虹鱒殺鮭氣單胞菌耐藥性研究與鹽酸多西環(huán)素給藥方案制定

劉 博，張 培，彭嘉琪，程 波，趙雅賢，穆迎春，孫慧武

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京100141；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站，河北秦皇島066100)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)隸屬于鯡形目鮭科，是世界上養(yǎng)殖最多的魚類之一[1]，在我國20多個省(市)均有養(yǎng)殖[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴大，水質(zhì)環(huán)境惡化、養(yǎng)殖品質(zhì)下降、流行性暴發(fā)性病害頻發(fā)等問題，極大地阻礙了虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[3]。其中殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)引起的癤瘡病是虹鱒養(yǎng)殖過程中常見的細菌病之一[4]。

殺鮭氣單胞菌屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)，廣泛分布在自然環(huán)境中，是氣單胞菌屬最早發(fā)現(xiàn)報道的病原菌之一[5]。殺鮭氣單胞菌經(jīng)過皮膚、鰓、口及血液等多種途徑感染魚類，導(dǎo)致魚類產(chǎn)生癤瘡病或潰瘍病[6]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大、集約化程度越來越高，殺鮭氣單胞菌引起的病害也日益嚴重，在鯉(Cyprinuscarpio)[7]、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[8]、烏鱧(Channaargus)[9]、大西洋鮭(Salmosalar)[10]和石斑魚(Epinephelussp)[11]上均有報道感染案例，且近年危害波及海水和淡水，野生和養(yǎng)殖等各種魚類[12-13]。殺鮭氣單胞菌可以感染哺乳動物和人類引發(fā)疾病，存在人-獸傳播風(fēng)險[14]。殺鮭氣單胞菌還可同氣單胞菌屬中的溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌等導(dǎo)致混合感染，造成養(yǎng)殖魚類短時間內(nèi)大量死亡[15]。近年來，殺鮭氣單胞菌攜帶抗生素耐藥基因的質(zhì)粒已完全被鑒定出來，可能對四環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素、磺胺類、氨芐青霉素、羧芐青霉素、鏈霉素和大分子霉素產(chǎn)生耐藥性，而且攜帶耐藥基因的質(zhì)粒很可能會轉(zhuǎn)移到其他細菌中，產(chǎn)生相同的耐藥性，對畜牧業(yè)和人類帶來危害[16]。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療殺鮭氣單胞菌病等細菌性疾病主要依賴抗生素，在實際用藥過程中，因病原耐藥性的產(chǎn)生、科學(xué)用藥理論未能及時研究更新等因素，抗生素的使用具有盲目性，濫用抗生素、超劑量使用抗生素、不遵守休藥期等問題普遍發(fā)生，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生和藥物殘留超標(biāo)等問題較為突出[17]。如何科學(xué)使用抗生素治療細菌性疾病成為行業(yè)的迫切需求。本研究以虹鱒殺鮭氣單胞菌病為研究對象，通過體外藥敏實驗，了解其耐藥性現(xiàn)狀，篩選出有效治療癤瘡病的藥物，并通過構(gòu)建虹鱒殺鮭氣單胞菌人工感染模型，探究藥物在病魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，研究既能達到治療效果又能最大限度降低耐藥性產(chǎn)生的藥物使用劑量，以期為制定虹鱒殺鮭氣單胞菌病科學(xué)合理的用藥方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗虹鱒及菌株

實驗用虹鱒由北京市房山區(qū)海墨威養(yǎng)殖場提供，體質(zhì)量為(200±20)g，暫養(yǎng)一周后挑選活躍且體表無傷痕的實驗魚進行口灌采樣工作，養(yǎng)殖水溫(16.0±0.5)℃。

實驗菌株為3株分別分離自2019年、2020年和2021年患病虹鱒的殺鮭氣單胞菌，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所捐贈，分別命名為AS19、AS20和AS21。

1.2 材料與儀器

水解酪蛋白胨(MH)瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基和LB營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司；鹽酸多西環(huán)素原藥購自上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸、磷酸二氫鈉和乙二胺四乙酸二鈉均購自阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷和甲酸均購自Fisher，色譜純。

