hsa_circ_0007460通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的自噬和凋亡影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活

章金怡，何禹墨，周晶雨，翁術(shù)鋒，馬慧霞，林太玥，徐穎

研究報告

hsa_circ_0007460通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的自噬和凋亡影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活

章金怡1，何禹墨1，周晶雨2，翁術(shù)鋒1，馬慧霞1，林太玥1，徐穎1

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040

環(huán)狀RNA (circular RNA, circRNA)是一類缺乏5′-帽子和3′-poly(A)尾巴的非編碼RNA，可以參與多種人類疾病的生物學(xué)過程。然而，對其在活動性肺結(jié)核(active pulmonary tuberculosis，ATB)中的診斷和功能價值卻知之甚少。本研究旨在研究hsa_circ_0007460是否能作為ATB患者的潛在診斷生物標(biāo)志物，并對其功能進(jìn)行初探。通過實時熒光定量PCR (real-time quantitative fluorescent PCR，RT-qPCR)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007460在32例ATB患者的外周血以及牛結(jié)核分枝桿菌的減毒株——BCG (bacillus Calmette-Guerin)感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)。受試者工作特征曲線(receiver operating curve, ROC)顯示曲線下面積(the area under ROC curve, AUC)為0.7474，靈敏度76.67%，特異度78.13%。通過RNase R消化和放線菌素D抑制實驗證實hsa_circ_0007460相較于其線性mRNA更加穩(wěn)定，提示其有作為ATB的診斷生物標(biāo)志物的潛力。通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、CCK-8 (cell counting kit-8)、平板計數(shù)、免疫熒光等實驗表明hsa_circ_0007460能調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡和自噬。最后，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測下游的miRNA和mRNA，構(gòu)建了hsa_circ_0007460/hsa-miR-3127-5p/PATZ1軸。上述研究結(jié)果表明，hsa_circ_0007460在ATB患者外周血中顯著上調(diào)，可以作為潛在的診斷生物標(biāo)志物，且hsa_circ_0007460能促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡、抑制巨噬細(xì)胞自噬從而促進(jìn)胞內(nèi)BCG的存活。

hsa_circ_0007460；自噬；凋亡；TB；巨噬細(xì)胞

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(，)引起的嚴(yán)重呼吸道傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織《2022年全球結(jié)核病報告》統(tǒng)計，2021年全球新發(fā)結(jié)核病患者1060萬例，死亡數(shù)160萬[1]。結(jié)核感染的早期診斷對于控制該疾病的傳播至關(guān)重要。目前，細(xì)菌培養(yǎng)和涂片鏡檢仍是結(jié)核病臨床診斷中最廣泛使用的工具，但過程耗時、靈敏度差[2]。因此，迫切需要尋找結(jié)核病特異性的生物標(biāo)志物，建立一種快速、靈敏、高效的肺結(jié)核診斷方法，以防止結(jié)核病的廣泛傳播。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是真核生物中共價閉合的內(nèi)源性分子，缺乏5′-帽子和3′-poly(A)尾巴，大多數(shù)由已知的蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)，具有組織特異性和細(xì)胞特異性[3]。由于具有共價閉合環(huán)狀的特性，且能耐受RNase R的降解，circRNA可以作為腫瘤、心血管疾病和其他疾病的潛在生物標(biāo)志物，并且參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。

很多研究發(fā)現(xiàn)circRNA的失調(diào)和感染有關(guān)，也可以作為TB診斷的新型生物標(biāo)志物。Zhuang等[5]研究表明，hsa_circ_0005836可作為結(jié)核病診斷新的潛在生物標(biāo)志物。Huang等[6]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_ 0043497和hsa_circ_0001204在TB患者的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，其潛在的靶miRNA可能是miR-377-3p和miR-186-5p。Zhang等[7]研究表明hsa_circ_0028883對結(jié)核病診斷具有潛在價值，是一種潛在可靠的生物標(biāo)志物，并且通過生物信息學(xué)析，預(yù)測了其下游miRNA為hsa-miR-409-5p，但仍需要進(jìn)行進(jìn)一步實驗驗證。上述研究表明，circRNA可能在TB中發(fā)揮重要作用，并具有作為結(jié)核病診斷新型生物標(biāo)志物的巨大潛力。

在本課題組前期研究中，通過測序發(fā)現(xiàn)hsa_circ_ 0007460在活動性肺結(jié)核(active pulmonary tuberculosis，ATB)患者的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中表達(dá)顯著上調(diào)(上調(diào)36倍) (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。故本研究進(jìn)一步在病人和細(xì)胞層面驗證了hsa_circ_0007460的差異表達(dá)，并構(gòu)建受試者工作特征曲線(receiver operating curve，ROC)，評價hsa_circ_0007460對ATB的診斷價值。此外，本文還探究了hsa_circ_0007460在結(jié)核分枝桿菌的減毒株(bacillus Calmette-Guerin，BCG)感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞中的功能，并評估了hsa_circ_0007460、miRNA和mRNA之間可能的相互作用，以確定circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。本研究表明，hsa_ circ_0007460可能是結(jié)核病的有效診斷生物標(biāo)志物，其可能通過和PATZ1競爭性結(jié)合hsa-miR-3127-5p來影響巨噬細(xì)胞凋亡和自噬，促進(jìn)BCG的胞內(nèi)存活。本研究為ATB的臨床診斷和治療提供了新的分子靶點，并為結(jié)核病的發(fā)病機制提供了新的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本中PBMC的提取

