補(bǔ)腎活血方對(duì)心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響※

孔繁達(dá),張羅丹,張 艷

(1.山西省中醫(yī)院,山西 太原 030012;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽(yáng) 110032)

心室重構(gòu)導(dǎo)致心功能下降是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[1]。心肌梗死導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)改變,梗死區(qū)的心肌細(xì)胞壞死、凋亡,并發(fā)生纖維化,形成瘢痕組織[2];非梗死區(qū)未受損傷的心肌在代償過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性纖維化,導(dǎo)致心肌重量及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終引起心功能逐漸下降,發(fā)展為心力衰竭[3]。Klotho是一種抗衰老相關(guān)基因,位于13q12 染色體上,編碼形成Klotho蛋白[4]。Klotho蛋白通過(guò)參與多種機(jī)制改善心室重構(gòu),提高心功能,減緩心力衰竭進(jìn)展[5-6]。研究顯示,Klotho蛋白可抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路傳導(dǎo),減輕心肌纖維化[7-8]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵效應(yīng)分子。心力衰竭歸屬中醫(yī)“水腫”“喘證”等范疇,其病位在心,與肺、脾、腎相關(guān)。遼寧省名中醫(yī)張艷教授提出“心腎相關(guān)”理論,創(chuàng)立補(bǔ)腎活血方,該方在參草通脈顆?；A(chǔ)上化裁而成,可有效緩解慢性心心力衰竭患者的臨床癥狀,延緩心力衰竭進(jìn)展[9-10]。本研究采用補(bǔ)腎活血方干預(yù)心力衰竭大鼠,觀察其心肌纖維化程度、心臟超聲值及血清N 基末端腦利鈉肽前體(NT-proBNP)、心腎組織Klotho蛋白、心肌組織β-catenin 蛋白表達(dá)水平的變化,探討補(bǔ)腎活血方改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纖維化的生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 補(bǔ)腎活血方組成:菟絲子20 g,龜甲膠15 g(烊化),黃精20 g,黃芪40 g,丹參30g,人參片10 g,紅花15 g,干益母草20 g,三七粉5 g,中藥飲片由山西省中醫(yī)院藥劑中心提供。培哚普利片[施維雅(天津)制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20034053,4 mg/片]。

1.2 動(dòng)物 選取12周齡清潔級(jí)雄性健康Wister大鼠80只,體質(zhì)量(250±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,批號(hào)[SCXK(京)2016-0002],采用普通大鼠飼料喂養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境 室溫為(23±2)℃,濕度為50%~60%,遮光板調(diào)節(jié)光線為明暗交替(明12 h,暗12 h),大鼠飼料正常喂養(yǎng),自由飲水,每周更換墊料3次。

1.4 主要試劑及儀器 注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠,國(guó)藥準(zhǔn)字H23021441),β-catenin 一抗(美國(guó)Cell signaling technology 公司,9562),Klotho 一抗(北京博奧森公司,bs-2925R),3-磷酸甘油酸脫氫酶(GSK3β)一抗(英國(guó)abcam 公司,ab280376),羊抗兔二抗(HRP 標(biāo)記)(英國(guó)abcam 公司,ab15007776),ELISA 試劑(英國(guó)abcam 公司,ab108806),Masson染色液為自制。1 HX-300S 動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟有限公司),小動(dòng)物心電圖機(jī)(湖南鼠行生物科技有限公司),Vivid 7 Dimension彩色多普勒超聲檢測(cè)儀(美國(guó)通用電氣公司),聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(北京索萊寶科技有限公司),微量可調(diào)移液器(德國(guó)Eppendorf公司),水平搖床(北京六一儀器廠),烘干箱(南京萬(wàn)能加熱設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 造模 在80只Wister大鼠中隨機(jī)選取60只造模。大鼠喂養(yǎng)1周后,通過(guò)腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉。將大鼠心前區(qū)部位脫毛備皮,背位固定后連接心電圖儀器,記錄術(shù)前大鼠心電圖。經(jīng)喉進(jìn)行氣管插管,氣道開通后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。應(yīng)用碘伏在大鼠第3、4肋間消毒并開胸,用鑷子鈍性分離胸部肌肉,用自制拉鉤拉開肋間隙,用小鑷子撕開心包。助手?jǐn)D壓大鼠對(duì)側(cè)胸腔,上抬左側(cè)后背部,使心臟暴露并上移至胸腔開口處。尋找左心耳,手術(shù)燈下分辨左冠狀動(dòng)脈,在左冠狀動(dòng)脈開口往下約2 mm 處,用4-0號(hào)帶針縫合線進(jìn)行結(jié)扎[11]。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后可見(jiàn)心電圖監(jiān)測(cè)中ST 段明顯抬高。擠出大鼠胸腔中的空氣,迅速縫合胸壁,待大鼠呼吸平穩(wěn)后,撤去呼吸機(jī)。假手術(shù)組大鼠冠狀動(dòng)脈掛線但不結(jié)扎,其余步驟與造模大鼠相同。術(shù)后對(duì)大鼠進(jìn)行青霉素鈉(每日5萬(wàn)單位)腹腔注射及常規(guī)喂養(yǎng),持續(xù)1周。第2周開始飼料減半,同時(shí)進(jìn)行每日1次的力竭式游泳。灌胃4周后對(duì)大鼠進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢查左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)≤40%則表示造模成功[12]。

