環(huán)境/定植耳念珠菌的分離鑒定及藥敏分析

朱娟娟,范 瓊,張珺琳,馬亞林,于敏娜,胡志軍,潘 愷,陳繼中

(銅陵市人民醫(yī)院 1. 檢驗(yàn)科; 2. 感染管理辦公室,安徽 銅陵 244002 )

耳念珠菌(Candidaauris)是2009年首次發(fā)現(xiàn)于日本的真菌,能引發(fā)血液、肺部、尿道、傷口等部位感染,多數(shù)對(duì)現(xiàn)有抗真菌藥物耐藥,感染患者的病死率接近68%[1]。該菌耐鹽、耐高溫,可長期存在于醫(yī)院的環(huán)境、物體表面,并定植于人體皮膚表面,極易導(dǎo)致免疫力低及接受侵襲性治療的高風(fēng)險(xiǎn)人群感染,甚至引起醫(yī)院感染暴發(fā),故被稱為“超級(jí)真菌”[2-3]。耳念珠菌常規(guī)方法鑒定困難,容易漏診,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)可檢測真菌蛋白,基因測序技術(shù)可對(duì)核糖體內(nèi)26S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed space, ITS)或28S rDNA的D1/D2區(qū)序列進(jìn)行鑒定,故質(zhì)譜和測序均能有效鑒定耳念珠菌[4]。根據(jù)基因序列可將全球耳念珠菌分為五大分支:南亞分支(Ⅰ)、東亞分支(Ⅱ)、南非分支(Ⅲ)、南美分支(Ⅳ),以及近期出現(xiàn)的伊朗分支(Ⅴ)[5]。醫(yī)療機(jī)構(gòu)需重視耳念珠菌的防控工作,對(duì)其可能帶來的環(huán)境污染及人員體表定植情況進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的監(jiān)測,有助于針對(duì)性采取消毒、去定植及隔離等措施,對(duì)阻斷耳念珠菌傳播尤其關(guān)鍵。

我國2018在北京首次發(fā)現(xiàn)耳念珠菌感染病例,近年在沈陽、廈門也有零散病例報(bào)道,研究內(nèi)容主要集中在臨床分離株的耐藥特點(diǎn)、毒力及分子分型等方面,對(duì)耳念珠菌在環(huán)境及患者體表的存在情況及相應(yīng)消殺措施報(bào)道甚少[6-10]。某院2022年6月6日于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)發(fā)現(xiàn)1例耳念珠菌血流感染患者(1號(hào)患者),隨即第一時(shí)間對(duì)耳念珠菌在病房環(huán)境及患者體表的定植情況進(jìn)行了主動(dòng)篩查,啟動(dòng)各項(xiàng)醫(yī)院感染防控措施,并收到一定成效[11]。針對(duì)該院主動(dòng)篩查中從ICU環(huán)境和患者體表分離的環(huán)境/定植菌株,本研究探索鑒定耳念珠菌的有效方法,并比較其與1號(hào)患者血液中分離的耳念珠菌菌株(臨床分離株)的基因組和藥敏特點(diǎn),初步探討該院耳念珠菌的來源及同源性,以期為耳念珠菌的監(jiān)測、防控提供經(jīng)驗(yàn)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 真菌鑒定采用中元匯吉EXS1000質(zhì)譜儀和梅里埃公司Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀;測序采用ABI 3730XL測序儀;藥敏分析采用迪爾細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)DL-96A及配套的DL-96FUNGUS真菌試劑板;真菌培養(yǎng)采用江門市凱林貿(mào)易有限公司提供的真菌肉湯型培養(yǎng)基和念珠菌屬真菌顯色培養(yǎng)基;藥敏紙片由賽默飛世爾科技有限公司提供。