本研究共有30例ATB患者(16男，16女)，年齡16～70歲，于2021年2月～8月從復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院招募。ATB診斷依據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)—結(jié)核病診斷》(WS 288-2017)。2021年2月～8月，共招募32名年齡在20～65歲之間、無ATB細(xì)菌學(xué)以及ELISPOT診斷為陰性的HC志愿者(16名男性，14名女性)作為對照組。采集每位受試者外周血約5 mL。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者均簽署了知情同意書。

將人淋巴細(xì)胞分離液(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)加入到全外周血中，進(jìn)行密度梯度離心，800×室溫離心20 min。在分離得到的PBMC中加TRIzol(美國Invitrogen公司)進(jìn)行裂解，–80℃儲存用于后續(xù)的實驗。研究對象的特征顯示在表1中。

1.2 RNase R消化

使用核酸外切酶RNase R (美國Epicenter Biotechnologies公司)來評估circRNA的穩(wěn)定性。將2 μg的總RNA用含或者不含2 U的RNase R在37℃下消化10 min，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR。

1.3 放線菌素D實驗

使用放線菌素D (美國MedChemExpress公司)來評估circRNA的穩(wěn)定性。用3 μg/mL的放線菌素D處理THP-1人源巨噬細(xì)胞不同時間后，用TRIzol裂解，通過RT-qPCR分析hsa_circ_0007460和GOSR1 mRNA相較于處理前(0 h)的穩(wěn)定性。

表1 研究對象的特征

ATB：活動性肺結(jié)核患者；HC：健康人對照；ELISPOT：酶聯(lián)免疫斑點法。

1.4 實時熒光定量PCR (real-time quantitative fluores-cent PCR，RT-qPCR)實驗

按照HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序：50℃反轉(zhuǎn)錄15 min，然后85℃滅活5 s。得到cDNA后，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行RT-qPCR，RT-qPCR程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。通過RT-qPCR的溶解曲線來評估擴增的特異性。circRNA表達(dá)量以GAPDH為基準(zhǔn)。數(shù)據(jù)處理采用2–ΔΔCt方法，引物序列見表2。

1.5 細(xì)胞感染

將BCG的保種液按1%接種于10 mL的7H9+ OADC培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，1000×室溫離心5 min收菌。用無菌PBS將菌液調(diào)至OD600=0.6 (～2.5×107CFU/mL)，稀釋到感染所需濃度用于后續(xù)細(xì)胞感染。確定感染復(fù)數(shù)MOI (MOI=10∶1)。按計算加入上述相應(yīng)已調(diào)好OD的菌懸液，置于37℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染4 h。吸去菌懸液，加入已平衡至室溫的PBS洗3次。

表2 RT-qPCR中使用的引物

1.6 抑制circRNA

采用siRNA抑制hsa_circ_0007460，siRNA針對hsa_circ_0007460序列的反向剪接位點設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。用siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞48 h后，用RT-qPCR方法檢測抑制效率，siRNA序列見表3。

1.7 Western blot免疫印跡法檢測蛋白的表達(dá)

使用全細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)制備蛋白樣品。用雙硫鍵還原檢測法(Bicinchoninic Acid Assay，BCA)(北京艾德萊生物科技有限公司)測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白分子量配制相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)，取相同量總蛋白進(jìn)行電泳。電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜(美國密理博公司)上。用含5%脫脂奶粉的1×TBST室溫封閉1 h。加入目的蛋白抗體4℃孵育過夜。目的蛋白抗體包括抗-LC3 (美國Cell Signaling Technology公司，1∶500稀釋)，抗-GAPDH (美國Proteintech公司，1∶20000稀釋)、抗-Bcl-2 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司，1∶5000稀釋)。加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。采用增強型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL) (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)顯影。蛋白條帶深淺采用Image J (美國National Institutes of Health公司)分析。

表3 hsa_circ_0007460-siRNA序列

1.8 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測LC3的表達(dá)

將THP-1培養(yǎng)于共聚焦小皿中，用PBS清洗3次后加4%多聚甲醛固定10 min，然后加0.25% TritonX-100通透10 min。通透結(jié)束后加入抗-LC3抗體(美國Cell Signaling Technology公司，1∶500稀釋)，4℃過夜孵育。之后加熒光二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，1∶500稀釋)，室溫避光孵育1 h。加0.1%的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino- 2-phenylindole，DAPI)進(jìn)行復(fù)染，復(fù)染5 min。復(fù)染結(jié)束后加防熒光淬滅劑。最后在共聚焦顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞中LC3 puncta數(shù)目，共計數(shù)100個細(xì)胞。

1.9 流式檢測細(xì)胞凋亡

可以通過異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色(日本同仁化學(xué)研究所)區(qū)分凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。將THP-1人源巨噬細(xì)胞用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，用槍頭將貼壁細(xì)胞吹下，轉(zhuǎn)移到離心管中，用1×Annexin V Binding Buffer洗滌細(xì)胞。向洗滌過的細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合物，再加入5 μL PI Solution，室溫下避光培養(yǎng)15 min，加樣到流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。凋亡率使用FlowJo軟件(美國BD公司)進(jìn)行分析。

