橙皮苷抑制ROS/NLRP3通路改善小鼠急性支氣管炎的作用機(jī)制研究

田新磊，朱珊，趙文錦，祝志朋，周怡錦（.河南省中醫(yī)院兒科，河南 鄭州 45000；.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院兒科，河南 鄭州 450046）

急性支氣管炎（acute bronchitis）是呼吸系統(tǒng)常見疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”范疇[1]。吸煙、感染、過敏及免疫等因素是導(dǎo)致急性支氣管炎患者支氣管黏膜組織損傷的主要因素[2]。急性支氣管炎發(fā)病過程復(fù)雜，目前研究[3-4]認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是急性支氣管炎發(fā)展的核心機(jī)制，氧化應(yīng)激是急性支氣管炎發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，而黏液高分泌、氣道重塑等可作為急性支氣管炎炎癥反應(yīng)的繼發(fā)表現(xiàn)。故抑制炎癥及氧化應(yīng)激性反應(yīng)對緩解急性支氣管炎患者咳嗽、咳痰及肺支氣管組織損傷壞死有重要意義。外源性微生物毒素、內(nèi)源性危險信號及多種刺激物，均可激活NOD樣受體家族蛋白3（NOD-like receptor family protein 3，NLRP3）炎癥小體激活而介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)[5]?；钚匝醮兀╮eactive oxygen species，ROS）除了是促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子外，還是激活NLRP3 炎癥小體、促進(jìn)炎癥因子成熟及分泌的重要因素[6]。

橙皮苷為中藥陳皮中的活性成分，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[7]。另外中藥陳皮有燥濕化痰之功效，是治療咳喘的常用中藥之一[8]。但陳皮及其活性成分橙皮苷在急性支氣管炎領(lǐng)域中的研究較少。近來研究[9]報道，橙皮苷具有降低急性支氣管炎大鼠支氣管肺組織炎癥因子釋放的作用，但其緩解炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制還不甚明確。本研究擬建立小鼠急性支氣管炎模型，從ROS/NLRP3 通路方面對此進(jìn)行探究驗證，以期為橙皮苷的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級C57BL/6 小鼠100 只，雌雄各半，6～7 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2020-0004，動物質(zhì)量合格證號：1107252011000123。所有小鼠于河南省中醫(yī)院動物房中常規(guī)飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃、濕度45%～55%，12 h 光/暗循環(huán)。本試驗動物符合3R 原則，實驗經(jīng)河南省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號：IACUC-102092）。

1.2 藥物及試劑橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司，批號：SND-1692；ROS/NLRP3 通路激活劑-三甲胺N-氧化物（純度≥98%），美國MCE 公司，批號：HY-116084；小鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒，無錫云萃生物科技有限公司，批號：YRX203063M、YRX203064M、YRX200824M、YRX203032M；HE 染色液，北京伊塔生物科技有限公司，批號：SY2022；ROS 熒光探針DCFH-DA，上海吉至生化科技有限公司，批號：D64620；兔源一抗NLRP3、IL-1β、IL-18、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin binding protein，TXNIP）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck- like protein containing CARD，ASC）、凋亡前體蛋白（pro-Caspase-1）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）、β-actin 抗體和山羊抗小鼠IgG（HRP）二抗，英國Abcam 公司，批號分別為：ab263899、ab283818、ab207323、ab83108、ab209211、ab188865、ab70627、ab179515、ab138483、ab8227、ab205719。

1.3 主要儀器ADVIA 2120i 血液分析儀，德國西門子公司；iMark680 多功能酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；BX61 光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司；Tanon 2500 全自動凝膠圖像分析儀，上海天能科技有限公司；TGL20M 臺式高速冷凍離心機(jī)，上海伊沐醫(yī)療器械有限公司。

1.4 小鼠急性支氣管炎模型建立及分組給藥取C57BL/6 小鼠80 只，根據(jù)《實用中醫(yī)證候動物模型學(xué)》及相關(guān)文獻(xiàn)[9]研究方法，用煙熏法（刨花、煙葉各50 g，分別于早上8∶00 及下午15∶00 各煙熏1 次，每次30 min，連續(xù)1 周）建立急性支氣管炎模型，若小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹式呼吸、咳嗽、扎堆及瞇眼等行為，視為造模成功[10]。將造模成功的80 只小鼠隨機(jī)分為模型組、橙皮苷組、ROS/NLRP3 通路激活劑（三甲胺N-氧化物）組、橙皮苷+三甲胺N-氧化物組，每組20 只；另取20 只小鼠不做任何處理，作為正常對照組。