臺式高速低溫離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；無菌超凈工作臺(日本Hitachi公司)；恒溫培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司)；恒溫搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；多管渦旋混合儀(萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；超聲波清洗機(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；Xevo TQ-XS三重四級桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(日本Shimadzu公司)。

1.3 殺鮭氣單胞菌對抗生素的耐藥性與體外藥效測定

1.3.1 殺鮭氣單胞菌的耐藥性

采用紙片擴散法(K-B法)對3株殺鮭氣單胞菌進行敏感性測定，將濃度為1×108CFU/mL菌株均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置15 min后，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面。20 ℃培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，重復(fù)三次實驗，計算平均值[18]。采用E.coliATCC25922菌株進行藥敏實驗質(zhì)控。

1.3.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定方法

參考美國臨床和實驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會頒定的標(biāo)準(zhǔn)[19]，采用微量肉湯稀釋法測量鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、硫酸新霉素和氟苯尼考4種藥物對3株殺鮭氣單胞菌的MIC和MBC。將4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品以二甲基亞砜(DMSO)溶劑作為助溶劑，分別配制成濃度為1 280 μg/mL的儲存液。正式實驗時用MH肉湯分別稀釋藥物濃度，稀釋成濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL的藥液備用。制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1 000稀釋后備用，最終菌液濃度在1×105CFU/mL。將不同濃度的抗菌藥物溶液，分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔100 μL，同時第1至第11孔加入100 μL菌懸液，使每孔中最終藥物濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/mL，第12孔加入200 μL菌液，不加藥物作為生長對照，密封后置于20 ℃培養(yǎng)箱中，孵育24 h判斷結(jié)果。以96孔板中未變渾濁無細菌生長的濃度判定為最小抑菌濃度(MIC)[20]。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每個孔吸取100 μL涂布平板，24 h后菌落數(shù)小于5的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)，重復(fù)實驗3次[21]。

1.3.3 防耐藥突變濃度(MPC)和耐藥突變選擇窗(MSW)

以殺鮭氣單胞菌菌株AS21作為研究對象，采用含藥瓊脂平板法測定防耐藥突變濃度(MPC)。將單個病原菌AS21接種于MH肉湯培養(yǎng)基中，放置于20 ℃、180 r/min搖床中培育24 h，采用平板計數(shù)法對菌液進行計數(shù)。計數(shù)后將菌液放置于離心機中5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將菌液濃度濃縮至1×1010CFU/mL，吸取100 μL涂布于含有1、2、4、6、8、10、12和16倍MIC藥物濃度的含藥平板上，每個藥物濃度4個平行，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育72 h，觀察平板有無菌落生長，得出菌落生長與不生長的濃度范圍。根據(jù)此濃度范圍細化含藥平板濃度，重復(fù)一次實驗過程，平板無菌落生長的最低藥物濃度即為防耐藥突變濃度(MPC)。最小抑菌濃度到防耐藥突變濃度之間的范圍即為耐藥突變選擇窗(MSW)。

1.3.4 半致死濃度的測定以及人工染病模型的建立

將健康虹鱒分為6組，每組10尾，養(yǎng)殖水溫(16±0.5)℃。其中5組從腹腔分別注射濃度為1×108、1×107、1×106、1×105和1×104CFU/mL的AS21菌液0.2 mL，命名為實驗組A、B、C、D和E，第6組注射0.2 mL生理鹽水作為空白對照組。分別在注射后1、2、4、6、8、12、18、24、36、48、72和96 h觀察記錄各組魚體發(fā)病和死亡數(shù)量。計算半數(shù)致死量(LD50)。

以LD50劑量殺鮭氣單胞菌菌液腹腔注射健康虹鱒，24 h后挑選具明顯發(fā)病癥狀的個體260尾作為疾病感染模型，進行后續(xù)給藥實驗

1.4 鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

1.4.1 給藥實驗設(shè)計

將虹鱒疾病感染模型分為4組，每組65尾，分別按照20、30、40和60 mg/kg劑量進行鹽酸多西環(huán)素單次灌給藥，同時在藥液中加入一定量的飼料粉末，于給藥后0.167、0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72和96 h進行魚體血液、肝臟、腎臟、肌肉樣本采集，每個時間點每組分別采集5尾。血液采用尾靜脈取血后，置于含有1%肝素鈉的離心管中，8 000 r/min離心10 min，取上清保存；肝臟、腎臟和肌肉采集后均質(zhì)。所有樣品-40 ℃保存待測。