1.10 CCK-8檢測細(xì)胞存活率

吸去接種于96孔板中的THP-1人源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入含有10 μL的CCK-8 (翌圣生物科技股份有限公司)試劑的培養(yǎng)液，37℃孵育4 h，用多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)測定在450 nm及650 nm參比波長處的吸光度。

1.11 Hsa_circ_0007460對BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的殺菌活性影響

用上述1.6方法過表達(dá)或抑制hsa_circ_0007460 24 h后，用BCG (MOI = 10)感染，感染4 h后，吸去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗3次，洗去胞外BCG。每孔加入100 μL 0.025%的SDS裂解細(xì)胞，按照合適的比例稀釋后，取50 μL稀釋液涂布于7H10平板，去除胞外菌的時刻記為0 h。繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，按照上述同樣的操作進(jìn)行稀釋涂板。37℃培養(yǎng)3周后計數(shù)CFU。

1.12 生物信息學(xué)預(yù)測

利用circMine (http://hpcc.siat.ac.cn/circmine/)、TargetScan (http://www.targetscan.org)、miRanda (http:// www.microrna.org/microrna/home.do)和Lianchuan生物學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa_circ_0007460的潛在miRNA靶點。使用TargetScan、Tarbase (http://www.microrna. gr/tarbase)和miRDB (https://mirdb.org)數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-3127-5p的潛在靶點。

1.13 統(tǒng)計分析

兩組間比較采用Welch’s檢驗。多組之間表達(dá)比較采用One-way ANOVA檢驗，數(shù)據(jù)處理采用Excle，作圖采用GraphPad Prism 9軟件。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)展示。Western blot結(jié)果采用Image J軟件分析。流式分析采用FlowJo軟件。<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 hsa-circ-0007460在TB病人及BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)

在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007460在ATB患者的PBMC中表達(dá)顯著上調(diào)36倍(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步在病人和細(xì)胞層面驗證hsa_circ_0007460的差異表達(dá)。結(jié)果表明hsa_circ_0007460在30名ATB患者中的表達(dá)顯著高于健康人志愿者(圖1A)。此外，通過構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC)，對hsa_circ_0007460對ATB的診斷價值進(jìn)行了評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲線下面積(AUC)為0.7474 (95%置信區(qū)間：0.6157～0.8790，<0.001)，靈敏度76.67%，特異度78.13% (圖1B)。

由于巨噬細(xì)胞是對抗感染的第一道防線，通過BCG感染THP-1人源巨噬細(xì)胞，建立感染巨噬細(xì)胞的模型，并檢測hsa_circ_0007460的表達(dá)情況[8]。結(jié)果顯示hsa_circ_0007460在BCG感染THP-1人源巨噬細(xì)胞中均顯著上調(diào)，且隨著感染時間的延長，hsa_circ_0007460上調(diào)顯著增加，這些變化和組學(xué)結(jié)果相一致(圖1C)。

圖1 Hsa_circ_0007460在結(jié)核患者中和結(jié)核感染模型中顯著上調(diào)

A：在健康人(=32)和活動性肺結(jié)核患者(=30)的PBMC中hsa_circ_0007460的相對含量。B：hsa_circ_0007460在活動性肺結(jié)核診斷中的受試者工作特征曲線。AUC：曲線下面積。C：BCG感染THP-1人源巨噬細(xì)胞(MOI=10)48 h和72 h時，hsa_circ_ 0007460的相對含量。**<0.01, ***<0.001，****<0.0001。

circRNA不同于線性RNA，它是由反向剪接而成的環(huán)狀RNA，缺乏5′-帽子和3′-poly(A)尾巴。本研究的hsa_circ_0007460來自基因的外顯子3～6的反向剪接(圖2A)。測序結(jié)果表明，RT-qPCR擴增序列和目的序列完全匹配(圖2B)。為了排除RT-qPCR引物擴增出線性產(chǎn)物的可能，用RNase R(Ribonuclease R)處理RNA。RNase R是核糖核酸外切酶，幾乎可消化所有線性RNA，但不能消化環(huán)狀RNA[9]。經(jīng)過處理后，可以觀察到線性的GAPDH的含量顯著下降，hsa_circ_0007460的含量上升，這表明在一定程度上hsa_circ_0007460能耐受RNase R的消化(圖2C)。hsa_circ_0007460在經(jīng)過RNase R消化之后升高，由此猜測可能是由于其中的線性RNA被降解后，轉(zhuǎn)錄競爭者降低使得環(huán)狀RNA得到了富集。轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D能抑制RNA的合成，THP-1人源巨噬細(xì)胞經(jīng)放線菌素D處理不同時間后，對hsa_circ_0007460及其線性轉(zhuǎn)錄本mRNA的分析表明，hsa_circ_0007460亞型非常穩(wěn)定，相對于它的線性轉(zhuǎn)錄本，有更長的半衰期(圖2D)。