橙皮苷用0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配置成混懸液；三甲胺N-氧化物溶于0.9%的生理鹽水。橙皮苷組參照相關(guān)文獻(xiàn)研究[11]設(shè)置劑量，并按36 mg·kg-1的劑量灌胃給藥，每日1 次；ROS/NLRP3通路激活劑（三甲胺N-氧化物）組尾靜脈注射三甲胺N-氧化物2.5 mg·mL-1，每只50 μL，每3 d 給藥1 次；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組灌胃給予橙皮苷的同時，尾靜脈注射給予三甲胺N-氧化物；正常對照組及模型組按10 mL·kg-1的劑量灌胃給予等量0.5%CMC-Na 混懸液，并尾靜脈注射等量生理鹽水。各組連續(xù)給藥1 周，末次給藥結(jié)束后觀察小鼠行為變化。

1.5 氨水噴霧法檢測小鼠咳嗽次數(shù)及咳嗽癥狀各組小鼠參照文獻(xiàn)[12]，置于2 500 mL 規(guī)格的加蓋玻璃燒杯中，用霧化器霧化噴入40 mL、12.5%的氨水40 mL，觀察小鼠咳嗽所需時間（咳嗽潛伏期）及2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.6 肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量及炎癥因子檢測各組取8 只小鼠，頸椎脫臼處死，取完整左右兩肺，左肺用冰生理鹽水2 mL 灌洗后，取灌洗液用血液分析系統(tǒng)檢測白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。另取肺泡灌洗液約1 mL，按ELISA 法測炎性因子IL-1β、IL-18 水平，右肺取左側(cè)中部組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h 后，進(jìn)行浸蠟、包埋后，制作切成5 μm 的切片備用。

1.7 HE 染色法測支氣管肺組織病理變化及炎癥浸潤狀況取右肺石蠟切片，按HE 試劑盒說明書進(jìn)行染色、封片后，在顯微鏡下觀察支氣管肺組織的病理變化，并根據(jù)文獻(xiàn)研究[13]對支氣管肺組織炎癥癥狀進(jìn)行評分。

1.8 免疫組化法測支氣管肺組織NLRP3 陽性表達(dá)水平取右肺石蠟切片，脫蠟水化及抗原修復(fù)后，用山羊血清封閉液孵育20 min，滴加一抗（NLRP3，1∶500）4 ℃孵育過夜。用生物素化二抗工作液室溫孵育1.5 h，DAB 顯色及封片后于光鏡下觀察并拍照，用Image Pro-Plus 6.0 軟件測單位面積內(nèi)陽性染色的吸光度值。

1.9 肺組織ROS 水平及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測剩余小鼠頸椎脫臼處死，解剖取左右兩肺，左肺組織置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。右肺組織在預(yù)冷的PBS 洗滌后，加入胰蛋白酶，于37 ℃下消化30 min 后，終止消化。用300 目尼龍網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，離心后棄上清。重懸細(xì)胞并加入適量熒光探針DCFH-DA，37 ℃孵育30 min 后PBS 洗滌，于流式細(xì)胞儀上檢測各組小鼠肺組織細(xì)胞中ROS 含量。取-80 ℃冰箱保存的部分左肺組織，4 ℃解凍后，機(jī)械粉碎研磨，取研磨液按ELISA 試劑盒說明書方法檢測氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、MPO 水平。

1.10 Western Blot 法測肺組織蛋白表達(dá)取“1.9”項下-80 ℃冰箱保存的左肺組織100 mg，4 ℃冰箱中解凍后，剪碎，機(jī)械勻漿后，取勻漿液，用蛋白提取試劑盒提取蛋白。BCA 法測蛋白濃度后，取100 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗IL-1β、IL-18、SOD、TXNIP、TRX、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1（1∶800）、β-actin 內(nèi)參抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；滴加羊抗兔HRP 二抗（1∶2 000）在37 ℃孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照，以ImageJ 軟件分析蛋白相對表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理方法用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊性）或Dunnett-T3 檢驗（方差不齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 橙皮苷對小鼠行為變化的影響正常對照組小鼠呼吸均勻，毛發(fā)、飲食及精神活動正常。模型組小鼠呼吸加快、喘息、肺部有濕啰音，毛發(fā)枯槁、精神萎靡，飲食活動減少，且有2 只死亡。橙皮苷組小鼠無死亡，呼吸逐漸平緩，飲食活動有所增加，毛色脫落減少。三甲胺N-氧化物組小鼠有4 只死亡，且上述行為癥狀進(jìn)一步加重。橙皮苷+三甲胺N-氧化物組小鼠有2 只死亡，行為變化與模型組相似。

