水流速度對饑餓期中華絨螯蟹親蟹能量代謝的影響

李春波，沈晨晨，馮廣朋，趙 峰，張 濤，楊 剛

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海長江口漁業(yè)資源增殖和生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)具有洄游習(xí)性，其棲息水域隨生活階段不同而存在一定差異。長江口生境獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，是魚、蝦、蟹類等水生動物重要的棲息地、繁殖場以及索餌場[1]，亦是中華絨螯蟹親蟹最重要的產(chǎn)卵場。由于受涉水工程、航道疏浚、過度捕撈等人類活動的影響，長江中華絨螯蟹天然資源在20世紀(jì)80年代后出現(xiàn)急劇衰退，至21世紀(jì)初一度瀕臨枯竭[2，3]。自2004年起，長江中華絨螯蟹的棲息地修復(fù)與資源增殖工作大量開展，其天然資源顯著回升[4，5]。其中，增殖放流是目前國內(nèi)外的主要修復(fù)措施，對天然資源的恢復(fù)具有重要意義[6，7]。相關(guān)部門已在長江口多次開展中華絨螯蟹親蟹放流活動，對中華絨螯蟹資源恢復(fù)起到了關(guān)鍵的推動作用[8-10]。目前，關(guān)于中華絨螯蟹增殖放流的研究主要集中于標(biāo)記技術(shù)、放流苗種的選擇、放流前暫養(yǎng)、放流規(guī)格和放流效果評估等方面，關(guān)于放流水域環(huán)境因子的研究相對較少[11-13]。

水流作為影響水生動物的重要生態(tài)因子之一，對促進(jìn)水生動物的生長[14]、提高運(yùn)動能力和生存力[15]、改善肉質(zhì)[16]、調(diào)整繁殖期[17]以及提高增殖放流效果[18]等方面均具有一定影響。目前關(guān)于水流對甲殼類影響研究多集中于南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)的游泳行為[19，20]、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)蛻殼[21]及藍(lán)蟹(Callinectessapidus)產(chǎn)卵洄游[22-24]等方面，關(guān)于水流對中華絨螯蟹行為及其生理影響的研究尚未見報(bào)道。此外，天然水體中天然餌料往往會因環(huán)境變化和季節(jié)交替而產(chǎn)生較大波動，野生動物會受到不同程度的饑餓脅迫。諸多研究表明，饑餓脅迫會對甲殼類動物早期發(fā)育階段的生長發(fā)育產(chǎn)生較大影響[25-27]，且饑餓對動物的代謝活動和內(nèi)源性能量貯存物質(zhì)的消耗也會產(chǎn)生一定作用[28]。在放流初期，中華絨螯蟹需要一定時(shí)間去適應(yīng)新的水體環(huán)境，短時(shí)間內(nèi)可能處于饑餓狀態(tài)，對其能量代謝會產(chǎn)生一定的影響。

本研究對不同饑餓脅迫時(shí)間下親蟹的耗氧率、最大耐流速度、不同水流速度對饑餓期親蟹的耗氧率及肌肉、肝胰腺、鰓等組織中能量代謝酶活性進(jìn)行研究，以期闡述饑餓時(shí)間和水流速度對親蟹氧代謝和能量代謝的影響，為中華絨螯蟹增殖放流時(shí)位點(diǎn)的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與材料

實(shí)驗(yàn)在行為學(xué)裝置Loligo systems(丹麥，Loligo systems公司)中進(jìn)行，通過Loligo systems系統(tǒng)對水流速度進(jìn)行調(diào)節(jié)，并對水體溶解氧含量進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)所用親蟹全部為雌蟹，均取自高郵湖，殼長為(55.13±2.26)mm，殼寬為(58.25±2.06)mm，體質(zhì)量為(97.03±11.09)g。將實(shí)驗(yàn)蟹室內(nèi)馴化一周，使其適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境，暫養(yǎng)期間每天晚上按照體質(zhì)量的2%～3%投喂一次鮮活縊蟶(Sinonovaculaconstricta)。暫養(yǎng)結(jié)束后選擇附肢完整、健康活力強(qiáng)的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對象。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同饑餓時(shí)間對親蟹耗氧率的影響

實(shí)驗(yàn)以正常攝食為對照組，以饑餓2、4、6、8、10 d為實(shí)驗(yàn)組，每組包括3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行組1只實(shí)驗(yàn)蟹。實(shí)驗(yàn)前，通過增氧器對裝置中的水體進(jìn)行充氧，使水體中溶氧含量保持在(8.00±0.5)mg/L。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將實(shí)驗(yàn)蟹放進(jìn)裝置中，密封(保證裝置中無氣泡)，使其適應(yīng)水體環(huán)境20 min，1 h后記錄水體中溶解氧含量，并將實(shí)驗(yàn)蟹取出，擦干表面水分，稱重，用于耗氧率的計(jì)算，其中耗氧率的計(jì)算公式為：

耗氧率=(D0-D)×V/(W×T)