圖2 Hsa-circ-0007460的基本性質(zhì)驗證

A：hsa_circ_0007460的示意圖。B：上半部分是hsa_circ_0007460剪接位點處的基本序列，下半部分是使用反向引物擴增的剪接位點處Sanger測序的結(jié)果，黑色的虛線代表剪接位點。C：THP-1人源巨噬細(xì)胞用或者不用RNase R消化之后，hsa_circ_0007460和線性的GAPDH的相對含量。D：THP-1人源巨噬細(xì)胞用放線菌素D處理不同時間后，hsa_circ_0007460和其對應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄本GOSR1的含量。**<0.01，****<0.0001，ns代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，hsa_circ_0007460是由于感染而上調(diào)，能耐受RNase R的消化和放線菌素D的處理，具有較好的穩(wěn)定性，可以作為ATB的潛在診斷生物標(biāo)志物。

2.2 hsa_circ_0007460的抑制

為了探索hsa_circ_0007460在TB感染中的作用，本研究針對hsa_circ_0007460的反向剪接位點設(shè)計了3條小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)用于抑制hsa_circ_0007460 (圖3A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，hsa_circ_0007460-siRNA-1和siRNA-2和對照相比，均有抑制效率，因為siRNA-1的抑制效率更高，故選擇siRNA-1進(jìn)行后續(xù)實驗(圖3B)。實驗發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0007460-siRNA-1能成功抑制hsa_circ_0007460 (圖3C)，且對其線性轉(zhuǎn)錄本GOSR1的含量沒有影響(圖3D)。

2.3 hsa_circ_0007460促進(jìn)凋亡

前期結(jié)果顯示，hsa_circ_0007460在TB和BCG感染的巨噬細(xì)胞中上升趨勢一致，故使用BCG為模式菌進(jìn)一步研究hsa_circ_0007460的功能?？紤]到凋亡和自噬在清除胞內(nèi)中的關(guān)鍵作用[10,11]，對hsa_circ_0007460是否影響B(tài)CG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的凋亡和自噬進(jìn)行了探究。通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)，將hsa_circ_0007460抑制后，凋亡相關(guān)基因Bcl-2和BAX含量顯著上調(diào)(圖4A)。進(jìn)一步通過Western blot，檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，hsa_circ_0007460的抑制會導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著上升，且能顯著逆轉(zhuǎn)BCG感染導(dǎo)致的Bcl-2下降(圖4B)。由此推測，hsa_circ_0007460可能會影響B(tài)CG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞凋亡。

圖3 hsa_circ_0007460的抑制

A：hsa_circ_0007460的siRNA抑制示意圖。B：不同siRNA抑制效率的比較。C～D：用hsa_circ_0007460-siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞48 h后，通過RT-qPCR檢測hsa_circ_0002371(C)及其線性轉(zhuǎn)錄本GOSR1(D)的含量。**<0.01，****<0.0001，ns代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

后續(xù)通過流式檢測了THP-1人源巨噬細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示，hsa_circ_0007460的抑制能顯著逆轉(zhuǎn)BCG感染導(dǎo)致的THP-1人源巨噬細(xì)胞晚期凋亡和總凋亡的上升(圖4C)。CCK-8也表明，hsa_circ_ 0007460的抑制有導(dǎo)致BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞活力增加的趨勢，即細(xì)胞死亡減少，且作用效果隨著時間的增加而增加(圖4D)。以上結(jié)果表明，hsa_circ_0007460促進(jìn)了BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的凋亡。

上述結(jié)果表明，BCG感染THP-1人源巨噬細(xì)胞后，上調(diào)的hsa_circ_0007460能降低細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.4 hsa_circ_0007460通過抑制自噬，來提高BCG的胞內(nèi)存活率

本研究又進(jìn)一步探究了hsa_circ_0007460對BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的自噬的影響。首先通過RT-qPCR檢測自噬相關(guān)基因的mRNA水平，結(jié)果顯示將hsa_circ_0007460抑制后，自噬相關(guān)基因p62含量顯著下調(diào)(圖5A)。后續(xù)通過Western blot，檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示hsa_circ_0007460的抑制會導(dǎo)致BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著上升，且能進(jìn)一步促進(jìn)BCG感染導(dǎo)致的LC3-Ⅱ上升(圖5B)。這表明，hsa_circ_0007460在調(diào)節(jié)BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的自噬中具有潛在作用。為了進(jìn)一步確定hsa_circ_0007460和自噬的關(guān)系，用免疫熒光檢測自噬體形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制hsa_circ_ 0007460后，BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞細(xì)胞中的LC3 puncta (綠色)顯著增多(圖5C)。以上結(jié)果表明，hsa_circ_0007460抑制了BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的自噬。

圖4 hsa_circ_0007460影響巨噬細(xì)胞凋亡

A：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG(MOI=10)感染48 h，通過qPCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。B：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG(MOI=10)感染48 h，通過WB檢測Bcl-2的表達(dá)。C：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG(MOI=10)感染48 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。D：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG(MOI=10)感染48 h和72 h，通過CCK-8檢測細(xì)胞活力。*<0.05，**<0.01, ***<0.001，****<0.0001，ns代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖5 hsa_circ_0007460影響巨噬細(xì)胞自噬

A：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG (MOI=10)感染48 h，通過qPCR檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)。B：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG (MOI=10)感染48 h，通過WB檢測LC3-II的表達(dá)。C：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG (MOI=10)感染48 h，通過共聚焦檢測LC3 puncta數(shù)量。D：用hsa_circ_0007460-siRNA或者Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染THP-1人源巨噬細(xì)胞24 h后，用BCG (MOI=10)感染，在0 h、24 h、48 h進(jìn)行CFU涂板計數(shù)。*<0.05，**<0.01，***<0.001，****<0.0001，ns代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