2.2 橙皮苷對小鼠氨水引咳后咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)的影響見表1。與正常對照組比較，模型組小鼠咳嗽潛伏期縮短，咳嗽次數(shù)增多（P＜0.05）。與模型組比較，橙皮苷組小鼠咳嗽潛伏期延長，咳嗽次數(shù)減少（P＜0.05）；三甲胺N-氧化物組小鼠咳嗽潛伏期進(jìn)一步縮短，咳嗽次數(shù)進(jìn)一步增多（P＜0.05）；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與橙皮苷組比較，橙皮苷+三甲胺N-氧化物組小鼠咳嗽潛伏期縮短，咳嗽次數(shù)增多（P＜0.05）。

表1 橙皮苷對小鼠氨水引咳后咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)的影響（±s）Table 1 Effects of hesperidin on incubation period of cough and cough frequency in mice induced by ammonia（±s）

表1 橙皮苷對小鼠氨水引咳后咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)的影響（±s）Table 1 Effects of hesperidin on incubation period of cough and cough frequency in mice induced by ammonia（±s）

注：與正常對照組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與橙皮苷組比，▲P＜0.05

咳嗽次數(shù)/次8.78±0.40 20.01±2.22*14.53±1.39#25.26±2.12#19.16±0.22▲組別正常對照組模型組橙皮苷組三甲胺N-氧化物組橙皮苷+三甲胺N-氧化物組鼠數(shù)/只20 18 20 16 18咳嗽潛伏期/s 37.38±3.50 15.59±1.44*26.71±2.49#10.11±1.32#16.12±1.43▲

2.3 橙皮苷對小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響見表2。與正常對照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-1β、IL-18 水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，橙皮苷組小鼠支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-1β、IL-18 水平降低（P＜0.05）；三甲胺N-氧化物組小鼠支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-1β、IL-18 水平進(jìn)一步升高（P＜0.05）；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與橙皮苷組比較，橙皮苷+三甲胺N-氧化物組肺泡灌洗液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05）。

表2 橙皮苷對小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響（±s）Table 2 Effect of hesperidin on the number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid in mice（±s）

表2 橙皮苷對小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響（±s）Table 2 Effect of hesperidin on the number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid in mice（±s）

注：與正常對照組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與橙皮苷組比，▲P＜0.05

?

2.4 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織炎癥損傷及NLRP3表達(dá)的影響見圖1、圖2 和表3。HE 染色可見正常對照組小鼠支氣管周圍肺泡結(jié)構(gòu)，支氣管黏膜上皮完整，未見充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；模型組小鼠可見支氣管上皮壞死脫落、腔內(nèi)有少量膿性分泌物，病變支氣管周圍肺泡結(jié)構(gòu)模糊，且炎癥細(xì)胞浸潤明顯，肺泡壁增厚，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤增多。免疫組化染色顯示，模型組小鼠支氣管上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞中NLRP3 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，正常對照組支氣管肺組織中NLRP3 呈弱陽性表達(dá)。與正常對照組比較，模型組織小鼠支氣管肺組織中炎癥損傷評分、NLRP3 陽性表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組比較，橙皮苷組小鼠支氣管肺組織中炎癥損傷評分、NLRP3 陽性表達(dá)降低（P＜0.05）；三甲胺N-氧化物組小鼠支氣管肺組織中炎癥損傷評分、NLRP3 陽性表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.05）；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與橙皮苷組比較，橙皮苷+三甲胺N-氧化物組小鼠支氣管肺組織中炎癥損傷評分、NLRP3 陽性表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖1 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織病理變化的影響（HE 染色，×400）Figure 1 Effect of hesperidin on pathological changes of bronchopulmonary tissue in mice（HE staining，×400）