D0為初始溶氧量，D為結(jié)束時(shí)溶氧量，V為裝置體積，W為實(shí)驗(yàn)蟹體質(zhì)量，T為實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1.2.2 饑餓狀態(tài)下親蟹最大耐流速度的測定

不同饑餓時(shí)間對耗氧率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，饑餓4 d后耗氧率趨于穩(wěn)定，因此選擇饑餓4 d的實(shí)驗(yàn)蟹作為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行最大耐流速度的測定。將實(shí)驗(yàn)蟹放在裝置中，設(shè)置低流速(5 cm/s)，使其適應(yīng)1 h后按照每5 min增加2 cm/s的增速進(jìn)行測定，直至實(shí)驗(yàn)蟹緊貼在泳道邊緣無法移動，記錄此時(shí)水流速度即為親蟹最大耐流速度，共進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行組1只實(shí)驗(yàn)蟹。

1.2.3 不同水流速度下饑餓期親蟹耗氧率和相關(guān)能量代謝酶活性的測定

設(shè)置10、20和30 cm/s水流速度為實(shí)驗(yàn)組，靜止?fàn)顟B(tài)組為對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測定水體溶解氧含量和實(shí)驗(yàn)蟹體質(zhì)量，計(jì)算耗氧率。同時(shí)，將實(shí)驗(yàn)蟹放在冰塊上麻醉，剖取肌肉、肝胰腺和鰓組織后迅速放到液氮中，放到-80 ℃冰箱中保存，用于能量代謝酶活性的檢測。檢測指標(biāo)為肌肉和肝胰腺組織中的丙酮酸激酶(PK)和己糖激酶(HK)以及肌肉、肝胰腺和鰓組織中的琥珀酸脫氫酶(SDH)活性，酶活均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與分析

耗氧率測定記錄初始和結(jié)束時(shí)水體中溶解氧含量以及實(shí)驗(yàn)蟹的體質(zhì)量，最大耐流速度記錄結(jié)束時(shí)水體流速，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，運(yùn)用SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合要求后通過單因素方差分析(One-way ANOVA)判斷各組數(shù)據(jù)間是否存在顯著性差異(P<0.05)，并用Duncan’s多重比較法分析各組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 饑餓時(shí)間和水流速度對親蟹耗氧率的影響

親蟹在正常攝食狀態(tài)下和饑餓2、4、6、8和10 d時(shí)的耗氧率變化情況如圖1-A，親蟹的耗氧率隨饑餓時(shí)間延長而呈現(xiàn)下降趨勢，在饑餓4 d后趨于穩(wěn)定，顯著低于正常攝食狀態(tài)和饑餓2 d組，與饑餓6、8和10 d組無顯著差異。

圖1 不同饑餓時(shí)間下親蟹的耗氧率(A)和不同水流速度下饑餓期親蟹的耗氧率(B)Fig.1 The oxygen consumption rate of parent crabs in the different starvation time(A)and the oxygen consumption rates of parent crabs with starvation in the different water velocity(B)不同小寫字母表示不同時(shí)間點(diǎn)或流速組有顯著性差異(P<0.05)

饑餓處理4 d后親蟹的最大耐流速度為40 cm/s。饑餓期親蟹在水流速度為0、10、20和30 cm/s的水體耗氧率變化情況如圖1-B。隨著水流速度的增大，親蟹耗氧率不斷升高，實(shí)驗(yàn)組耗氧率均顯著高于對照組。20 cm/s和30 cm/s組耗氧率無顯著差異，表明當(dāng)水流大于20 cm/s后親蟹的耗氧率趨于穩(wěn)定。

2.2 水流速度對饑餓期親蟹琥珀酸脫氫酶活性的影響

饑餓期親蟹在0、10、20和30 cm/s水流速度下肌肉和鰓SDH活性變化情況如圖2所示，肌肉和鰓中SDH活性在各流速組間存在顯著性差異，且20 cm/s和30 cm/s組活性顯著高于對照組，但肝胰腺中SDH活性在各水流組間無顯著性差異。不同組織中SDH活性研究結(jié)果表明，肌肉組織中SDH活性明顯高于其他兩種組織。

圖2 水流速度對饑餓期親蟹琥珀酸脫氫酶活性的影響Fig.2 Effect of water velocity on the activity of succinate dehydrogenase in the parent crabs with starvation不同小寫字母表示不同流速組有顯著性差異(P<0.05)

2.3 水流速度對饑餓期親蟹丙酮酸激酶和己糖激酶活性的影響

饑餓期親蟹在0、10、20和30 cm/s水流下肌肉和肝胰腺中PK和HK活性變化情況如圖3所示，肌肉中流速組(10～30 cm/s)PK和HK活性顯著高于對照組，肝胰腺中流速組PK(10～30 cm/s)和HK(20～30 cm/s)活性顯著高于對照組。肌肉中PK和HK活性均高于肝胰腺。

圖3 水流速度對饑餓期親蟹肌肉和肝胰腺丙酮酸激酶(A)和己糖激酶(B)活性的影響Fig.3 Effect of water velocity on the activity of pyruvate kinase(A)and hexokinase(B) in the muscle and hepatopancreas of parent crabs with starvation不同小寫字母表示不同流速組有顯著性差異(P<0.05)

