基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制

周俏苑，陳洪，劉海全*，黃桂瓊，秦佳佳

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠州醫(yī)院（惠州市中醫(yī)醫(yī)院），廣東 惠州 516000

2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510000

骨質(zhì)疏松癥是一種骨骼系統(tǒng)疾病，其特征是骨量低和骨微結(jié)構(gòu)改變，致骨折風(fēng)險增加。經(jīng)典理論認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥本質(zhì)上是由雌激素缺乏/衰老（原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥）或繼發(fā)于疾病/藥物（繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥）引起的骨重塑障礙[1]。骨質(zhì)疏松癥已被定義為21 世紀(jì)的無聲疾病，由于其嚴(yán)重性、慢性和進展性而成為一種公共衛(wèi)生風(fēng)險，主要影響絕經(jīng)后婦女和老年人[2]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國65 歲以上人群中，骨質(zhì)疏松癥患病率為32.0%，其中女性為51.6%，男性為10.7%[3]。骨質(zhì)疏松癥在臨床上主要表現(xiàn)為腰背部疼痛或全身骨痛，甚至脊柱變形及骨折。骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)上總屬于“骨痿”或“骨痹”或“腰痛”等范疇，其病機根本為肝脾腎三臟虛損，因虛致瘀，進而導(dǎo)致骨骼失養(yǎng)[4]。臨床上治療總以補腎活血為主[5]。

護骨膠囊是在“腎主骨生髓”和“補腎生髓”的理論基礎(chǔ)上，由淫羊藿、制何首烏、熟地黃、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補、當(dāng)歸和山藥組合而成，主要具有補腎益精、養(yǎng)血活血的功效[6]。臨床研究表明，護骨膠囊可有效緩解癥狀、改善骨代謝、提高骨密度等，且安全性良好[7-9]。護骨膠囊適用于骨質(zhì)疏松癥患者，但護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的活性物質(zhì)及作用機制尚不明確。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制，旨在為進一步研究護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 護骨膠囊化學(xué)成分收集

本研究在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索護骨膠囊處方中的各個單味藥的活性成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)：生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數(shù)（DL）≥0.18，相對分子質(zhì)量（MW）＜500，氫鍵供體數(shù)目（Hdon）≤5，氫鍵受體數(shù)目（Hacc）≤10 和脂水分配系數(shù)（lgP）≤5。由于存在某些中藥有效成分不滿足篩選條件在本數(shù)據(jù)庫容易被剔除和其他非特征性且無效成分被納入候選的客觀因素，故結(jié)合《中國藥典》2020 版進行篩選候選活性成分，最后通過文獻檢索和綜合考慮對篩選出的單味藥活性成分進行補充和剔除。

1.2 護骨膠囊化學(xué)成分潛在靶點預(yù)測

根據(jù)篩選出來的化合物在PubChem 數(shù)據(jù)庫中查找其Canonical SMILES 結(jié)構(gòu)，將其上傳至Swis Target Prediction、Pharmmapper 等數(shù)據(jù)庫獲取靶點信息，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫為靶基因注釋及確認(rèn)，合并去重后得到護骨膠囊化學(xué)成分靶點。

1.3 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點篩選

以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，在Drugbank、TTD、Genecards、DisGeNET 等數(shù)據(jù)庫收集骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點，取其交集作為骨質(zhì)疏松癥疾病靶點。

1.4 護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點及關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將收集的護骨膠囊化學(xué)成分潛在靶點和骨質(zhì)疏松癥疾病靶點上傳至在線做圖軟件Venny 2.1.0獲取其交集靶點作為護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點。將護骨膠囊化學(xué)成分和護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件，構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖。并進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選主要化學(xué)成分。在網(wǎng)絡(luò)中，以節(jié)點度（degree）和介值中心度（between nesscentrality）來反映節(jié)點的重要程度，節(jié)點代表化合物信息，邊代表活性成分-靶點的相互作用。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將潛在靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白互作信息，將信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖；運用其插件“NetworkAnalyzer”對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進行分析，并將節(jié)點（node）大小和顏色設(shè)置用于反映degree 值的大小。