圖2 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織NLRP3 陽性表達(dá)的影響（免疫組化法，×400）Figure 2 Effect of hesperidin on NLRP3 positive expression of bronchopulmonary tissue in mice（IHC，×400）

表3 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織病理變化及NLRP3 陽性表達(dá)的影響（±s）Table 3 Effects of hesperidin on pathological changes and NLRP3 positive expression of bronchopulmonary tissue in mice（±s）

表3 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織病理變化及NLRP3 陽性表達(dá)的影響（±s）Table 3 Effects of hesperidin on pathological changes and NLRP3 positive expression of bronchopulmonary tissue in mice（±s）

注：與正常對照組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與橙皮苷組比，▲P＜0.05

NLRP3/（平均光密度·mm-2）0.28±0.06 1.33±0.14*0.78±0.07#2.60±0.20#1.35±0.16▲組別正常對照組模型組橙皮苷組三甲胺N-氧化物組橙皮苷+三甲胺N-氧化物組鼠數(shù)/只8 8 8 8 8肺組織炎癥評分/分0.32±0.03 3.99±0.41*2.06±0.18#4.97±0.47#3.96±0.33▲

2.5 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織ROS 含量及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響見圖3 和表4。與正常對照組比較，模型組小鼠ROS 含量及氧化應(yīng)激產(chǎn)物MPO、MDA 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，橙皮苷組小鼠ROS 含量及MPO、MDA 水平降低（P＜0.05）；三甲胺N-氧化物組小鼠ROS 含量及MPO、MDA 水平進(jìn)一步升高（P＜0.05）；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與橙皮苷組比較，橙皮苷+三甲胺N-氧化物組ROS 含量及MPO、MDA 水平升高（P＜0.05）。

圖3 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織ROS 含量的影響Figure 3 Effect of hesperidin on ROS content in bronchopulmonary tissue of mice

表4 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS、MPO、MDA 水平的影響（±s）Table 4 Effects of hesperidin on oxidative stress poducts ROS，MPO and MDA levels in bronchopulmonary tissue of mice（±s）

表4 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS、MPO、MDA 水平的影響（±s）Table 4 Effects of hesperidin on oxidative stress poducts ROS，MPO and MDA levels in bronchopulmonary tissue of mice（±s）

注：與正常對照組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與橙皮苷組比，▲P＜0.05

MDA/（U·mg-1）10.39±1.33 70.97±7.14*41.02±4.11#99.57±9.00#69.95±6.86▲組別正常對照組模型組橙皮苷組三甲胺N-氧化物組橙皮苷+三甲胺N-氧化物組鼠數(shù)/只12 10 12 8 10 ROS/%2.19±0.10 18.90±1.19*10.52±1.25#30.99±3.19#19.05±1.91▲MPO/（U·g-1）22.02±2.03 53.07±5.22*30.25±3.22#74.88±7.25#54.08±5.03▲

2.6 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織IL-1β、IL-18、SOD、CAT 蛋白表達(dá)的影響見圖4 和表5。與正常對照組比較，模型組小鼠支氣管肺組織IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），SOD、CAT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，橙皮苷組小鼠IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），SOD、CAT蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；三甲胺N-氧化物組小鼠IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.05），SOD、CAT 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05）；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與橙皮苷組比較，橙皮苷+三甲胺N-氧化物組IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），SOD、CAT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠支氣管肺組織中IL-1β、IL-18、SOD、CAT蛋白表達(dá)的條帶Figure 4 Protein expression brands of IL-1β，IL-18，SOD and CAT in bronchopulmonary tissue of mice

表5 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織IL-1β、IL-18、SOD、CAT 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 5 Effects of hesperidin on protein expressions of IL-1β，IL-18，SOD and CAT in bronchopulmonary tissue of mice（±s）

表5 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織IL-1β、IL-18、SOD、CAT 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 5 Effects of hesperidin on protein expressions of IL-1β，IL-18，SOD and CAT in bronchopulmonary tissue of mice（±s）

注：與正常對照組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與橙皮苷組比，▲P＜0.05

CAT 1.16±0.10 0.39±0.03*0.83±0.08#0.13±0.01#0.38±0.03▲組別正常對照組模型組橙皮苷組三甲胺N-氧化物組橙皮苷+三甲胺N-氧化物組鼠數(shù)/只12 10 12 8 10 IL-1β 1.01±0.08 1.77±0.17*1.31±0.13#2.31±0.21#1.74±0.16▲IL-18 1.15±0.12 1.88±0.18*1.44±0.15#2.49±0.24#1.80±0.18▲SOD 1.19±0.10 0.43±0.04*0.92±0.09#0.19±0.01#0.41±0.04▲

