步?jīng)Q定病毒的抗原性。VP1 上的G-H 環(huán)是細(xì)胞表面受體識別的位點，VP1 是最容易變異的蛋白，能引起抗原表位的變異[5]。VP2 具有很好的抗原性，它可以特異性地刺激機體產(chǎn)生抗體。3C 蛋白酶可以使P1 結(jié)構(gòu)蛋白裂解成VP0、VP1 和VP3。病毒衣殼蛋白的主要功能為保護(hù)病毒核酸免受核酸酶降解，決定著病毒的抗原性，包裝和遞呈病毒RNA，決定宿主的范圍和組織嗜性等[6]。

1.4 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能

非結(jié)構(gòu)蛋白能由于具有非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)原性，因此可用于檢測口蹄疫病毒?？捎糜跈z測的非結(jié)構(gòu)蛋白主要有L、2C、3ABC、3D 蛋白。L蛋白免疫原性較其他蛋白低，產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間較短，但高度特異，必須結(jié)合其他蛋白檢測動物是否感染口蹄疫。L 蛋白至少有兩種存在形式，Lab 和Lb，它是由框架內(nèi)密碼子AUG 翻譯而形成的。口蹄疫病毒的第一次裂解階段發(fā)生在2A的C 末端，形成P1-2A 前體。2A 和2B 序列是-NPG/P-序列，很保守。幾乎所有感染口蹄疫病毒的動物都能產(chǎn)生2C 抗體，2C 抗體可在動物體內(nèi)持續(xù)12 個月?？谔阋叩?A 蛋白比其他病毒的3A 蛋白都大，由153 個氨基酸組成，是抑制蛋白分泌的主要蛋白。3B 蛋白是VPg 尿酸化后，是合成RNA 的引物，由3 個相連但大小不同的基因編碼。3ABC 蛋白抗體在機體內(nèi)存在時間較長，感染牛最早3 天時間就可以檢出，最長可在機體中存在2 年。目前檢測3AB 和3ABC 蛋白抗體是鑒別動物是否免疫和感染口蹄疫病毒的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)報道，2B、3B 和2C 上存在可以用來檢測非結(jié)構(gòu)抗體的特異性B 細(xì)胞表位?？谔阋卟《揪幋a序列內(nèi)的大多數(shù)聚蛋白是由3C 蛋白酶負(fù)責(zé)裂解，在加工的過程中不需要3D 序列發(fā)揮功能。

2 化學(xué)發(fā)光技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 化學(xué)發(fā)光技術(shù)概述

20 世紀(jì)60 年代放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），因其靈敏度高和特異性強，迅速得到推廣。但由于存在放射性污染，在此基礎(chǔ)上Halman 等[7]于1977 年發(fā)明了化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析相比熒光免疫分析（Fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）、酶聯(lián)免疫分析、放射免疫分析具有特異性強、線性范圍廣、靈敏度高、無輻射、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品分析、農(nóng)藥殘留檢測等各個方面。

2.2 化學(xué)發(fā)光劑種類

2.2.1 魯米諾及其衍生物

魯米諾（Luminuo）其衍生物是化學(xué)發(fā)光免疫分析中最早應(yīng)用的一種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。魯米諾性質(zhì)穩(wěn)定，在堿性條件下可被H2O2等氧化劑氧化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光。但是，該化學(xué)反應(yīng)較慢，發(fā)光時間較短，往往需要給反應(yīng)體系中加入酶或其他催化劑加快反應(yīng)速度。酶類主要有辣根過氧化物酶（HPR），無機物有Fe3+、Cu2+、Co2+等。加入這些催化劑后，化學(xué)發(fā)光強度明顯增強，化學(xué)發(fā)光時間延長。魯米諾及其衍生物化學(xué)發(fā)光分析廣泛應(yīng)用于蛋白、核酸等領(lǐng)域。