1.4.2 樣品前處理

樣品檢測參照GB 31656.11-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、鹽酸多西環(huán)素殘留量的測定》進行。

準(zhǔn)確量取樣品[血漿0.2 mL，肌肉(2.00±0.02)g，肝臟(0.50±0.02)g，腎臟(0.50±0.02)g，各組織獨立檢測]置于50 mL離心管中，加入Na2EDTA-McLLvaine緩沖溶液6 mL，醋酸鉛溶液2 mL，渦旋混勻5 min，超聲波提取10 min，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，吸取上清液至另一50 mL離心管中；殘渣重復(fù)提取2次，合并3次提取液。血漿提取液直接進行固相萃取。肌肉、肝臟和腎臟的提取液中加入10 mL正己烷，渦旋混勻5 min，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取下層清液進行固相萃取。

固相萃取分為活化、上樣、淋洗和洗脫4步。向固相萃取柱中依次加入5 mL甲醇和5 mL水進行活化，活化完成后加入10 mL樣品備用提取液上樣，控制流速約1 mL/min，之后依次使用5 mL水和5 mL甲醇溶液淋洗固相萃取柱，棄去全部液體，減壓抽干5 min，最后使用5 mL甲醇-乙酸乙酯洗脫，使用15 mL離心管收集洗脫液。洗脫液于40 ℃以下氮吹至近干，加入1 mL甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液溶解殘留物，渦旋5 min，過0.22 μm微孔濾膜后，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

1.4.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)，流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，進樣體積為10 μL，柱溫30 ℃，流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓4 200 V，離子傳輸管溫度350 ℃，毛細管電壓3 000 V，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量600 L/Hr，錐孔氣流量150 L/Hr。

鹽酸多西環(huán)素定性離子對、定量離子對和碰撞能量見表1。

表1 鹽酸多西環(huán)素定性離子對、定量離子對和碰撞能量Tab.1 Doxycycline hydrochloride qualitative ion pairing，quantitative ion pairing，and collision energy

1.4.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

采集未給藥虹鱒感染模型的血漿、肝臟、腎臟和肌肉作為空白組織樣品，按照1.4.2節(jié)的樣品前處理步驟，得到氮吹之前的空白洗脫液，精密量取鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成藥物含量為5、10、20、50、100、200、500、1 000和2 000 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，其他前處理步驟同其他樣品。以基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.5 回收率、精密度、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)

回收率：分別取各組織一定量的空白樣品(0.2 mL血漿、2 g肌肉、1 g肝臟和1 g腎臟)，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，制備藥物含量為10、50、100 μg/L的待測樣品，每組6個平行，參照1.4.2樣品前處理方法進行前處理，上機檢測，得出實際檢測濃度，回收率=上機檢測濃度/理論濃度×100%。

精密度：日內(nèi)精密度為將上述用于測定回收率的樣品于1天內(nèi)重復(fù)進樣三次；日間精密度起將上述用于測定回收率的樣品每天進樣一次，連續(xù)三天進樣。計算得出日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

檢測限和定量限：將空白樣品制成含有低濃度鹽酸多西環(huán)素的樣品，按照“1.4.2樣品前處理”中的方法進行樣品前處理后上機檢測。信噪比(S/N)≥3時藥物在樣品中的最低濃度為檢測限(LOD)，信噪比(S/N)≥10時藥物在樣品中的最低濃度為定量限(LOQ)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel、GraphPad Prism 8.0計算時間濃度曲線，采用DAS 2.0軟件計算鹽酸多西環(huán)素藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 藥敏實驗結(jié)果