1.6 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

將潛在靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，分析潛在靶點聚類于護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的生物學(xué)過程或信號通路，將富集結(jié)果可視化處理。

1.7 分子對接

從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的SDF格式，再導(dǎo)入Chemdraw 3D 軟件進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到活性成分分子結(jié)構(gòu)mol2 格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫下載目標(biāo)靶點基因 PDB 格式的 3D 分子結(jié)構(gòu)。利用AutoDockTools 1.5.6 軟件進行分子對接，最后將分子對接結(jié)果導(dǎo)入Pymol 軟件進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 護骨膠囊化學(xué)成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和文獻檢索篩選護骨膠囊有效成分，共收集了59 個化學(xué)成分，其中淫羊藿12 個、制何首烏5 個、熟地黃5 個、龜甲5 個、巴戟天6 個、杜仲6 個、續(xù)斷5 個、骨碎補5 個、當(dāng)歸5 個、山藥5 個，見表1。

表1 護骨膠囊活性成分信息Table 1 Information of active ingredients of Hugu Capsules

2.2 護骨膠囊活性成分潛在靶點預(yù)測

將篩選出的活性成分的SMILE 格式文件導(dǎo)入到Swiss Target Prediction 等數(shù)據(jù)庫進行潛在靶點預(yù)測，共得到529 個潛在靶點。

2.3 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶標(biāo)

通過檢索GeneCard、DrugBank、OMIM 等數(shù)據(jù)庫共獲得與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的疾病靶點共1 609個，與2.2 項下預(yù)測的潛在靶點構(gòu)建韋恩圖，最終獲得護骨膠囊可能治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶點共78 個，見圖1。

圖1 護骨膠囊潛在靶點與骨質(zhì)疏松癥靶標(biāo)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Hugu Capsules potential targets and osteoporosis targets

2.4 護骨膠囊活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將交集靶點及其對應(yīng)的成分信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件，構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），同時進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選主要化學(xué)成分，選擇degree 排名前12 位的活性成分作為核心化學(xué)成分，見表2。

圖2 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Traditional Chinese medicine-component-target network diagram

表2 護骨膠囊主要活性成分Table 2 Main active ingredients in Hugu Capsules

2.5 基于String 和Cytoscape 軟件的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將78 個交集靶點上傳至String 數(shù)據(jù)庫，運行得到PPI 數(shù)據(jù)。將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.0 軟件繪制靶點互作網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 3.9.0 軟件中的Network Analyzer 功能進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，繪制核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。顏色深淺和大小表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。選取排名前5 位靶點作為核心靶點，即腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、酪氨酸蛋白激酶3（MAPK3）、雌激素受體α（ESR1），其中TNF 可能是治療骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵靶點，見表3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

表3 主要核心靶點蛋白Table 3 Main core target proteins

2.6 GO 功能富集與KEGG 通路富集分析

2.6.1 GO 功能富集分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO 富集分析。研究結(jié)果顯示，置信度P＜0.05 的生物學(xué)過程（BP）有917 條，分子功能（MF）有98 條，細胞組成（CC）相關(guān)路徑33條。護骨膠囊可能通過參與眾多過程治療骨質(zhì)疏松癥，主要包含對有機物的響應(yīng)、對含氧化合物的響應(yīng)和對化學(xué)的響應(yīng)等；MF 涉及核受體活性和過渡金屬離子結(jié)合、類固醇結(jié)合等多個過程；CC 包括細胞外空間、質(zhì)膜和宿主細胞核等。分別選取前10 條富集結(jié)果進行可視化分析（圖4）。

圖4 交集靶點GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of intersection targets

2.6.2 KEGG 通路分析 KEGG 通路富集到P＜0.05 相關(guān)通路共159 條，選擇排名前20 條信號通路進行可視化分析。主要富集通路有糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末化產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、松弛素信號通路、雌激素信號通路、Rap1 信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、MAPK 信號通路、癌癥途徑、流體剪切力與動脈粥樣硬化等，表明護骨膠囊可能通過多個通路治療骨質(zhì)疏松癥。以上結(jié)果選取前20條信號通路，繪制氣泡圖，見圖5。