2.2 分組與藥物治療 造模成功的存活大鼠共48只,應(yīng)用隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、補(bǔ)腎活血組、培哚普利組,每組16只。假手術(shù)組存活20只,為平衡組數(shù),隨機(jī)選出16只作為最終的假手術(shù)組。補(bǔ)腎活血組采用補(bǔ)腎活血湯[前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),中劑量濃度治療效果最佳,故此次實(shí)驗(yàn)以中劑量濃度[17.5 g/(kg·d)]進(jìn)行配比]灌胃,培哚普利組采用由培哚普利片配制的混懸液[1.0 mg/(kg·d)]灌胃,模型組及假手術(shù)組參照補(bǔ)腎活血組每日采用等量蒸餾水灌胃。各組大鼠均灌胃4周。

2.3 動(dòng)物取材 大鼠禁食不禁水12 h后,腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。將麻醉后的大鼠固定于鼠板,打開大鼠胸腔腹腔,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血10 m L,離心(轉(zhuǎn)速2 000 r/min,離心半徑10 cm)2 min備用。剪取大鼠心臟及腎臟,于0.9%氯化鈉溶液中清洗3次,洗去殘余血液或血塊。剪去大鼠心臟中心房組織,保留心室組織。將部分心室組織及腎臟組織放入液氮中保存,準(zhǔn)備蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。將部分心室組織浸泡于4%多聚甲醛溶液,準(zhǔn)備染色用。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

(1)超聲檢測(cè) 各組大鼠灌胃4周后,采用Vivid 7 Dimension彩色多普勒超聲檢測(cè)儀行心臟超聲檢測(cè)。連續(xù)測(cè)量3 個(gè)心動(dòng)周期中的左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD),計(jì)算LVEF及左心室短軸縮短率(FS),并取平均值。

(2)血清NT-proBNP 檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組大鼠血清NT-proBNP濃度。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品,樣本孔添加待測(cè)樣本,空白孔不加。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,于37 ℃水浴鍋溫育60 min。經(jīng)棄液、拍干、洗滌、拍干流程5次。各孔加入底物A、B各50μL,在37 ℃下避光孵育15 min,后加入終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零,于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(OD)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相應(yīng)OD 值計(jì)算出直線回歸方程,再用樣本OD 值計(jì)算出樣本濃度。

(3)Masson 染色及心肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)(CVF)測(cè)定 心肌組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟等過(guò)程處理。病理切片準(zhǔn)備好后,按照以下流程染色:核染液染色60 s,甩掉染液,用沖洗液沖洗30 s→漿染液染色30 s,甩掉染液,用沖洗液沖洗30 s→分色液分色6~8 min,甩掉分色液→藍(lán)色復(fù)染液染色5 min,甩掉復(fù)染液,無(wú)水乙醇沖洗干凈→吹干切片,中心樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍照。顯微鏡下觀察藍(lán)染膠原纖維的分布情況,拍攝并測(cè)量不相連的視野,計(jì)算CVF。