2.7 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織ROS/NLRP3 通路下游蛋白表達(dá)的影響見圖5 和表6。與正常對照組比較，模型組小鼠支氣管肺組織TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組比較，橙皮苷組小鼠TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；三甲胺N-氧化物組小鼠TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.05）；橙皮苷+三甲胺N-氧化物組與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與橙皮苷組比較，橙皮苷+三甲胺N-氧化物組小鼠上述指標(biāo)升高（P＜0.05）。

圖5 小鼠支氣管肺組織中TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表達(dá)的條帶Figure 5 Protein expression brands TXNIP，ASC，pro-Caspase-1 and Caspase-1 in bronchopulmonary tissue of mice

表6 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 6 Effects of hesperidin on protein expressions of TXNIP，ASC，pro-Caspase-1 and Caspase-1 in bronchopulmonary tissue of mice（±s）

表6 橙皮苷對小鼠支氣管肺組織TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 6 Effects of hesperidin on protein expressions of TXNIP，ASC，pro-Caspase-1 and Caspase-1 in bronchopulmonary tissue of mice（±s）

注：與正常對照組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05；與橙皮苷組比，▲P＜0.05

Caspase-1 1.01±0.08 1.70±0.17*1.40±0.14#2.00±0.20#1.71±0.16▲組別正常對照組模型組橙皮苷組三甲胺N-氧化物組橙皮苷+三甲胺N-氧化物組鼠數(shù)/只12 10 12 8 10 TXNIP 1.11±0.09 1.66±0.16*1.27±0.12#2.25±0.24#1.67±0.16▲ASC 1.07±0.07 2.03±0.20*1.55±0.15#2.79±0.27#2.01±0.22▲pro-Caspase-1 1.16±0.10 2.19±0.23*1.73±0.18#2.73±0.01#2.18±0.23▲

3 討論

急性支氣管炎發(fā)病率較高，據(jù)流行病學(xué)分析[13-14]，中國安徽省感冒流行率為1.5%，其中有0.9%患者有急性支氣管炎發(fā)病癥狀，而在美國急性支氣管炎的發(fā)病率達(dá)12.1%。急性支氣管炎反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重危害患者身心健康，咳嗽、咯痰、雙肺呼吸音粗且伴干啰音或粗中濕啰音，其中咳嗽是急性支氣管炎患者的主訴病癥[15]。目前研究[16]認(rèn)為炎癥是咳嗽產(chǎn)生的主要原因之一。有研究[17]認(rèn)為炎癥可影響氣管及支氣管、鼻、喉等黏膜分泌痰液，而刺激呼吸道，產(chǎn)生咳嗽。本研究用煙熏法建立小鼠急性支氣管炎模型后發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)呼吸急促、呼吸音粗、濕啰音及咳嗽等癥狀，氨水引咳后，小鼠咳嗽潛伏期縮短，咳嗽次數(shù)增多，光鏡下可見小鼠支氣管上皮細(xì)胞壞死、腔內(nèi)膿性分泌物增多、肺泡結(jié)構(gòu)不清、且中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤明顯，肺泡灌洗液中及支氣管肺組織中炎性因子IL-1β、IL-18 水平升高，提示造模成功。另外，氧化應(yīng)激也參與急性支氣管炎的發(fā)展過程，且是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。有關(guān)研究[18]發(fā)現(xiàn)吸煙可刺激肺部中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌氧化酶和抗氧化酶類物質(zhì)，引起氧化酶-抗氧化酶失衡而導(dǎo)致肺部炎癥病變；Khan 等[19]發(fā)現(xiàn)，戒煙后氣道內(nèi)氧化酶仍呈現(xiàn)持續(xù)的高水平，并認(rèn)為戒煙后氣道炎癥發(fā)應(yīng)仍持續(xù)發(fā)展，可能與氧化應(yīng)激所致的轉(zhuǎn)錄因子激活有關(guān)。MDA、MPO 及ROS 為氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，SOD 為重要的抗氧化酶。本研究用免疫熒光法檢測到ROS 在支氣管上皮細(xì)胞中陽性表達(dá)升高，且支氣管肺組織MDA、MPO 升高的同時，SOD 抗氧化蛋白表達(dá)降低，證實氧化應(yīng)激反應(yīng)參與急性支氣管炎發(fā)病過程。