本研究測定了3株殺鮭氣單胞菌對24種藥物的敏感性,藥敏實驗結(jié)果見表2。其中,3株殺鮭氣單胞菌對頭孢哌酮、硫酸新霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶、阿奇霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟、慶大霉素、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素和氟苯尼考共17種藥物高度敏感;對復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、青霉素、阿莫西林、頭孢唑林共5種藥物耐藥;對哌拉西林和鏈霉素2種藥物敏感狀態(tài)不一致。

表2 3株殺鮭氣單胞菌的藥敏實驗結(jié)果Tab.2 Susceptibility test results of 3 strains of A.salmonicida

根據(jù)藥敏實驗判定標(biāo)準(zhǔn)和《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號》，篩選出4種對殺鮭氣單胞菌敏感、且批準(zhǔn)使用的藥物：鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、硫酸新霉素和氟苯尼考。

2.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、新霉素和氟苯尼考4種藥物對3株殺鮭氣單胞菌的MIC及MBC結(jié)果見表3。結(jié)果表明，對殺鮭氣單胞菌AS19，鹽酸多西環(huán)素抑殺效果最明顯，恩諾沙星和氟苯尼考的抑殺效果次之，硫酸新霉素抑殺效果最弱；對殺鮭氣單胞菌AS20，恩諾沙星的抑殺效果最明顯，鹽酸多西環(huán)素的抑殺效果略低于恩諾沙星，氟苯尼考和硫酸新霉素的抑殺效果次之；對殺鮭氣單胞菌AS21，鹽酸多西環(huán)素與恩諾沙星的MIC相同，鹽酸多西環(huán)素的MBC略低于恩諾沙星的MBC，氟苯尼考和硫酸新霉素的抑殺效果次之。

表3 4種抗生素對3株殺鮭氣單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度Tab.3 MIC and MBC of 4 antibiotics against 3 strains of A.salmonicida μg/mL

整體而言，對于3株殺鮭氣單胞菌，鹽酸多西環(huán)素的最小抑菌濃度為0.5 μg/mL，最小殺菌濃度在2～4 μg/mL之間；恩諾沙星的最小抑菌濃度在0.25～1 μg/mL之間，最小殺菌濃度為4 μg/mL；氟苯尼考的最小抑菌濃度為1 μg/mL，最小殺菌濃度為8 μg/mL；硫酸新霉素最小抑菌濃度為4 μg/mL，最小殺菌濃度為8 μg/mL。

2.3 防耐藥突變濃度和耐藥突變選擇窗

鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、新霉素和氟苯尼考4種藥物對殺鮭氣單胞菌AS21的MPC和MSW的結(jié)果見表4。結(jié)果顯示鹽酸多西環(huán)素對殺鮭氣單胞菌AS21的耐藥突變范圍更狹窄，細菌不發(fā)生耐藥突變的濃度更低。

表4 4種抗生素對殺鮭氣單胞菌AS21的防耐藥突變濃度和耐藥突變選擇窗Tab.4 MPC and MSW of 4 antibiotics against A.salmonicida AS21 μg/mL

對于4種實驗藥物，綜合最小抑菌濃度、最小殺菌濃度和防耐藥突變濃度3個指標(biāo)，鹽酸多西環(huán)素最小抑菌濃度和最小殺菌濃度相對較低，防耐藥突變選擇窗更狹窄，鹽酸多西環(huán)素作為后續(xù)用藥為優(yōu)先考慮對象，并以此開展后續(xù)不同濃度給藥藥代動力學(xué)實驗。

2.4 殺鮭氣單胞菌對虹鱒的半致死濃度及病癥

虹鱒感染殺鮭氣單胞菌后，魚體發(fā)病癥狀如圖1。魚體表出現(xiàn)小癤瘡伴有出血，癤瘡下化膿潰爛，肌肉液化，剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有黃色積液，肝、腎和脾等內(nèi)臟器官腫大出血、肝臟發(fā)白等癥狀，符合虹鱒感染殺鮭氣單胞菌的常見癥狀。不同濃度菌株感染后96 h虹鱒死亡數(shù)據(jù)見表5。計算得出殺鮭氣單胞菌AS21對虹鱒的半數(shù)致死量(LD50)為1×104CFU/g。

圖1 虹鱒人工感染殺鮭氣單胞菌AS21的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of artificial infection with A.salmonicide AS21 in rainbow trout