(4)心臟組織Klotho蛋白、β-catenin蛋白及腎臟組織Klotho蛋白測(cè)定 取材后將心臟及腎臟組織進(jìn)行研磨、離心、蛋白變性處理,采用BCA 法測(cè)定樣品的蛋白濃度。將樣品加至電泳儀中進(jìn)行電泳,使不同分子大小的蛋白逐漸分離,進(jìn)而轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。分別加入Klotho、β-catenin一抗,再加入羊抗兔二抗(HRP 標(biāo)記)、顯色液,放入成像儀中顯影,可見(jiàn)灰色條帶。用Image J分析條帶灰度并計(jì)算相對(duì)值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況觀察 造模結(jié)束后,除假手術(shù)組外,其他組大鼠毛色晦暗甚至脫毛,精神萎靡,活動(dòng)性差,飲食減少,部分大鼠肢體水腫,伴有咳嗽、喘促癥狀。經(jīng)藥物治療后,培哚普利組、補(bǔ)腎活血組大鼠毛色逐漸恢復(fù)光澤,精神轉(zhuǎn)佳,活動(dòng)度、飲食均有增加,無(wú)咳喘癥狀。

3.2 心臟超聲指標(biāo)比較 灌胃4 周后,與假手術(shù)組比較,模型組LVEDD、LVESD 均增大,LVEF、FS均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,培哚普利組、補(bǔ)腎活血組LVEDD、LVESD 均減小,LVEF、FS 均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培哚普利組與補(bǔ)腎活血組LVEDD、LVESD、LVEF、FS比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心臟超聲指標(biāo)比較(±s)

表1 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心臟超聲指標(biāo)比較(±s)

注:1.LVEDD,左心室舒張末期內(nèi)徑;LVESD,左心室收縮末期內(nèi)徑;LVEF,左心室射血分?jǐn)?shù);FS,左心室短軸縮短率。2.與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

組別只數(shù) LVEDD(mm)LVESD(mm) LVEF(%)FS(%)假手術(shù)組16 5.24±0.53 3.41±0.43 67.31±4.17 47.19±5.48模型組16 7.71±0.85△ 5.49±0.76△38.35±6.47△25.71±3.01△培哚普利組16 6.30±0.66▲ 4.15±0.44▲57.24±5.67▲36.87±4.83▲補(bǔ)腎活血組16 6.19±0.58▲ 3.75±0.47▲58.53±4.23▲36.43±5.16▲

3.3 血清NT-proBNP水平比較 灌胃4周后,與假手術(shù)組比較,模型組血清NT-proBNP水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,培哚普利組、補(bǔ)腎活血組血清NT-proBNP水平均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培哚普利組與補(bǔ)腎活血組血清NT-proBNP 水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后血清N 基末端腦利鈉肽前體水平比較(pg/m L,±s)

表2 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后血清N 基末端腦利鈉肽前體水平比較(pg/m L,±s)

注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

組別只數(shù)N 基末端腦利鈉肽前體假手術(shù)組16 453.23±10.58模型組16 3 426.76±86.73△培哚普利組16 1 079.42±35.62▲補(bǔ)腎活血組16 1 145.28±38.51▲

3.4 Masson染色及CVF 比較 假手術(shù)組大鼠心肌組織纖維束排列緊密有序,未見(jiàn)明顯膠原纖維增生,膠原纖維主要分布于血管周圍;模型組大鼠心肌膠原纖維增生明顯,部分心肌被膠原組織取代,局部可見(jiàn)大面積膠原增生,并蔓延至心肌纖維束間,呈網(wǎng)狀分布,心肌細(xì)胞排列紊亂;補(bǔ)腎活血組及培哚普利組大鼠心肌細(xì)胞排列比較整齊,以點(diǎn)灶狀的膠原纖維為主(掃描題目右側(cè)二維碼查看圖1)。灌胃4周后,與假手術(shù)組比較,模型組CVF升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,培哚普利組、補(bǔ)腎活血組CVF降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培哚普利組與補(bǔ)腎活血組CVF 比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)比較(%,±s)

表3 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)比較(%,±s)

注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

組別只數(shù)心肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)假手術(shù)組16 5.43±0.58模型組16 15.16±0.73△培哚普利組16 9.09±0.61▲補(bǔ)腎活血組16 9.75±0.52▲

3.5 心肌組織Klotho蛋白、β-catenin蛋白表達(dá)比較灌胃4 周后,與假手術(shù)組比較,模型組心肌組織β-catenin蛋白表達(dá)升高,心肌組織Klotho蛋白表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,培哚普利組、補(bǔ)腎活血組心肌組織β-catenin蛋白表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);補(bǔ)腎活血組心肌組織Klotho蛋白表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與培哚普利組比較,補(bǔ)腎活血組心肌組織β-catenin蛋白表達(dá)降低,心肌組織Klotho蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌組織β-catenin、Klotho蛋白免疫印跡圖見(jiàn)圖2。