2.2.2 吖啶酯類

吖啶酯（Acridinium ester，AE）是重要的化學(xué)發(fā)光試劑。當(dāng)過氧化氫處于堿性溶液中時，吖啶脂就能迅速發(fā)光。具體原理為：處于堿性溶液中的吖啶脂能迅速被過氧化氫氧化，生成不穩(wěn)定的二氧乙烷，二氧乙烷酮分解成激發(fā)態(tài)的N-甲基吖啶酮和CO2，當(dāng)返回到基態(tài)時釋放出波長約為430nm 的光。吖啶脂作為化學(xué)發(fā)光試劑不需要催化劑，且具有發(fā)光效率高、時間長等優(yōu)點。

2.2.3 (金剛烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物

（金剛烷）-1,2-二氧乙烷（AMPPD）及其衍生物常應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光體系，有穩(wěn)定性高、檢測范圍廣、有效期長等優(yōu)點。用堿性的磷酸酶（AP）標(biāo)記抗原或者其他抗體，一并加入（金剛烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物和增強劑，從而引起化學(xué)發(fā)光。通過測定發(fā)光強度，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測物濃度。

2.2.4 高錳酸鉀

高錳酸鉀是化學(xué)發(fā)光體系中最常用的氧化劑之一，它能與還原性的物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物質(zhì)，激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)發(fā)生化學(xué)發(fā)光。由于高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光體系較為穩(wěn)定，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等方面?？梢栽谒嵝匀芤褐校愿咤i酸鉀為氧化劑測定對氨基苯甲酸類麻醉劑、腎上腺素、利血平、胡延索乙素、嗎啡、海洛因等。

2.3 化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)的應(yīng)用

2.3.1 化學(xué)發(fā)光分析在農(nóng)藥殘留方面的檢測

農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于病蟲害的防治，但是大量使用會造成環(huán)境污染和危害人類健康。目前農(nóng)藥殘留檢測方面最常用方法有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜法-質(zhì)譜法，氣相色譜-質(zhì)譜法等。但由于儀器昂貴，分析時間較長，實驗方法較為繁瑣。Jin M 等[8]報道的三唑磷的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，使得三唑磷的最低檢測濃度為0.063ng/mL。由于酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測最低檢測極限達(dá)不到農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）要求，目前化學(xué)發(fā)光在農(nóng)藥殘留方面的檢測已經(jīng)成為研究熱點。

2.3.2 化學(xué)發(fā)光分析在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

化學(xué)發(fā)光免疫分析在醫(yī)學(xué)方面廣泛應(yīng)用。李雨升等[9]采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)對98 例前列腺增生患者、99 例前列腺癌患者和136 正常男性患者血清中的前列腺特殊抗原進(jìn)行測定和統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)合影像學(xué)分析，讓前列腺癌的診斷率大大提高。臨床上，化學(xué)發(fā)光免疫分析在藥物分析方面也有廣泛應(yīng)用，如用于檢驗地塞米松、心得安、鹽酸多巴胺、阿托品、多貝斯等藥物。如DPC 的IMMULITE 全自動CLIA 系統(tǒng)，該試劑盒能對心臟病、甲狀腺功能、傳染病、糖尿病等疾病進(jìn)行檢測，還可以對血清、藥物和腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測。

2.3.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析在生物毒素檢測方面的應(yīng)用

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法已在生物毒素中廣泛應(yīng)用，如檢測葡萄球菌腸毒素、黃曲霉毒素、伏馬菌素等。雖然化學(xué)發(fā)光免疫分析具有較高的靈敏度，但仍需要開發(fā)，提高穩(wěn)定性。Magliulo等[10]在化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了牛奶中黃曲霉毒素M1 免疫分析檢測方法。將黃曲霉毒素M1 的偶聯(lián)物包被在化學(xué)發(fā)光板上，加入相應(yīng)的抗體和待檢測物質(zhì)，最后加入酶標(biāo)二抗，實現(xiàn)對黃曲霉毒素M1 的定量檢測。