表5 虹鱒人工感染不同濃度殺鮭氣單胞菌AS21 96 h后的死亡率Tab.5 Mortality after 96 hours of artificial infection with A.salmonicide AS21 in rainbow trout

2.5 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法驗證

4種組織中鹽酸多西環(huán)素的加標(biāo)回收率在78.88%～115.83%之間，日內(nèi)變異系數(shù)均小于6%，日間變異系數(shù)均小于7%，檢測方法具有較高的可靠性。按照信噪比S/N=3為檢測限(LOD)，S/N=10為定量限(LOQ)，此方法求得檢測限為5 μg/kg(血漿為5 μg/L)，定量限為10 μg/kg(血漿為10 μg/L)。鹽酸多西環(huán)素的峰面積為縱坐標(biāo)，以鹽酸多西環(huán)素基質(zhì)加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～2 000 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 4種劑量下鹽酸多西環(huán)素在染病虹鱒各組織中的藥時曲線與藥代動力學(xué)特征

4種給藥劑量下鹽酸多西環(huán)素在染病虹鱒不同組織中的藥物濃度與時間的關(guān)系見圖2。鹽酸多西環(huán)素主要分布在肝臟中，其次為腎臟。不同濃度鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒各組織內(nèi)藥物濃度隨時間變化的趨勢基本一致，呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，且隨著鹽酸多西環(huán)素濃度的增加，雙峰現(xiàn)象愈加明顯。

圖2 4種劑量下鹽酸多西環(huán)素在染病虹鱒4種組織內(nèi)的藥時曲線與MIC和MPC的關(guān)系圖Fig.2 Relationship between doxycycline hydrochloride and MIC and MPC in four tissues infected with rainbow trout at four doses

20 mg/kg鹽酸多西環(huán)素給藥后24 h內(nèi)，血漿和肌肉中不能達到體外藥效學(xué)中的MIC(0.5 μg/mL)和MPC(1 μg/mL)；腎臟中能維持在MIC濃度以上17 h，MPC濃度以上1 h；肝臟中能維持在MIC濃度以上23.5 h，MPC濃度以上23 h。

30 mg/kg鹽酸多西環(huán)素給藥后24 h內(nèi)，肌肉中不能達到體外藥效學(xué)中的MIC和MPC；血漿中能維持在MIC濃度以上2 h，不能達到MPC；腎臟中能維持在MIC濃度以上23.5 h，MPC濃度以上11.5 h；肝臟中能維持在MIC濃度和MPC濃度以上的時間均超過23.5 h。

40 mg/kg鹽酸多西環(huán)素給藥后24 h內(nèi)，肌肉中不能達到體外藥效學(xué)中的MIC和MPC；血漿中能維持在MIC濃度以上16 h，MPC濃度以上2 h；腎臟中能維持在MIC濃度以上23.5 h，MPC濃度以上17 h；肝臟中能維持在MIC濃度和MPC濃度以上的時間均超過23.5 h。

60 mg/kg鹽酸多西環(huán)素給藥后24 h內(nèi)，肌肉中能維持在MIC濃度以上18 h，不能達到MPC；血漿中能維持在MIC濃度以上23 h，MPC濃度以上6 h；腎臟和肝臟中能維持在MIC濃度和MPC濃度以上的時間均超過23.5 h。

4種給藥劑量下鹽酸多西環(huán)素在虹鱒血液中的藥代動力學(xué)參數(shù)見表6。血漿內(nèi)的鹽酸多西環(huán)素達峰濃度與給藥劑量成正比，且隨著給藥劑量增加，其達峰時間逐漸增加，從2 h(20 mg/kg)增加到4 h(30～60 mg/kg)，達峰濃度依次為0.49 、0.54、1.19和1.41 μg/mL。

表6 四種劑量下鹽酸多西環(huán)素在染病虹鱒血漿中的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.6 Pharmacokinetic parameters of doxycycline hydrochloride in plasma infected rainbow trout at four doses