圖2 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌組織β-catenin、Klotho蛋白免疫印跡圖

表4 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌組織β-catenin、Klotho蛋白表達(dá)比較(±s)

表4 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌組織β-catenin、Klotho蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05;與培哚普利組比較,*P<0.05。

組別只數(shù)β-catenin蛋白(相對(duì)值) Klotho蛋白(相對(duì)值)假手術(shù)組16 1.00±0.01 1.00±0.01模型組16 1.68±0.27△0.53±0.06△培哚普利組16 1.31±0.09▲0.56±0.08補(bǔ)腎活血組16 1.09±0.06▲*0.78±0.09▲*

3.6 腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)比較 灌胃4周后,與假手術(shù)組比較,模型組腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,培哚普利組、補(bǔ)腎活血組腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培哚普利組與補(bǔ)腎活血組腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后腎臟組織Klotho蛋白免疫印跡圖見(jiàn)圖3。

圖3 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后腎臟組織Klotho蛋白免疫印跡

表5 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)比較(±s)

表5 4組心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

組別只數(shù)Klotho蛋白(相對(duì)值)假手術(shù)組16 1.00±0.01模型組16 0.51±0.03△培哚普利組16 0.82±0.06▲補(bǔ)腎活血組16 0.87±0.08▲

4 討論

心肌梗死是導(dǎo)致心力衰竭的重要病因[13]。心肌梗死后心肌纖維化促進(jìn)心室重構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致心功能下降是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。心肌梗死后梗死區(qū)和非梗死區(qū)均可發(fā)生心肌纖維化。梗死區(qū)心肌纖維化最終形成瘢痕組織,防止梗死后心室破裂,維持心室的完整性[2]。梗死區(qū)成纖維細(xì)胞可通過(guò)炎癥刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞,并大量分泌細(xì)胞外基質(zhì),改變心肌間質(zhì)膠原成分,重塑心室。梗死區(qū)室壁結(jié)構(gòu)異常造成機(jī)械應(yīng)力失衡,非梗死區(qū)心肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)被激活,使心肌纖維化。此外,梗死區(qū)肌成纖維細(xì)胞可持續(xù)分泌促纖維化因子,促進(jìn)非梗死區(qū)間質(zhì)纖維化及膠原沉積,導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降,影響心功能[14]。本研究證實(shí),心肌梗死后心力衰竭可出現(xiàn)明顯的心肌纖維化,與文獻(xiàn)中報(bào)道相符[15]。補(bǔ)腎活血方和培哚普利均能降低心肌纖維化程度,抑制心肌梗死后心肌纖維化進(jìn)展。培哚普利屬于ACEI類藥物,研究表明,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)類藥物可通過(guò)拮抗促血管生成素2(AngⅡ)對(duì)心肌的纖維化作用,進(jìn)而延緩心室重構(gòu)進(jìn)展[16-18]。圖1(掃描題目右側(cè)二維碼查看)中,補(bǔ)腎活血組大鼠心肌纖維化(藍(lán)色區(qū)域)與培哚普利組大鼠相近。

研究顯示,Wnt信號(hào)通路的激活參與心肌纖維化進(jìn)程[19-20]。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路,經(jīng)典通路指Wnt/β-catenin信號(hào)通路,非經(jīng)典通路包括Wnt/平面細(xì)胞極性(PCP)途徑和Wnt/Ca2+途徑[21]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要由Wnt配體、跨膜受體、胞漿調(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子等部分組成,涉及多類蛋白家族。Wnt信號(hào)通路激活時(shí),Axin、CK1、GSK3β、APC和β-Tr CP 組成的復(fù)合物被招募到細(xì)胞膜上,解除對(duì)β-catenin的降解,胞質(zhì)內(nèi)β-catenin含量逐漸積累并進(jìn)入細(xì)胞核中,激活下游WISP-1[8],促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死后心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)的心肌纖維化進(jìn)程均受到Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響[22]。因此,在心肌梗死后心力衰竭的研究中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路至關(guān)重要。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與表達(dá)受Klotho蛋白調(diào)控。Klotho蛋白由Klotho基因編碼而成,分為膜型和分泌型,其中膜型Klotho蛋白主要由腎臟表達(dá)。Klotho蛋白胞外段可與Wnt通路中配體結(jié)合,阻斷Wnt受體與配體結(jié)合,抑制通路信號(hào)激活。此外,Klotho蛋白可直接抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路與關(guān)鍵效應(yīng)蛋白β-catenin的入核過(guò)程[7]。