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG pathway

2.7 分子對接驗證

將排名前5 位的核心靶點TNF、VEGFA、SRC、MAPK3、ESR1 與排名前5 位的活性成分地黃苦苷元、大黃素甲醚、甲基異茜草素、阿魏酸、大豆苷元進行分子對接，并記錄兩者親和力數(shù)值，親和力數(shù)值小于-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），認(rèn)為小分子與蛋白的結(jié)合能力較強，結(jié)果見熱圖（圖6）。其中大黃素甲醚與MAPK3 結(jié)合能最低，為-7.16 kcal/mol，兩者之間存在氫鍵作用力及疏水作用力。以Physcion 和MAPK3 對接為例，借助Pymol 軟件進行可視化分析（圖7）。

圖7 大黃素甲醚-MAPK3 對接圖Fig.7 Physcion-MAPK3 interconnection diagram

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略[10]，對護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的潛在活性成分、靶點和作用機制進行探究，最后借助分子對接對小分子和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行驗證。本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫結(jié)合《中國藥典》2020 版及文獻檢索收集的護骨膠囊化學(xué)成分，進一步構(gòu)建“成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)地黃苦苷元、大黃素甲醚、甲基異茜草素、阿魏酸、大豆苷元、松果菊苷等核心化合物可能是護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的核心成分。Liu 等[11]研究證實了地黃苦苷元具有抗炎作用。Hou 等[12]研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可通過激活糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥新生鼠體內(nèi)的沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）和核因子-κB（NF-κB）來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。在動物模型和培養(yǎng)細胞中，已觀察到大豆苷元具有促進骨形成和防止骨吸收的雌激素樣作用[13]。大黃素甲醚屬于屬蒽醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗誘變等作用[14-15]。Jiang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷在體外通過阻止活化T-細胞核因子1（NFATc1）易位、下調(diào)其表達和影響磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/原癌基因c-Fos 通路來抑制破骨細胞分化、F-肌動蛋白帶形成、骨吸收功能和破骨細胞特異性基因表達，松果菊苷還通過抑制破骨細胞活性減輕體內(nèi)假體周圍感染（PJI）誘導(dǎo)的骨溶解并維持骨量。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，甲基異茜草素可抑制破骨細胞的形成與分化并降低破骨細胞的吸收[17]。胡倩影等[18]通過動物實驗證實了杜仲中的松脂素可通過促進成骨細胞的增殖與分化，以達抗骨質(zhì)疏松的作用。雌二醇（E2）是通過促進成骨細胞增殖和分化來治療骨質(zhì)疏松癥的一線藥物，而松脂素對成骨細胞的增殖和分化具有與E2類似作用[19]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用，對骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、心腦血管等疾病也有治療作用[20]。實驗證明，藁本內(nèi)酯可通過抑制破骨細胞的形成與分化，從而達到骨保護作用[21]；藁本內(nèi)酯顯著抑制一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生，并通過阻斷MAPKs/IκB 激酶（IKK）和下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1 和NF-κB 的激活從而表現(xiàn)出抗炎活性[22]。樓棪[23]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤酮可直接抑制Rank1 所誘導(dǎo)的破骨細胞的形成。尿囊素可促進MAPK 磷酸化、增加葡萄糖的攝取等過程，達到預(yù)防骨骼肌功能障礙的作用[24]。綜上所述，護骨膠囊通過抗炎、抑制破骨細胞的形成與分化與促進成骨細胞的增值與分化，達到治療骨質(zhì)疏松癥的潛在治療作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析表明，TNF、VEGFA、SRC、MAPK3、ESR1 可能是護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點。TNF-α 調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的分化功能是通過腫瘤壞死因子表面受體1（TNFR1）和表面受體2（TNFR2）實現(xiàn)的。動物實驗研究證實，TNF-α 信號會促進正常小鼠和TNFR1 缺失小鼠細胞的骨形成，而TNFR2 只有在骨損傷時調(diào)節(jié)TNFα 在骨折愈合中的再生效應(yīng)[25]。研究報道，來自早期成骨細胞（Osx+）的VEGFA 在骨損傷時對于骨膜快速血管生成和骨折修復(fù)過程中的編織骨形成至關(guān)重要[26]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，SRC SH2 選擇性結(jié)合化合物可降低破骨細胞吸收活性[27]。MAPK3 可通過影響PI3K/Akt 通路治療骨質(zhì)疏松[28]。ESR1 與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松關(guān)系密切[29-30]；同時，B 細胞中一種新的ESR1 和MAPK3 網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病因[31]。ESR1 和MAPK3 均參與雌激素受體信號和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）/MAPK信號通路。