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌的耐藥性

本研究結(jié)果表明，3株菌株對復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑和青霉素等5種水產(chǎn)養(yǎng)殖常用抗菌藥物耐藥，如果仍然沿用傳統(tǒng)用藥指南，恐難達到有效治病的目的。3株菌株對硫酸新霉素、恩諾沙星及鹽酸多西環(huán)素等17種藥物高度敏感，但AS19對哌拉西林高度敏感，而AS20和AS21僅呈現(xiàn)中度敏感；AS19對鏈霉素呈現(xiàn)中度敏感，而AS20和AS21則呈現(xiàn)高度敏感，不同年份3株菌對哌拉西林和鏈霉素表現(xiàn)出不同差異特征。有關(guān)云南省虹鱒源殺鮭氣單胞菌耐藥性研究與本結(jié)果基本一致，但在硫酸新霉素上，菌株耐藥[22]與本研究3株菌對硫酸新霉素均高度敏感不一致。硫酸新霉素是目前我國已批準(zhǔn)使用的12種抗生素之一，這種差異，可能與不同地區(qū)常用藥物種類不同，但更可能與地域差異相關(guān)。異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)源殺鮭氣單胞菌對硫酸新霉素中度敏感，對氟苯尼考耐藥[23]，但斑點叉尾源殺鮭氣單胞菌耐藥性與本研究結(jié)果一致[8]。這些不同品種、不同地區(qū)、不同年份研究的差異，充分說明了病原菌耐藥的復(fù)雜性，水產(chǎn)養(yǎng)殖中采用單一給藥方案全國通用，難以獲得較好效果。

防耐藥突變濃度(MPC)是一個防止耐藥的抗菌藥物濃度閾值，即防止細菌產(chǎn)生耐藥性的抑制細菌生長的藥物濃度，是評價抗菌藥物抑制細菌生長效應(yīng)的指標(biāo)，反映的是藥物抑制細菌發(fā)生耐藥突變的能力[24]?；疾C體內(nèi)的藥物濃度在MIC和MPC之間時，藥物可以抑制和殺滅大部分細菌，但同時耐藥細菌在此階段可能因藥物刺激發(fā)生第一次突變，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，此階段濃度范圍即為細菌耐藥突變選擇窗(MSW)[25]。依次理論，選擇MPC較低，MSW范圍較窄的藥物，可以最大程度避免耐藥性的產(chǎn)生。本研究鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考和硫酸新霉素藥效學(xué)結(jié)果表明，鹽酸多西環(huán)素的MPC相較于其他3種藥物最低，MSW范圍最窄，產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險更低；硫酸新霉素MPC相較于其他3種藥物最高，MSW范圍最寬，產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險更高。異育銀鯽源和云南省虹鱒源殺鮭氣單胞菌對硫酸新霉素分別呈現(xiàn)中度敏感和耐藥[8，23]，充分印證了本研究硫酸新霉素對殺鮭氣單胞菌耐藥選擇窗范圍較寬，更易產(chǎn)生耐藥性的結(jié)果。

殺鮭氣單胞菌引起病害主要源于殺鮭亞種(Almonicida)、殺日本鮭亞種(Msoucida)、無色亞種(Achromogenes)、史氏亞種(Smith)和溶果膠亞種(Pectinolytica)五種亞種[15]。殺鮭氣單胞菌是鮭鱒魚類主要病原菌，作為一種高致病力的條件致病菌，本研究進一步印證了不同地域、不同物種、不同養(yǎng)殖類型和不同用藥情況均會使殺鮭氣單胞菌耐藥性發(fā)生變化[26]。甚至分離自同種類不同養(yǎng)殖年份病原，其耐藥性也有差異。養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖品種，在未知耐藥性情況下，應(yīng)針對病原做好耐藥性基礎(chǔ)研究，依此針對性選擇抗菌藥物。