1.2 標(biāo)本采集及培養(yǎng) 6月8—17日感染管理辦公室聯(lián)合ICU及微生物室對(duì)感染患者周圍96處環(huán)境和14例ICU患者體表進(jìn)行了采樣及培養(yǎng),環(huán)境選擇高頻接觸環(huán)境物體表面,包括監(jiān)護(hù)儀、輸液泵、呼吸機(jī)、吊塔臺(tái)面、床單元、電腦鼠標(biāo)與鍵盤、水龍頭、地面、門把手、電源開關(guān)、空調(diào)風(fēng)口、治療車、工作臺(tái)面等,患者體表選擇口腔、鼻腔、雙側(cè)腋窩、雙側(cè)腹股溝和肛門。采集方法按《醫(yī)院感染預(yù)防與控制標(biāo)準(zhǔn)操作流程》[12]規(guī)范操作,用無菌棉簽拭子采樣后置于1～2 mL生理鹽水中保存,2 h內(nèi)送至微生物室。培養(yǎng)采取選擇性增菌法,即將采集后的棉拭子用振蕩器震蕩后加入等體積的真菌液體培養(yǎng)基,同時(shí)加入萬古霉素(30 μg/片)、亞胺培南(10 μg/片)藥敏紙片各1片,37℃培養(yǎng)24 h后3 000 r/min離心3 min,取沉淀接種于真菌顯色培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)過夜。

1.3 質(zhì)譜和生化鑒定 挑取真菌顯色平板上奶油色菌落,順時(shí)針涂于靶板上相應(yīng)孔位,加入1 μL 70%的甲酸溶液,干燥后再加入1 μL基質(zhì)溶液,再次干燥后質(zhì)譜鑒定。生化鑒定采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng),選取質(zhì)譜鑒定后的耳念珠菌純菌落使用無菌鹽水配置濁度為3.0的菌液,自動(dòng)填充于真菌鑒定卡后上機(jī)培養(yǎng)48 h鑒定。

1.4 測序 菌株鑒定采用ITS測序和全基因組測序(WGS)。委托金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提取菌株基因組,使用通用引物ITS1和ITS4(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATGATAGC-3’)擴(kuò)增ITS序列,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶,純化產(chǎn)物通過雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測序,并與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì)。應(yīng)用FastANI工具比對(duì)分析該院所有分離菌株與不同分支[南亞分支B8441(Ⅰ)、東亞分支B11809(Ⅱ)、南非分支B11221(Ⅲ)、南美分支B11243(Ⅳ)、伊朗分支IFRC2087(Ⅴ)]的全基因組序列,計(jì)算平均核苷酸相似度(average nucleotide identity, ANI),比較菌株相似性。

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)法對(duì)鑒定為耳念珠菌的菌株進(jìn)行藥敏檢測。挑取純培養(yǎng)單個(gè)菌落于稀釋液瓶內(nèi)研磨至菌懸液(1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?,用藥敏液稀釋后加入藥敏板相應(yīng)孔位,不干膠封板后上機(jī),35℃孵育24～72 h讀取結(jié)果。藥敏結(jié)果根據(jù)儀器自帶真菌藥敏判讀標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告,判讀標(biāo)準(zhǔn)參考2020年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute, CLSI)其他念珠菌屬的推薦文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境/定植耳念珠菌檢出情況 根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果,主動(dòng)篩查共檢出耳念珠菌16株,包括環(huán)境來源8株,患者體表來源8株。環(huán)境中耳念珠菌檢出率為8.3%(8/96),主要集中在1號(hào)患者(耳念珠菌感染者)和與其相鄰的2號(hào)、3號(hào)患者的床單元及周圍儀器和環(huán)境中。14例患者中,7例患者(50.0%)體表檢出耳念珠菌,除了1號(hào)患者,其余患者體表耳念珠菌均以定植方式存在,并未引起感染,主要檢出部位集中在腋窩、腹股溝及鼻腔,口腔及肛門均未檢出。見表1。耳念珠菌在真菌顯色培養(yǎng)基上呈奶油或粉色光滑菌落(圖1A),鏡下為卵圓形或長圓形酵母孢子(圖1B)。

圖1 耳念珠菌菌落(A)及鏡下形態(tài)(B)

表1 環(huán)境/定植的耳念珠菌檢出情況

2.2 質(zhì)譜及生化鑒定結(jié)果 質(zhì)譜鑒定出16株耳念珠菌,得分值均>2,顯示鑒定效果可信。16株環(huán)境/定植耳念珠菌及臨床分離株的質(zhì)譜峰形高度相似,其中21個(gè)峰具有完全相同的質(zhì)荷比。比較耳念珠菌與其他種屬念珠菌的鑒定峰形發(fā)現(xiàn),耳念珠菌與希木龍念珠菌、克柔念珠菌、白念珠菌和熱帶念珠菌差異明顯,見圖2。Vitek 2 Compact系統(tǒng)鑒定上述16株耳念珠菌,僅5株被鑒定為耳念珠菌,5株被鑒定為希木龍念珠菌,另外6株未鑒定出菌種。