2.3.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析在食品方面的應(yīng)用

化學(xué)發(fā)光免疫分析在食品原料安全檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在食品添加劑、違禁物、調(diào)味食品的原料檢測當(dāng)中得到應(yīng)用。Ding 等[11]用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法實現(xiàn)了對食醋原料蘋果和梨中鹽堿類農(nóng)藥氯噻啉的快速檢測，線性范圍為0.13～5.84ng/mL，與其他方法相比靈敏度高，線性范圍更廣。三聚氰胺是一種有機化工原料，危害人的生命健康安全，被有些不法分子用來提高乳品中氮含量。曾華金等建立了流動注射化學(xué)發(fā)光法來檢測牛奶中三聚氰胺的含量。在堿性溶液中，使用三聚氰胺能和魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系建立快速檢測牛奶中三聚氰胺的方法。在最優(yōu)的條件下，檢測范圍為0.2～80μg/mL。檢測過程中沒有發(fā)生交叉反應(yīng)，結(jié)果可靠。

食品中病原微生物能引起食物腐敗變質(zhì)，并可導(dǎo)致人食物中毒甚至危害生命安全?，F(xiàn)階段的病原微生物檢測方法較為繁瑣，耗時長，不能滿足快速檢測需要。目前，基于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)實現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測，能做到快速準(zhǔn)確，顯著降低檢測的時間。郭小英等[12]用化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法檢測大腸桿菌，極大地提高了大腸桿菌的檢測速度。

2.3.5 化學(xué)發(fā)光分析在環(huán)境中的應(yīng)用

由于氣相化學(xué)發(fā)光分析法具有較高的靈敏度，被作為英國官方分析方法，并被美國國家環(huán)境保護(hù)署用于檢測原油中含氮化合物和大氣中臭氧。世界衛(wèi)生組織檢測系統(tǒng)也將化學(xué)發(fā)光分析法列為檢測大氣中氮氧化合物的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.3.6 化學(xué)發(fā)光免疫分析在獸醫(yī)產(chǎn)科方面的應(yīng)用

國外已出現(xiàn)檢測雌激素、促黃體生成素、催乳素等生殖激素的相關(guān)化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，可以快速、大量檢測生殖激素。對生殖激素的不定期檢測可以保障家畜的正常生殖和發(fā)育，對畜牧業(yè)具有重大意義。

2.3.7 化學(xué)發(fā)光免疫分析在病原檢測及疾病診斷中的應(yīng)用

（1）結(jié)核病的化學(xué)發(fā)光檢測方法

陽幼榮等[13]用CLIA 和ELISA 結(jié)核病試劑盒檢測血清中的抗體，并對結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)260 例肺結(jié)核患者中檢出率分別為71.2%（185/260）和58.5%（152/260），說明在結(jié)核抗體檢測中，CLIA 試劑盒的靈敏度顯著高于ELISA 試劑盒。

侯英等[14]用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析對結(jié)核病的全血γ-干擾素進(jìn)行定量檢測，可以檢測到pg/mL（10～12pg/mL）水平的γ-干擾素，為診斷結(jié)核桿菌感染提供了、穩(wěn)定、快速、靈敏度高、特異性強的檢測方法。與傳統(tǒng)的PPD 皮膚實驗相比較，對393 名新入伍的戰(zhàn)士進(jìn)行結(jié)核桿菌病的篩查，結(jié)果顯示PPD 試驗的陽性率為46.6%，全血γ-干擾素的陽性率為21.6%，兩種方法的一致率為60.8%。全血γ-干擾檢測方法可以提高結(jié)核桿菌敏感性和特異性，可以成為一種新的檢測結(jié)核桿菌的方法。