“心腎相關(guān)”是指心、腎在生理、病理上相互聯(lián)系和影響?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》將陰陽(yáng)五行元素融入醫(yī)學(xué)理論,認(rèn)為心臟為陽(yáng)中之陽(yáng),屬火,具有火的特性;腎臟為陰中之陰,屬水,具有水的特性。后世醫(yī)家根據(jù)水火、陰陽(yáng)交互規(guī)律延伸出“心腎水火相濟(jì)”理論。此外,心、腎二臟可通過(guò)經(jīng)絡(luò)相互聯(lián)系?！鹅`樞·經(jīng)脈》云:“腎足少陰之脈……其支者,從肺出絡(luò)心,注胸中?！薄鹅`樞·營(yíng)氣》描述營(yíng)氣的循行路線:“循足心,注足少陰,上行注腎,從腎注心,外散于胸中?！薄鹅`樞·衛(wèi)氣行》描述衛(wèi)氣的循行路線:“其始入于陰,常從足少陰注于腎,腎注于心?！苯?jīng)過(guò)歷代醫(yī)家的發(fā)揮,“心腎相關(guān)”理論逐漸完善。張景岳提出君火、相火論,認(rèn)為君火在上,為一身主宰;相火在下,為神明基礎(chǔ)。相火秘藏,則心陽(yáng)充足;心陽(yáng)充足,則相火旺盛。腎精腎氣充足,則心氣、心陽(yáng)化生有源,鼓動(dòng)氣血運(yùn)行。在西醫(yī)學(xué)中,Klotho蛋白主要由腎臟分泌產(chǎn)生,可阻礙心肌細(xì)胞凋亡,延緩心室重塑作用。因此,通過(guò)提高Klotho蛋白含量,可有效阻礙心衰病情進(jìn)展。

現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為,心肌成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)及心肌膠原纖維增加,在某種程度上類似于中醫(yī)學(xué)中水濕、痰飲等病理產(chǎn)物內(nèi)停[23]。心力衰竭的病因包括外邪侵襲、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞逸失度、稟賦異常,主要病機(jī)為心之氣血陰陽(yáng)虛衰,臟腑功能失調(diào),心失所養(yǎng),心血不運(yùn),血脈瘀阻,痰濁內(nèi)停。在慢性心力衰竭病機(jī)演變中,水濕、痰飲內(nèi)停與心腎失調(diào)密切相關(guān)。腎精不足,氣不得化,腎氣虧虛,進(jìn)一步導(dǎo)致氣虛不能運(yùn)化水液,水液留滯臟腑,形成水濕、痰飲,而水濕、痰飲阻滯經(jīng)脈,進(jìn)一步加重心力衰竭。補(bǔ)腎活血方在“心腎相關(guān)”理論指導(dǎo)下并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)而成,具有補(bǔ)腎精、益心氣的功效,體現(xiàn)心腎同治的思想。本研究結(jié)果顯示,灌胃4 周后補(bǔ)腎活血組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS均有改善,血清NT-proBNP 水平下降,說(shuō)明補(bǔ)腎活血方可有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能。

本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組心肌及腎臟組織中Klotho蛋白表達(dá)降低,β-catenin蛋白表達(dá)增加,提示W(wǎng)nt經(jīng)典通路被激活。與培哚普利組比較,補(bǔ)腎活血組心肌組織β-catenin蛋白表達(dá)降低(P<0.05),心肌組織Klotho蛋白表達(dá)升高(P<0.05),提示補(bǔ)腎活血方可能通過(guò)上調(diào)Klotho 蛋白表達(dá)來(lái)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá),也可能直接抑制通路關(guān)鍵效應(yīng)分子β-catenin的表達(dá),進(jìn)而抑制下游WISP-1的轉(zhuǎn)錄,延緩心肌纖維化及心力衰竭進(jìn)展。此外,補(bǔ)腎活血方下調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)作用更強(qiáng),可能機(jī)制為補(bǔ)腎活血方通過(guò)上調(diào)Klotho蛋白抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活,降低β-catenin蛋白表達(dá),還可直接抑制β-catenin表達(dá)。后期實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)在Klotho基因沉默條件下,進(jìn)一步觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的干預(yù),明確補(bǔ)腎活血方的具體作用靶點(diǎn)。