圖2 不同念珠菌質(zhì)譜鑒定峰型

2.3 ITS序列和全基因組比對(duì)結(jié)果 16株耳念珠菌分離株ITS區(qū)域經(jīng)擴(kuò)增后可見單一清晰目的條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物序列經(jīng)BLAST比對(duì),與韓國分離耳念珠菌(GenBank登錄號(hào)MK294583.1)、印度分離耳念珠菌(GenBank登錄號(hào)KC692049.1)、中國北京分離耳念珠菌(GenBank登錄號(hào)MH161341.1/BJCA001)相似性為100%。WGS結(jié)果顯示,包括1號(hào)患者血液中分離株在內(nèi)的17株耳念珠菌基因組與南亞分離株B8441(Ⅰ)基因組相似性均>99.97%,與東亞分支B11809(Ⅱ)、南非分支B11221(Ⅲ)、南美分支B11243(Ⅳ),以及伊朗分支IFRC2087(Ⅴ)的相似性≤99.60%,進(jìn)一步證實(shí)該院分離的耳念珠菌屬于南亞分支。

2.4 藥敏結(jié)果 16株環(huán)境/定植耳念珠菌及臨床分離株藥敏結(jié)果相似,均對(duì)5-氟胞嘧啶和伏立康唑均敏感,均對(duì)兩性霉素和氟康唑均耐藥。2株環(huán)境株和5株定植株對(duì)伊曲康唑中介,呈藥物劑量依賴性,余10株均敏感。見表2。

表2 17株耳念珠菌對(duì)不同抗真菌藥物的MIC值(μg/mL)

3 討論

耳念珠菌對(duì)多種抗真菌藥物耐藥,且極易對(duì)患者周圍環(huán)境、醫(yī)務(wù)人員高頻接觸的物體表面,公共醫(yī)療器械,以及患者體表等造成污染[14],增加住院患者感染的風(fēng)險(xiǎn),給醫(yī)療機(jī)構(gòu)帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。及時(shí)準(zhǔn)確地篩查耳念珠菌存在的病區(qū)環(huán)境,對(duì)可能感染/定植的患者進(jìn)行病原監(jiān)測,及早確定耳念珠菌存在,并采取隔離、消毒、去定植等措施,可有效阻斷其傳播。然而,由于環(huán)境和體表定植微生物復(fù)雜多樣,且耳念珠菌用常規(guī)檢測方法不易檢出,從環(huán)境和患者體表分離、鑒定耳念珠菌具有一定難度。美國一項(xiàng)研究[15]收集了2016年6月—2018年6月紐約市各醫(yī)療單位的540株臨床分離株、11 035份患者監(jiān)測標(biāo)本和3 672份環(huán)境監(jiān)測標(biāo)本,其中,對(duì)環(huán)境標(biāo)本采用選擇性培養(yǎng)和實(shí)時(shí)PCR檢測兩種方法進(jìn)行監(jiān)測。與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法相比,實(shí)時(shí)PCR檢測的診斷準(zhǔn)確度、靈敏度和特異度分別為98.36%、93.32%和98.38%,是較為理想的快速篩查方法。本研究最初采取直接培養(yǎng)法,即將標(biāo)本直接接種于真菌顯色平板,但真菌生長比例較低,平板通常會(huì)被更具生存優(yōu)勢的肺炎克雷伯菌等覆蓋,導(dǎo)致耳念珠菌檢出率低下;另一方面,可能由于耳念珠菌在抗菌藥物的篩選作用下生存優(yōu)勢增加,選擇性增菌法具有更高的檢出率,更適用于ICU復(fù)雜環(huán)境的標(biāo)本檢測。但選擇性增菌法具有耗時(shí)長、成本高的局限性,后期應(yīng)探索快速篩查方法如實(shí)時(shí)PCR檢測等。