大量研究表明巨噬細(xì)胞自噬對胞內(nèi)具有殺傷作用[12]。前期發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007460可以影響B(tài)CG感染的巨噬細(xì)胞自噬，因此進(jìn)一步探究了hsa_circ_0007460對BCG胞內(nèi)存活的影響。CFU結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0007460-siRNA能顯著抑制胞內(nèi)BCG的生長(圖5D)。

綜上所述，BCG感染THP-1人源巨噬細(xì)胞后，上調(diào)的hsa_circ_0007460能抑制細(xì)胞自噬，有利于BCG的胞內(nèi)存活。

2.5 hsa_circ_0007460靶miRNA分析

研究表明，細(xì)胞質(zhì)中的circRNA主要通過作為miRNA的“海綿”來發(fā)揮其生物學(xué)功能[13]。本研究用核質(zhì)RNA分離試劑盒，探究hsa_circ_0007460在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的比例，結(jié)果表明hsa_circ_ 0007460大部分分布于細(xì)胞質(zhì)(圖6A)。于是通過circMine、TargetScan、miRanda和聯(lián)川生物的數(shù)據(jù)庫，對下游的miRNA進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果表明，共有19個miRNA是三個數(shù)據(jù)庫都預(yù)測到的(圖6B)。圖6C構(gòu)建了這19個miRNA和hsa_circ_0007460的網(wǎng)絡(luò)圖。進(jìn)一步，通過RNA Hybrid預(yù)測了這19個miRNA和hsa_circ_0007460的結(jié)合位點，因為miRNA的種子序列(miRNA 5′端的第2～8個核苷酸)是進(jìn)化上最為保守的片段，發(fā)現(xiàn)其中有12個miRNA的種子序列和hsa_circ_0007460能成功配對。后續(xù)通過文獻(xiàn)查找，探究這12個miRNA是否有和凋亡、自噬相關(guān)的文獻(xiàn)報道。經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研后，發(fā)現(xiàn)只有hsa-miR-3127-5p符合要求，圖6D顯示了預(yù)測得到的兩者結(jié)合位點。研究表明，長非編碼RNA LINC00689可以通過miR-3127-5p/ATG7軸介導(dǎo)自噬抑制人核髓細(xì)胞的凋亡[14]；CircPAPPA可以通過 miR-3127-5p/HOXA7軸調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡以及細(xì)胞周期[15]。PVT1作為miR-3127-5p的海綿可以調(diào)節(jié)NCCAP1L的表達(dá)，導(dǎo)致抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡和激活炎癥[16]。二甲雙胍可以通過長鏈非編碼RNASNHG7/ miR-3127-5p軸介導(dǎo)自噬從而影響卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇敏感性[17]。因此推測，hsa-miR-3127-5p可能也影響B(tài)CG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞的凋亡和自噬。

圖6 hsa_circ_0007460靶miRNA分析

A：用核質(zhì)RNA分離試劑盒分離RNA后用qPCR檢測hsa_circ_0007460在核和質(zhì)里面的豐度。B：使用不同的算法預(yù)測hsa_circ_0007460的下游miRNA。C：hsa_circ_0007460和下游miRNA網(wǎng)絡(luò)圖。D：使用RNAhybrid預(yù)測hsa_circ_0007460和hsa-miR-502-5p的結(jié)合位點。

2.6 hsa-miR-3127-5p靶mRNA分析

miRNA是一類非編碼的小RNA，一般通過調(diào)控下游靶mRNA或蛋白從而發(fā)揮生物學(xué)作用[18]。于是通過不同的數(shù)據(jù)庫，包括miRDB、TargetScan和TarBase，對下游的mRNA進(jìn)行預(yù)測(圖7A)。三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測出來的公共mRNA有兩個，即PATZ1和SH3PXD2A。hsa-miR-3127-5p和PATZ1結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)圖如圖7B所示，根據(jù)TargetScan的預(yù)測，PATZ1的3′端非編碼區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)會和hsa-miR-3127-5p的種子序列結(jié)合(圖7B)。PATZ1基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，是一種轉(zhuǎn)錄抑制劑，能起到抗凋亡的作用[19～22]。然而，也有文章提出了相反的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)PATZ1能與p53相互作用，根據(jù)細(xì)胞環(huán)境調(diào)節(jié)p53靶基因的表達(dá)，增強細(xì)胞凋亡或存活，這表明PATZ1似乎具有雙致癌/抗致癌活性[23]。hsa-miR-3127-5p和SH3PXD2A結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)圖如圖 7C所示。關(guān)于SH3PXD2A基因的研究不多，大部分研究的都是長鏈非編碼RNA SH3PXD2A-AS1，其可以通過海綿miR-330-5p抑制下調(diào)UBA2表達(dá)，使Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制細(xì)胞生長并促進(jìn)凋亡[24]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，推測PATZ1更有可能和hsa-miR-3127-5p結(jié)合，參與對感染的調(diào)控。