橙皮苷具有抗氧化、抗炎等藥理作用。吳舒懋等[11]發(fā)現(xiàn)橙皮苷可為呼吸道抗炎反應(yīng)的首選藥。謝琪等[7]發(fā)現(xiàn)橙皮苷能夠通過清除ROS 自由基，上調(diào)SOD水平來防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)肺組織免受損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷干預(yù)治療后，小鼠呼吸急促及咳嗽等癥狀均明顯緩解，支氣管肺組織壞死及炎性浸潤等病理損傷減輕，炎癥因子IL-1β、IL-18及氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS、MPO 及MDA 分泌減少，抗氧化酶SOD 水平增加，提示橙皮苷可能通過抗氧化、抗炎反應(yīng)，緩解急性支氣管炎小鼠支氣管肺組織損傷。

ROS/NLRP3 是介導(dǎo)機(jī)體炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路之一。研究[20]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激刺激下，ROS可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化-還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)通路TXNIP 從抗氧化硫氧還蛋白中解離，來激活NLRP3 炎性小體，釋放炎癥因子IL-1β、IL-18，炎癥因子IL-1β、IL-18釋放水平升高可進(jìn)一步促進(jìn)ROS 活化釋放而加劇氧化應(yīng)激損傷；另有研究[6]發(fā)現(xiàn)，ROS 刺激NLRP3 炎性小體激活的同時，還可刺激NLRP3 下游ASC 活化，促進(jìn)pro-Caspase-1 激活成為成熟的Caspase-1，并誘導(dǎo)IL-1β、IL-18 成熟及分泌，而介導(dǎo)炎性反應(yīng)，并認(rèn)為抑制ROS，可明顯降低細(xì)胞內(nèi)Caspase-1 及IL-1β 水平來緩解細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，使用ROS/NLRP3 通路激活劑（三甲胺N-氧化物）進(jìn)一步促進(jìn)模型組大鼠ROS/NLRP3 通路活化后，TXNIP、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 及IL-1β、IL-18 等表達(dá)進(jìn)一步升高，支氣管肺組織炎性浸潤及氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)一步加重，小鼠咳嗽癥狀進(jìn)一步加重，提示ROS/NLRP3 通路活化，可能是介導(dǎo)急性支氣管炎小鼠支氣管肺組織損傷的重要機(jī)制。橙皮苷干預(yù)組小鼠支氣管肺組織中ROS/NLRP3 通路處于抑制狀態(tài)，提示橙皮苷降低急性支氣管炎小鼠支氣管肺組織炎癥、氧化應(yīng)激損傷，改善咳嗽癥狀的作用，可能與抑制ROS-NLRP3 通路活化有關(guān)。為了進(jìn)一步驗證橙皮苷的作用機(jī)制，本研究在橙皮苷處理的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用三甲胺N-氧化物以誘導(dǎo)ROS/NLRP3 通路激活，結(jié)果顯示，三甲胺N-氧化物可減弱橙皮苷對急性支氣管炎小鼠肺損傷的改善作用。此外，與三甲胺N-氧化物單獨干預(yù)組比，橙皮苷與三甲胺N-氧化物的聯(lián)合干預(yù)組急性支氣管炎小鼠中ROS/NLRP3 通路的活化受到抑制，急性支氣管炎小鼠肺損傷程度有所減輕，說明橙皮苷對三甲胺N-氧化物誘導(dǎo)激活后的ROS/NLRP3 通路具有一定的拮抗作用，但這種拮抗作用不足以改善急性支氣管炎小鼠的肺損傷。

綜上所述，橙皮苷可能通過抑制ROS/NLRP3 通路活化，來改善急性支氣管炎小鼠支氣管肺組織炎癥及氧化應(yīng)激損傷，緩解咳嗽癥狀。這可能為闡明橙皮苷緩解急性支氣管炎小鼠支氣管肺組織損傷的可能機(jī)制提供一定參考，但ROS/NLRP3 通路還涉及細(xì)胞焦亡、線粒體自噬等其他機(jī)制調(diào)節(jié)，且橙皮苷干預(yù)ROS/NLRP3 通路活化的靶標(biāo)分子也不明確，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。