GLP-1類似物司美格魯肽對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能影響

王 林 惠燦燦 賈同貞 胡一帆 布威艾吉爾 單超越 劉宇龍 王婧婧 畢婷婷 鄧大同

神經(jīng)心理測(cè)試顯示糖尿病患者的認(rèn)知功能有輕度到中度下降[1]，2型糖尿病甚至可導(dǎo)致癡呆風(fēng)險(xiǎn)增加50%[2]。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）及其類似物是近年來應(yīng)用的新型降糖藥，通過激活GLP-1受體，以葡萄糖濃度依賴方式增強(qiáng)胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，并能夠延緩胃排空，通過中樞性食欲抑制減少進(jìn)食，從而達(dá)到降低血糖、減肥等作用。根據(jù)作用時(shí)間長(zhǎng)短，GLP-1可分為短效（利西拉肽、艾塞那肽等）和長(zhǎng)效（司美格魯肽、利拉魯肽等）。許多研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可減輕糖尿病或肥胖引起的認(rèn)知功能障礙。利西拉肽可顯著改善肥胖、胰島素抵抗與認(rèn)知障礙小鼠的識(shí)別記憶，促進(jìn)海馬祖細(xì)胞增殖[3]，利拉魯肽可抑制鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)退行性病變，改善糖尿病認(rèn)知功能衰退動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力[4]。Betatrophin蛋白主要在肝臟和脂肪組織中表達(dá)，其可調(diào)節(jié)脂代謝[5]，對(duì)糖代謝影響未明確。本研究通過構(gòu)建糖尿病大鼠模型，探究司美格魯肽對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能的影響以及Betatrophin與糖代謝的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（210±30）g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠均在適宜溫度及濕度下喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，12 h光照與黑暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)符合安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)實(shí)施細(xì)則和相關(guān)規(guī)定。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組（NC組，n=12）、糖尿病組（DM組，n=12）、司美格魯肽治療組（DM+SE組，n=6）。NC組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，DM組與DM+SE組給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ（35 mg/kg），72 h后隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。DM+SE組給予司美格魯肽皮下注射（藥物說明書示大鼠實(shí)驗(yàn)使用劑量為0.07～0.63 mg/kg·w-1，本實(shí)驗(yàn)0.1 mg/kg·w-1），NC組與DM組大鼠給予等量生理鹽水皮下注射，共治療8周。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察 觀察各組大鼠進(jìn)食量、飲水量，記錄體質(zhì)量變化。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)：治療8周后，每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，第1天不收集數(shù)據(jù)，讓大鼠熟悉水池環(huán)境，第2天將圓形平臺(tái)置于第三象限中環(huán)，將大鼠分別從四個(gè)象限入水點(diǎn)面朝水池壁放入水池，開始計(jì)時(shí)，觀察大鼠游泳情況，當(dāng)大鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)停留3 s后停止計(jì)時(shí)，計(jì)時(shí)時(shí)間為逃避潛伏期。若90 s內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)，則記錄逃避潛伏期為90 s，同時(shí)將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上，在平臺(tái)上停留15 s，將4個(gè)象限逃避潛伏期均值作為當(dāng)天成績(jī)進(jìn)行分析，該實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5天，比較各天各組逃避潛伏期差異?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：大鼠完成定位航行實(shí)驗(yàn)后，撤除水迷宮平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限放入水中，記錄大鼠90 s內(nèi)在原平臺(tái)象限停留時(shí)間與大鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)，比較各組差異。

1.5 血糖、血脂測(cè)定 治療結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h行腹腔注射麻醉，將大鼠開腹，從腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，測(cè)定血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6 胰島素、Betatrophin測(cè)定 血清保存于4℃冰箱，按照ELISA試劑盒測(cè)定血清胰島素（INS，mU/L）、Betatrophin（ng/mL）含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（±s）描述，正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 司美格魯肽對(duì)糖尿病大鼠一般情況影響 DM組與DM+SE組大鼠較NC組出現(xiàn)多飲、多食癥狀。治療結(jié)束后，DM組大鼠體質(zhì)量（347.5±10.5）g，與DM+SE組大鼠體質(zhì)量（350.7±7.9）g比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），較NC組體質(zhì)量（386.3±16.5）g明顯下降（P＜0.001）。DM組與DM+SE組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.625），見圖1。

圖1 大鼠體質(zhì)量及Betatrophin水平比較

2.2 司美格魯肽對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖、血脂影響 DM組大鼠空腹血糖水平高于NC組（P=0.001），DM+SE組大鼠甘油三酯水平高于NC組（P=0.006），其余各組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 大鼠血糖、血脂情況比較（±s）

表1 大鼠血糖、血脂情況比較（±s）

注：P值代表三組總體差異水平；與NC組比較*P＜0.05

組別nGLU(mmol/L)TC(mg/dl)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)NC125.17±1.2360.93±13.951.54±0.413.26±0.59 DM126.89±1.18*56.47±4.041.87±0.883.46±0.57 DM+SE65.93±0.4561.45±17.762.43±0.443.58±0.44*F/HF=7.313H=0.906H=5.986H=1.752 P 0.030.6360.050.416

2.3 司美格魯肽對(duì)糖尿病大鼠INS、Betatrophin影響 DM組（102.95±26.76 ng/mL，P＜0.001）與DM+SE組（86.98±19.52 ng/mL，P＜0.001）Betatrophin水平較NC組（45.10±12.28 ng/mL）明顯升高，DM組與DM+SE組Betatrophin水平無顯著差異（P=0.132）。NC組（6.54±1.47 mU/L）、DM組（6.99±1.34 mU/L）與DM+SE組（7.87±2.82 mU/L）INS水平均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.517）。