綜上所述，通過生物信息學(xué)分析，本研究構(gòu)建了hsa_circ_0007460/hsa-miR-3127-5p/PATZ1調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，以揭示結(jié)核病中circRNA、miRNA和mRNA的相互作用。據(jù)此推測，hsa_circ_0007460可能通過和PATZ1競爭性結(jié)合hsa-miR-3127-5p，從而減少hsa-miR-3127-5p對PATZ1的抑制作用，最終促進(jìn)凋亡，抑制自噬，提高BCG的胞內(nèi)存活率。

圖7 hsa-miR-3127-5p靶mRNA分析

A：使用不同的算法預(yù)測hsa-miR-3127-5p的下游mRNA。B：使用TargetScan預(yù)測hsa-miR-3127-5p和PATZ1的結(jié)合位點。C：使用TargetScan預(yù)測hsa-miR-3127-5p和SH3PXD2A的結(jié)合位點。

3 討論

研究表明circRNA可能在TB中發(fā)揮重要作用，并具有作為結(jié)核病診斷的新型生物標(biāo)志物的巨大潛力。據(jù)文獻(xiàn)報道hsa_circ_0005836[25]，circRNA_ 051239、circRNA_029965和circRNA_404022[5]，hsa_ circ_0043497和hsa_circ_0001204[6]，hsa_circ_ 0028883[7]等circRNA在ATB中存在差異性表達(dá)。同時Huang等[26]研究表明，在感染的巨噬細(xì)胞中，過表達(dá)的circRNA-0003528通過下調(diào)miR-224-5p、miR-324-5p和miR-488-5p來上調(diào)CTLA4，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化。Luo等[27]研究表明，circTRAPPC6B作為一種新型ceRNA，可拮抗miR-874-3p抑制ATG16L1表達(dá)的能力，從而激活并增加自噬以抑制巨噬細(xì)胞中的生長。

本文選擇了hsa_circ_0007460進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在TB病人和BCG感染的THP-1人源巨噬細(xì)胞中都顯著上調(diào)，和本課題的前期的組學(xué)結(jié)果一致。通過構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC)，評價hsa_circ_ 0007460對ATB的診斷價值，可以發(fā)現(xiàn)曲線下面積(AUC)為0.7474 (95%置信區(qū)間：0.6157～0.8790，<0.001)，靈敏度76.67%，特異度78.13%。生物信息學(xué)分析表明，hsa_circ_0007460來自基因的外顯子3～6的反向剪接，circRNA獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使它們相對于線性轉(zhuǎn)錄本，能更耐受RNase R的消化以及轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D的抑制[28]。以上結(jié)果表明hsa_circ_0007460可以作為ATB的潛在診斷生物標(biāo)志物。

由于凋亡、自噬在清除胞內(nèi)菌方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10, 29]，推測hsa_circ_0007460可能會通過上述兩種途徑影響胞內(nèi)BCG的存活。實驗結(jié)果顯示，hsa_circ_0007460的抑制會導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著上升，且能顯著逆轉(zhuǎn)BCG感染導(dǎo)致的Bcl-2下降。流式、CCK-8實驗也表明抑制hsa_circ_0007460會導(dǎo)致凋亡率下降，細(xì)胞活力增加。hsa_circ_0007460的抑制顯著促進(jìn)THP-1人源巨噬細(xì)胞中的LC3-Ⅱ的表達(dá)，這表明hsa_circ_0007460的敲低會激活巨噬細(xì)胞中的自噬。自噬作用作為先天免疫，在消除細(xì)胞內(nèi)中具有重要作用，巨噬細(xì)胞自噬的生理激活促進(jìn)含有的吞噬體成熟為吞噬溶酶體，抑制的細(xì)胞內(nèi)存活，而自噬的抑制會提高存活率[30]。BCG在巨噬細(xì)胞中的CFU計數(shù)結(jié)果顯示，抑制hsa_circ_0007460能降低THP-1人源巨噬細(xì)胞中BCG的存活率。綜上表明，hsa_circ_0007460可以促進(jìn)凋亡同時抑制自噬，來提高BCG的胞內(nèi)存活率。

本文進(jìn)一步通過生信分析探究了hsa_circ_ 0007460具體是通過何種途徑對BCG感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生影響。前期結(jié)果表明，hsa_circ_0007460大部分定位于細(xì)胞質(zhì)，研究表明，細(xì)胞質(zhì)中的circRNA主要通過作為miRNA的“海綿”來發(fā)揮其生物學(xué)功能[13]。于是通過不同的數(shù)據(jù)庫，對其下游的miRNA進(jìn)行預(yù)測，一共預(yù)測到下游miRNA 120個。其中hsa-miR-3127-5p最有可能和hsa_circ_0007460結(jié)合從而在BCG感染THP-1人源巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用。miRNA是一類非編碼小RNA，一般通過調(diào)控下游靶mRNA或蛋白從而發(fā)揮生物學(xué)作用[31]。數(shù)據(jù)庫預(yù)測了hsa-miR-3127-5p下游的mRNA，三個數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測到的mRNA有兩個，即PATZ1和SH3PXD2A。其中，有文獻(xiàn)報道PATZ1能影響細(xì)胞凋亡[19～23]。所以最終通過生物信息學(xué)分析，初步構(gòu)建了hsa_circ_ 0007460/hsa-miR-3127-5p/PATZ1軸，并推測hsa_ circ_0007460可能和PATZ1競爭性結(jié)合hsa-miR- 3127-5p，從而減少hsa-miR-3127-5p對PATZ1的抑制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007460在TB病人的PBMC中高表達(dá)，可以作為TB診斷的潛在生物標(biāo)志物，闡明了hsa_circ_0007460在BCG感染的巨噬細(xì)胞中的作用，其可以促進(jìn)凋亡并抑制自噬，從而提高BCG的胞內(nèi)存活率，可能為抗結(jié)核藥物的開發(fā)提供有效的作用靶點。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2022. 2022.