本研究最初針對(duì)1號(hào)患者以及臨近的2、3號(hào)患者的環(huán)境及體表進(jìn)行了篩查,發(fā)現(xiàn)1號(hào)患者鼻腔、床單元、床邊儀器均檢出耳念珠菌,2、3號(hào)患者未感染耳念珠菌,但病床周圍環(huán)境及患者體表有耳念珠菌檢出(2號(hào)患者雙腋窩,3號(hào)患者鼻腔),提示可能存在耳念珠菌的接觸性傳播。為避免耳念珠菌在病房中暴發(fā),對(duì)病房中所有患者體表進(jìn)行主動(dòng)篩查后發(fā)現(xiàn)另外4例患者體表也有耳念珠菌定植。腹股溝和腋窩耳念珠菌檢出率較高,可能因其潮濕較適合耳念珠菌生長,但耳念珠菌定植部位與感染關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。考慮到ICU患者長期臥床,定植的耳念珠菌可隨皮膚細(xì)胞脫落散布于床單元及周圍環(huán)境,易帶來傳播風(fēng)險(xiǎn),早期根據(jù)監(jiān)測結(jié)果采取積極去定植及消殺措施,可有效阻斷耳念珠菌傳播。

常規(guī)真菌鑒定方法無法有效識(shí)別耳念珠菌。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室多采用基于生化反應(yīng)的鑒定系統(tǒng),對(duì)耳念珠菌鑒定率不高,易誤判為希木龍念珠菌或假希木龍念珠菌。該院實(shí)驗(yàn)室已常規(guī)開展質(zhì)譜用于微生物鑒定,對(duì)包括希木龍念珠菌在內(nèi)的多種酵母菌有良好的區(qū)分效果,而Vitek 2 Compact鑒定系統(tǒng)鑒定耳念珠菌效果不佳,提示如用生化方法鑒定出希木龍念珠菌時(shí)應(yīng)考慮進(jìn)一步排除耳念珠菌的可能。

基因測序是鑒定病原體的可靠方法。ITS序列檢測不僅可以鑒定耳念珠菌,還可與GenBank數(shù)據(jù)庫中耳念珠菌任一分支基因序列比對(duì),相似性>98%則可初步考慮為同一種屬[16]。本研究中,16株環(huán)境/定植株及臨床分離株的ITS序列經(jīng)BLAST比對(duì),與來自韓國、印度、中國北京的菌株相似性100%,可確認(rèn)為耳念珠菌。韓國、印度及北京菌株均屬南亞分支(Ⅰ),基于ITS序列的初步分析推斷該院菌株可能屬于南亞分支(Ⅰ)。為進(jìn)一步研究,將所有菌株行WGS后與其他五種分支耳念珠菌基因組比對(duì),顯示該院分離的耳念珠菌臨床株和環(huán)境/定植株高度同源,且與南亞分支相似性最高(Ⅰ),與南非分支(Ⅲ)、東亞分支(Ⅱ)、南美分支(Ⅳ)、伊朗分支(Ⅴ)的相似性逐級(jí)遞減,故應(yīng)均屬于南亞分支(Ⅰ)。

我國發(fā)現(xiàn)的耳念珠菌大多數(shù)僅對(duì)氟康唑耐藥,少數(shù)對(duì)兩性霉素B和棘白菌素MIC較高[17]。該院臨床分離株和環(huán)境/定植分離株藥敏特點(diǎn)相似,對(duì)兩性霉素B和氟康唑均耐藥,與國內(nèi)其他耳念珠菌不同;對(duì)伊曲康唑敏感,部分中介,具有一定劑量依賴性。該差別可能與菌株的適應(yīng)性進(jìn)化相關(guān)[18],后續(xù)可通過分析耐藥基因進(jìn)一步闡明不同耐藥表型的差異原因。此外,我國大多數(shù)機(jī)構(gòu)尚未開展棘白菌素的藥敏試驗(yàn),缺少棘白菌素作用效果的試驗(yàn)依據(jù),且目前仍沒有專門針對(duì)耳念珠菌的藥敏判讀標(biāo)準(zhǔn),這些都有待進(jìn)一步發(fā)展。

綜上所述,本研究建立了環(huán)境/定植來源耳念珠菌的監(jiān)測方法,發(fā)現(xiàn)耳念珠菌易定植于感染患者及臨近患者的腹股溝、腋窩和鼻腔中,患者床單元及周邊環(huán)境也容易出現(xiàn)耳念珠菌污染,為耳念珠菌醫(yī)院感染目標(biāo)性監(jiān)控指明了方向。初步探討了該院耳念珠菌的耐藥性特點(diǎn)及基因組特征,推斷菌株為同一來源,為更好控制傳染源、切斷傳播鏈提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。下一步應(yīng)建立耳念珠菌的快速篩查方法,針對(duì)WGS結(jié)果對(duì)其耐藥性和同源性深入分析,為耳念珠菌的醫(yī)院感染防控提供技術(shù)支持。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。