3 討論

3.1 饑餓時(shí)間和水流速度對親蟹耗氧率的影響

在自然狀態(tài)下，水生生物的食物存在的不確定性，會使水生生物面臨饑餓困境，而饑餓會直接影響水生動物的存活率、生長率和代謝情況。耗氧率作為衡量能量代謝的重要指標(biāo)，對研究動物的代謝情況至關(guān)重要[29，30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，親蟹耗氧率在饑餓0～4 d時(shí)急劇下降，第4天后趨于穩(wěn)定，這與南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)、花羔紅點(diǎn)鮭(Salevlinusmalma)等[31，32]的研究結(jié)果相似。在饑餓初期，為使自身存活時(shí)間得到延長，親蟹自身能量的消耗減少，耗氧率急劇下降。在饑餓脅迫4 d后，親蟹耗氧率趨于穩(wěn)定，可能是因?yàn)橛H蟹需要將代謝維持在一定水平，以尋找食物和應(yīng)對突發(fā)狀況，這與MEHNER等[33]的觀點(diǎn)一致。

諸多研究表明一定的水流速度可以增強(qiáng)水生動物的攝食、生長代謝和繁殖，流水環(huán)境有利于水生動物的活動、聚集和洄游等行為[34-37]。親蟹主要在長江口及附近水域生長繁殖，而長江口由于漲落潮的存在，水體具有一定的流動速度[38]。處于早期發(fā)育階段的中華絨螯蟹可以借助水流進(jìn)行洄游，而親蟹不具備強(qiáng)大的游泳能力，因此在水流沖擊下，它們進(jìn)行頂流運(yùn)動，使其不被沖離適宜棲息地，水流會對其代謝產(chǎn)生較大的影響。本研究結(jié)果表明隨水流速度的增加，親蟹的耗氧率呈上升趨勢，這與房敏等[39]、吳青怡等[40]、張永泉等[41]的研究結(jié)果一致。

3.2水流速度對饑餓期親蟹琥珀酸脫氫酶活性的影響

SDH作為有氧呼吸的關(guān)鍵酶，在三羧酸循環(huán)中可以將琥珀酸氧化成延胡索酸[42]，其活性高低可以在一定程度上反映出水生生物的有氧代謝水平[43]。本研究表明，隨著水流速度的增加，肌肉和鰓中SDH活性明顯增加，肝胰腺中SDH 活性無明顯變化，且肌肉中SDH 活性明顯高于肝胰腺和鰓組織，說明隨水流速度增加，親蟹有氧代謝增強(qiáng)，且肌肉有氧代謝水平顯著高于肝胰腺和鰓。本實(shí)驗(yàn)在氧氣充足的條件下進(jìn)行，親蟹主要進(jìn)行有氧呼吸，因此隨水流速度增加，各組織中SDH活性均出現(xiàn)明顯增長。在短期水流脅迫下，親蟹足部不停擺動，以維持自己在原有棲息環(huán)境，從而增強(qiáng)了肌肉的有氧代謝。但有氧呼吸可以產(chǎn)生較多的能量，因此肌肉中SDH活性明顯高于鰓和肝胰腺，這與姬慧等[44]的觀點(diǎn)一致。

3.3 水流速度對饑餓期親蟹丙酮酸激酶和己糖激酶活性的影響

PK和HK作為糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶，對能量代謝的研究至關(guān)重要，其中己糖激酶的主要作用是將葡萄糖催化成6-磷酸葡萄糖[45]，PK則主要是催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP[46]。本研究結(jié)果表明，在水流脅迫下，肌肉和肝胰腺組織中HK和PK活性均大于靜止?fàn)顟B(tài)，表明親蟹在水流脅迫下會利用更多的葡萄糖。推測主要原因是水流脅迫下親蟹能量消耗增多，需要利用更多的葡萄糖，從而糖酵解關(guān)鍵限速酶PK和HK活性升高。但三種水流速度下的HK和PK活性無明顯差異，則可能與糖酵解途徑產(chǎn)生的ATP較少有關(guān)。水流刺激下親蟹需要消耗大量的能量，在氧氣充足的情況下，有氧代謝可以產(chǎn)生較多的ATP，因此在水流刺激下，親蟹主要通過有氧代謝提供能量，故HK和PK活性無顯著性差異。肌肉組織中HK和PK活性明顯大于肝胰腺組織中則與足部運(yùn)動有關(guān)。

4 小結(jié)

親蟹在饑餓4 d后代謝率趨于穩(wěn)定，此時(shí)最大耐流速度為40 cm/s。在0、10、20和30 cm/s水流速度脅迫下，親蟹的耗氧率、SDH、PK和HK活性隨水流速度增加逐漸升高，且肌肉中能量代謝酶活性高于肝胰腺和鰓。因此，在親蟹人工放流時(shí)應(yīng)選擇水流速度較慢且食物充足的水域進(jìn)行放流，減少自身能量的消耗，有效提高存活率。