[2] Dookie N, Rambaran S, Padayatchi N, Mahomed S, Naidoo K. Evolution of drug resistance in: a review on the molecular determinants of resistance and implications for personalized care., 2018, 73(5): 1138–1151.

[3] Kaushik AC, Wu QQ, Lin L, Li HB, Zhao LQ, Wen ZL, Song YZ, Wu QH, Wang J, Guo XK, Wang HL, Yu XL, Wei DQ, Zhang SL. Exosomal ncRNAs profiling of mycobacterial infection identified miRNA-185-5p as a novel biomarker for tuberculosis., 2021, 22(6): bbab210.

[4] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, Maier L, Mackowiak SD, Gregersen LH, Munschauer M, Loewer A, Ziebold U, Landthaler M, Kocks C, Le Noble F, Rajewsky N. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency., 2013, 495(7441): 333–338.

[5] Liu HJ, Lu G, Wang WX, Jiang XR, Gu SS, Wang J, Yan X, He F, Wang J. A panel of circRNAs in the serum serves as biomarkers forinfection., 2020, 11: 1215.

[6] Huang ZK, Su RG, Deng Z, Xu JQ, Peng YP, Luo Q, Li JM. Identification of differentially expressed circular RNAs in human monocyte derived macrophages response toinfection., 2017, 7(1): 13673.

[7] Zhang XL, Zhang Q, Wu QG, Tang HC, Ye LX, Zhang QL, Hua DM, Zhang YB, Li F. Integrated analyses reveal hsa_circ_0028883 as a diagnostic biomarker in active tuberculosis., 2020, 83: 104323.

[8] Yuk JM, Yoshimori T, Jo EK. Autophagy and bacterial infectious diseases., 2012, 44(2): 99–108.

[9] Shi HJ, Zhou Y, Jia ET, Liu ZY, Pan M, Bai YF, Zhao XW, Ge QY. Comparative analysis of circular RNA enrichment methods., 2022, 19(1): 55–67.

[10] Zhai WJ, Wu FJ, Zhang YY, Fu YR, Liu ZJ. The immune escape mechanisms of., 2019, 20(2): 340.

[11] Deretic V. Multiple regulatory and effector roles of auto-phagy in immunity., 2009, 21(1): 53–62.

[12] Jayachandran R, Bosedasgupta S, Pieters J. Surviving the Macrophage: Tools and Tricks Employed by., 2013, 374: 189–209.

[13] Wang Y, Wang SC, Jing HY, Zhang TY, Song N, Xu SW. CircRNA-IGLL1/miR-15a/RNF43 axis mediates ammonia- induced autophagy in broilers jejunum via Wnt/β-catenin pathway., 2022, 292(Pt A): 118332.

[14] Wang CS, Chen RS, Zhu XT, Zhang XB. Long non-coding RNAs LINC00689 inhibits the apoptosis of human nucleus pulposus cells via miR-3127-5p/ATG7 axis- mediated autophagy., 2022, 17(1): 1821–1832.

[15] Li J, Han JY, Zhao AM, Zhang GX. CircPAPPA regulates the proliferation, migration, invasion, apoptosis, and cell cycle of trophoblast cells through the miR-3127-5p/ HOXA7 Axis., 2022, 29(4): 1215–1225.

[16] Huang YJ, Ren L, Li JJ, Zou HB. Long non-coding RNA PVT1/microRNA miR-3127-5p/NCK-associated protein 1-like axis participates in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm by regulating vascular smooth muscle cells., 2021, 12(2): 12583–12596.

[17] Yu Z, Wang YZ, Wang B, Zhai JW. Metformin affects paclitaxel sensitivity of ovarian cancer cells through autophagy mediated by long noncoding RNASNHG7/ miR-3127-5p axis., 2022, 37(9): 792–801.

[18] Friedman RC, Farh KKH, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs., 2009, 19(1): 92–105.

[19] Tritz R, Mueller BM, Hickey MJ, Lin AH, Gomez GG, Hadwiger P, Sah DWY, Muldoon L, Neuwelt EA, Kruse CA. siRNA down-regulation of the PATZ1 gene in human glioma cells increases their sensitivity to apoptotic stimuli., 2008, 6(B): 865–876.

[20] Fedele M, Crescenzi E, Cerchia L. The POZ/BTB and AT-Hook containing zinc finger 1 (PATZ1) transcription regulator: physiological functions and disease involve-ment., 2017, 18(12): 2524.

[21] Ow JR, Ma H, Jean A, Goh Z, Lee YH, Chong YM, Soong R, Fu XY, Yang H, Wu Q. Patz1 regulates embryonic stem cell identity., 2014, 23(10): 1062–1073.

[22] Fedele M, Franco R, Salvatore G, Paronetto MP, Barbagal F, Pero R, Chiariotti L, Sette C, Tramontano D, Chieffi G, Fusco A, Chieffi P. PATZ1 gene has a critical role in the spermatogenesis and testicular tumours., 2008, 215(1): 39–47.