2.4 定位航行實(shí)驗(yàn) 隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加，各組大鼠逃避潛伏期均縮短，說明各組大鼠均具有學(xué)習(xí)記憶能力。第3天DM組（P=0.010），第4天DM組（P=0.006）、DM+SE組（P=0.011），第5天DM組（P=0.002）、DM+SE組（P=0.014）逃避潛伏期均長(zhǎng)于NC組。DM組與DM+SE組各天數(shù)逃避潛伏期均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

表2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，s）

表2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，s）

注：P值代表三組總體差異水平；與NC組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別n第1天第2天第3天第4天第5天NC組652.23±14.3436.05±10.2525.87±9.6719.32±6.8116.12±6.36 DM組660.75±20.9645.98±16.6036.78±13.75*29.82±12.77**24.20±8.74**DM+SE組658.25±19.0148.52±24.4834.62±15.6230.67±15.96*21.82±6.76*H 3.1763.6308.95011.94814.146 P 0.2040.1630.0110.0030.001

2.5 空間探索實(shí)驗(yàn) NC組、DM組與DM+SE組大鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)與原平臺(tái)象限停留時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表3 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

組別n穿越次數(shù)(次)停留時(shí)間(s)NC組63.38±1.4123.88±1.76 DM組63.08±1.1423.80±2.56 DM+SE組62.96±1.4024.27±2.28 F/HH=1.147F=0.286 P 0.5640.752

3 討論

認(rèn)知功能下降是糖尿病新出現(xiàn)的長(zhǎng)期并發(fā)癥，GLP-1及其類似物在治療2型糖尿病之外表現(xiàn)出其他生理作用，如保護(hù)神經(jīng)與心臟、降低高血壓、抑酸、增加溶酶和防止炎癥等。GLP-1類似物可在神經(jīng)元結(jié)構(gòu)中發(fā)揮抗炎作用，也可上調(diào)大腦胰島素受體，進(jìn)而改善胰島素依賴性認(rèn)知障礙。Cui SS等[6]發(fā)現(xiàn)GLP-1及其類似物可以抑制大鼠炎癥反應(yīng)，從而改善神經(jīng)膠質(zhì)形態(tài)和海馬功能。艾塞那肽、利拉魯肽能夠作用于糖尿病小鼠胰島素信號(hào)通路，保護(hù)神經(jīng)和改善認(rèn)知功能[7]。GLP-1及其類似物改善認(rèn)知相關(guān)機(jī)制還涉及抗氧化、抗毒性、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性、抑制神經(jīng)凋亡等。

本研究通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試和評(píng)價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)認(rèn)知能力，DM組（第3、4、5天）與DM+SE組（第4、5天）大鼠逃避潛伏期長(zhǎng)于NC組，說明糖尿病會(huì)導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力受損。然而DM組與DM+SE組大鼠逃避潛伏期各天均無顯著差異，同時(shí)DM組與DM+SE組空腹血糖及血胰島素水平?jīng)]有顯著差異，似乎司美格魯肽在大鼠體內(nèi)并沒有發(fā)揮作用。司美格魯肽在不同物種（人類、大鼠、猴子）之間代謝物圖譜具有可比性[8]，故不考慮物種差異引起的藥物代謝效應(yīng)不同，推斷其可能與司美格魯肽使用劑量有關(guān)。司美格魯肽用于2型糖尿病患者是1周1次，本實(shí)驗(yàn)大鼠給藥的劑量為0.1 mg/kg·w-1，該劑量下藥物沒有發(fā)揮良好的藥效。

相關(guān)研究[8]通過隔天1次注射司美格魯肽建立動(dòng)物模型（共注射20次），分別觀察了低劑量與高劑量司美格魯肽注射下小鼠水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期時(shí)間，發(fā)現(xiàn)兩組時(shí)間均較治療組縮短，且高劑量縮短更加顯著，說明司美格魯肽藥效受給藥劑量的影響。然而目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中司美格魯肽使用劑量并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，0.12 mg/kg·d-1、0.10 mg/kg·2d-1、0.41 mg/kg·w-1等，需要更多劑量梯度實(shí)驗(yàn)評(píng)估司美格魯肽的藥效。本研究結(jié)果顯示：DM組與DM+SE組大鼠Betatrophin水平均較NC組明顯升高。Betatrophin主要通過脂肪、肝臟組織分泌，對(duì)胰島β細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用[9]，Espes等[10]首先發(fā)現(xiàn)不論1型還是2型糖尿病患者，其Betatrophin水平均明顯升高，然而Fenzl等人表明T2D患者與非糖尿病患者血Betatrophin水平無顯著差異。一項(xiàng)大型隊(duì)列研究通過比較556例T2D患者和1047例非糖尿病患者血Betatrophin水平，發(fā)現(xiàn)在T2D患者中Betatrophin水平大約高出3倍[11]，且Betatrophin水平的升高并不增加胰島素分泌[12]，本研究結(jié)果與其相符，DM組大鼠Betatrophin水平較NC組大鼠高出2倍多，且Betatrophin水平與胰島素水平無相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本研究表明，司美格魯肽不能改善糖尿病大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)認(rèn)知功能障礙，可能與其使用劑量相關(guān)。Betatrophin可調(diào)節(jié)糖代謝促進(jìn)糖尿病的發(fā)生，但不影響胰島素分泌。