GO 和KEGG 富集分析表明，護骨膠囊主要通過細胞外空間、質(zhì)膜、宿主細胞核等CC 參與細胞生存、生長、分裂等眾多BP，繼而與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)核受體活性、過渡金屬離子結(jié)合、類固醇結(jié)合等MF，涉及糖尿病并發(fā)癥中的糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、松弛素信號通路、雌激素信號通路、Rap1 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路等，表明護骨膠囊可能通過多個通路作用于多個靶點發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用。Cheng 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑促進肥胖2 型糖尿病大鼠成骨細胞生成并抑制骨吸收，作用機制可能部分是由AGEs/RAGE/活性氧（ROS）通路通過與GLP-1 受體相互作用介導(dǎo)的。松弛素是一種肽激素，通過激活膠原酶來改變軟骨和肌腱的特性，還參與骨骼重塑和受傷韌帶和骨骼肌的愈合[33]。雌激素是女性和男性骨代謝的主要激素調(diào)節(jié)劑，對骨細胞、破骨細胞和成骨細胞的直接作用分別導(dǎo)致骨重塑抑制、骨吸收減少和骨形成維持，還調(diào)節(jié)破骨細胞的成骨細胞/骨細胞和T 細胞調(diào)節(jié)[34]。微小RNA（miRNA）廣泛調(diào)節(jié)骨的正常生物學(xué)功能以及骨折愈合和骨質(zhì)疏松的進展[35]。其中，miRNA-182 在調(diào)節(jié)細胞的凋亡、生長和分化中發(fā)揮重要作用，Pan 等[36]研究表明，下調(diào)的miR-182-5p 通過上調(diào)腺苷酸環(huán)化酶異構(gòu)體6 的Rap1/MAPK 信號通路激活，促進骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細胞的增殖與分化，這可能是治療骨質(zhì)疏松癥的新靶標(biāo)。缺氧刺激可調(diào)節(jié)骨的形成、維持和修復(fù)[37]，缺氧也是調(diào)節(jié)血管生成-成骨耦合過程的主要驅(qū)動力，HIF-1α 為HIF-1 的活性亞基，研究結(jié)果表明，缺氧可以通過 HIF-1α 途徑上調(diào)VEGF，從而改善血管生成以及成骨細胞的分化和活性；HIF-1α 的過度表達顯著增加了成骨細胞中的2 種促血管生成因子白細胞介素（IL）-6 和IL-8 的水平，可促進人成骨細胞的增殖[38]。

分子對接結(jié)果表明，地黃苦苷元、大黃素甲醚、甲基異茜草素、阿魏酸、大豆苷元核心成分與TNF、VEGFA、SRC、MAPK3、ESR1 核心靶點均具有良好的結(jié)合能力，結(jié)合能表明它們是護骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵活性成分。

綜上所述，護骨膠囊中的地黃苦苷元、大黃素甲醚、甲基異茜草素、阿魏酸、大豆苷元、松果菊苷可能是治療骨質(zhì)疏松癥的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠作用于TNF、VEGFA、SRC、MAPK3 等多個靶點，通過調(diào)節(jié)糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、松弛素信號通路、雌激素信號通路、Rap1 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路等參與骨骼重塑、抑制破骨細胞的形成與分化、促進成骨細胞的增殖與分化和抗炎功能，發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突