（2）單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的化學(xué)發(fā)光檢測方法

范龍興[15]等人將抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的兔多抗與磁性微球偶聯(lián)構(gòu)建了免疫磁分離原件，并應(yīng)用雙抗夾心法ELISA 檢測李斯特氏菌全菌抗原，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫法進(jìn)行定量檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定了李斯特氏菌的濃度?；瘜W(xué)發(fā)光檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合優(yōu)度為0.954，最低檢出限為10～4CFU/mL，特異性良好。

（3）梅毒的化學(xué)發(fā)光檢測方法

楊璐[16]用磁性微粒與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用建立的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法，用來檢測血液中梅毒螺旋體，極大地提高了檢測的靈敏度，該方法操作簡單，發(fā)展前景很廣，值得推廣。該方法主要形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原雙抗原夾心復(fù)合物后，加入化學(xué)發(fā)光底物和辣根過氧化物，通過化學(xué)發(fā)光儀捕捉發(fā)光信號，實現(xiàn)對梅毒螺旋抗體的檢測。方陣實驗最終確定抗原包被量為每孔210ng/mL，抗原稀釋度為1∶3000，HPR 稀釋液為PBST+1%BSA，血清稀釋液為PBS+0.1%BSA。該方法檢測80 例梅毒抗體陰性血清，陰性符合率為100%，相比較商品化的梅毒化學(xué)發(fā)光試劑盒，靈敏度提升了4 倍。該方法具有很好的靈敏度和線性范圍，有很好的應(yīng)用前景。

（4）豬細(xì)小病毒病的化學(xué)發(fā)光檢測方法

周媛[17]用化學(xué)發(fā)光免疫方法檢測豬細(xì)小抗體，與傳統(tǒng)方法相比具有操作簡便、線性范圍廣、檢測成本低等優(yōu)勢。最優(yōu)條件下，血清稀釋度為1∶80，檢測其他病陽性血清，不存在交叉反應(yīng)。該方法與豬細(xì)小病毒病ELISA 試劑盒比較，特異性為87.5%，敏感度為93.3%，檢測效率為90%。結(jié)果表明，該方法可以應(yīng)用到臨床當(dāng)中去。

（5）人類登革熱病毒的化學(xué)發(fā)光檢測方法

朱天川[18]用化學(xué)發(fā)光免疫分析法建立了快速檢測人類登革熱病毒的方法。相比傳統(tǒng)的PCR 法和血清法，操作簡便，靈敏度和特異性高。包被抗原的濃度為10μg/mL，血清稀釋為1∶400，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶160000。該試驗共檢測176 臨床標(biāo)本，結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，能把瘧疾感染和自身免疫病區(qū)分開，具有很好的應(yīng)用前景，對人類登革熱病疫苗的研發(fā)具有一定的意義。

（6）乙肝表面抗原化學(xué)發(fā)光檢測方法

結(jié)合我國乙肝病毒感染的現(xiàn)狀，反應(yīng)快、靈敏度高、特異性高的檢測方法的建立尤為重要。蔣玲莉[19]建立了化學(xué)發(fā)光法診斷乙肝表面抗原的方法。馬超[21]用化學(xué)發(fā)光和磁分離技術(shù)，建立了快速、高通量、實用的肝炎分子檢測技術(shù)。通過對體系中多個條件的優(yōu)化，檢測結(jié)果可靠。也可以應(yīng)用到其他疾病的檢測。

3 小結(jié)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到各個領(lǐng)域，尤其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品、工業(yè)、生物等領(lǐng)域，取得了顯著的成果。但化學(xué)發(fā)光在口蹄疫的應(yīng)用很少有報道，相比酶聯(lián)免疫吸附劑測定及其他檢測方法，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、耗時短等優(yōu)點，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的ELISA 檢測方法。因此，本文對化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)進(jìn)行綜述，以期能探索建立一種能夠快速檢測口蹄疫病毒并能區(qū)分口蹄疫疫苗免疫動物與自然感染動物的方法，為FMDV 的診斷提供一種新的方法，實際解決目前FMDV 診斷中存在的問題。