[23] Valentino T, Palmieri D, Vitiello M, Pierantoni GM, Fusco A, Fedele M. PATZ1 interacts with p53 and regulates expression of p53-target genes enhancing apoptosis or cell survival based on the cellular context., 2013, 4(12): e963.

[24] Guo S, Zhu KX, Yu WH, Wang T, Li S, Wang YX, Zhang CC, Guo JQ. SH3PXD2A-AS1/miR-330-5p/UBA2 ceRNA network mediates the progression of colorectal cancer through regulating the activity of the Wnt/β-catenin signa-ling pathway., 2021, 36(10): 1969–1980.

[25] Zhuang ZG, Zhang JA, Luo HL, Liu GB, Lu YB, Ge NH, Zheng BY, Li RX, Chen C, Wang X, Liu YQ, Liu FH, Zhou Y, Cai XZ, Chen ZW, Xu JF. The circular RNA of peripheral blood mononuclear cells: hsa_circ_0005836 as a new diagnostic biomarker and therapeutic target of active pulmonary tuberculosis., 2017, 90: 264–272.

[26] Huang ZK, Yao FY, Liu J, Xu JQ, Guo Y, Su RG, Luo Q, Li JM. Up-regulation of circRNA-0003528 promotesassociated macrophage pola-ri-zation via down-regulating miR-224-5p, miR-324-5p and miR-488-5p and up-regulating CTLA4., 2020, 12(24): 25658–25672.

[27] Luo HL, Pi J, Zhang JA, Yang EZ, Xu H, Luo H, Shen L, Peng Y, Liu GB, Song CM, Li KY, Wu XJ, Zheng BY, Shen HB, Chen ZW, Xu JF. Circular RNA TRAPPC6B inhibits intracellulargrowth while inducing autophagy in macrophages by targeting microRNA-874-3p., 2021, 10(2): e1254.

[28] Szabo L, Salzman J. Detecting circular RNAs: bioinfor-matic and experimental challenges., 2016, 17(11): 679–692.

[29] Deretic V. Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes., 2011, 240(1): 92–104.

[30] Gutierrez MG, Master SS, Singh SB, Taylor GA, Colombo MI, Deretic V. Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG andsurvival in infected macrophages., 2004, 119(6): 753–766.

[31] Gajer P, Brotman RM, Bai GY, Sakamoto J, Schütte UME, Zhong X, Koenig SSK, Fu L, Ma ZS, Zhou X, Abdo Z, Forney LJ, Ravel J. Temporal dynamics of the human vaginal microbiota., 2012, 4(132): 132ra52.

Hsa_circ_0007460 affects the survival of intracellularby regulating autophagy and apoptosis of macrophages

Jinyi Zhang1, Yumo He1, Jingyu Zhou2, Shufeng Weng1, Huixia Ma1, Taiyue Lin1, Ying Xu1

Circular RNA (circRNA) is a category of non-coding RNAs characterized by the absence of a 5'-cap and 3′-poly(A) tail, and participates in the physiological processes of various human diseases. Nonetheless, the diagnostic and functional significance of circRNAs in active pulmonary tuberculosis (ATB) remains uncertain. Consequently, the purpose of this study is to investigate whether hsa_circ_0007460 can be employed as a potential diagnostic biomarker in ATB patients and explore its function. The result of real-time quantitative fluorescent PCR (RT-qPCR) validated a notable increase in the expression of hsa_circ_0007460 in the peripheral blood of 32 ATB patients, as well as in THP-1 human macrophages infected with Bacillus Calmette Guerin (BCG) which is an attenuated strain of Mycobacterium bovis. Additionally, the receiver operating curve (ROC) illustrated that the area under the ROC curve (AUC) , sensitivity and specificity were 0.7474, 76.67%, and 78.13% respectively. RNase R, Actinomycin D and other experiments confirmed that hsa_circ_0007460 was stabler than its linear mRNA, indicating that hsa_circ_0007460 has potential as a diagnostic biomarker of ATB. Furthermore, Western blot (WB), Cell Counting Kit-8 (CCK-8), plate counting, and immunofluorescence experiments revealed that hsa_circ_0007460 could regulate apoptosis and autophagy of macrophages. The downstream miRNAs and mRNAs were subsequently predicted using bioinformatics, and the hsa circ 0007460/hsa-miR-3127-5p/PATZ1 axis was built. These above results suggest that hsa_circ_0007460 is substantially up-regulated in the peripheral blood of patients with ATB and can be utilized as a potential diagnostic biomarker. In addition, hsa_circ_0007460 can promote apoptosis of macrophages and inhibit autophagy of macrophages, thereby promoting the survival of BCG.

hsa_circ_0007460; autophagy; apoptosis; TB; macrophage

2023-06-30;

2023-08-31;

2023-09-18

國家自然科學(xué)基金(編號：81971900) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81971900)]

章金怡，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物學(xué)。E-mail: 20210700011@fudan.edu.cn

徐穎，博士，副教授，研究方向：結(jié)核分枝桿菌的感染與免疫、新型結(jié)核病疫苗的研制。E-mail: yingxu2520@fudan.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-160

(責(zé)任編委: 謝建平)