3.2 藥代動力學(xué)特征

藥代動力學(xué)研究中感染模型的建立至關(guān)重要。本研究通過人工回感實驗，建立虹鱒殺鮭氣單胞菌模型，復(fù)刻典型癥狀，并通過不同劑量鹽酸多西環(huán)素口灌給藥，探究虹鱒實際感染殺鮭氣單胞菌下鹽酸多西環(huán)素的藥代動力學(xué)特征。虹鱒各組織中鹽酸多西環(huán)素給藥劑量與達峰濃度成正比，且血漿中藥物濃度隨給藥劑量增加，其達峰時間逐漸增加，從2 h(20 mg/kg)增加到4 h(30～60 mg/kg)。肌肉中藥物達峰濃度在4種組織中最低，表明藥物較難達到肌肉組織。但隨著給藥濃度的增加，峰值濃度呈現(xiàn)正向增加，達峰時間可能因魚體患病在肌肉中的損傷程度不同而沒有很強的規(guī)律性。腎臟中達峰時間最短，肝臟中達峰濃度最高，其濃度遠高于其他3種組織，說明鹽酸多西環(huán)素可能通過肝臟進行代謝。不同濃度鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒各組織內(nèi)藥物濃度隨時間變化的趨勢基本一致，呈現(xiàn)“雙峰現(xiàn)象”，且隨著鹽酸多西環(huán)素濃度的增加，“雙峰現(xiàn)象”愈加明顯?？赡芘c肝腸循環(huán)、多部位吸收、藥物對胃腸的刺激等因素有關(guān)[27]。

本研究中，虹鱒血漿中鹽酸多西環(huán)素達峰濃度明顯低于同劑量下的健康異育銀鯽[22]和斑點叉尾[28]中的達峰濃度，達峰時間也有一定的延后。研究表明，疾病感染會使魚體生理、生化機能和器官功能狀態(tài)等均處于應(yīng)激和病態(tài)，導(dǎo)致其對藥物的吸收能力下降，上述差異，可能與本研究所用感染模型有關(guān)。另一方面，鹽酸多西環(huán)素代謝動力學(xué)過程可能與溫度呈正相關(guān)代謝，達峰時間、達峰濃度與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)[29]，本研究虹鱒為冷水性魚類，可能這種不同物種及養(yǎng)殖溫度的差異，也一定程度導(dǎo)致了差異的產(chǎn)生。黃聚杰[30]對鹽酸多西環(huán)素在花鱸(Lateolabraxmaculatus)體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究表明，20 mg/kg口灌鹽酸多西環(huán)素時，花鱸血漿、腎臟和肝臟中藥物濃度在3 h時同時達到峰值，肌肉中藥物濃度在9 h時達到峰值，且腎臟中的峰值濃度最高，4種組織內(nèi)的峰值濃度均大于本實驗中虹鱒體內(nèi)的峰值濃度，且沒有“雙峰現(xiàn)象”。上述現(xiàn)象與本研究及上述異育銀鯽、斑點叉尾等存在諸多差異，可能與海淡水養(yǎng)殖環(huán)境或魚類種屬差異相關(guān)，有待進一步研究確認。

3.3 給藥方案

鹽酸多西環(huán)素為時間依賴性藥物，當(dāng)T>MIC占給藥間隔時間的比例超過40%，同時實驗動物模型存活率在90%以上，藥物對細菌的抑殺才有良好效果[31-32]。藥物濃度在MPC濃度之上時，可以極大避免病原菌產(chǎn)生耐藥性。20、30、40和60 mg/kg鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒體內(nèi)的血藥濃度大于MIC的持續(xù)時間分別為0、2、16和23 h，血藥濃度大于MPC的持續(xù)時間分別為0、0、2和6 h；肌肉中的藥物濃度大于MIC的持續(xù)時間僅在口灌劑量60 mg/kg時能達到18 h，4種劑量均不能達到MPC濃度。20、30、40和60 mg/kg鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒腎臟中的藥物濃度大于MIC的持續(xù)時間分別為17、23.5、23.5和23.5 h，大于MPC的持續(xù)時間分別為1、11.5、17和23.5 h；肝臟中藥物濃度大于MIC和MPC的持續(xù)時間均在23 h以上?，F(xiàn)行中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SCT1132 -2016《漁藥使用規(guī)范》與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局2022年發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1號、2號》對鹽酸多西環(huán)素的建議使用劑量均為20 mg/kg，每日1次，連用3～5天。根據(jù)此研究結(jié)果，按此推薦使用劑量，恐不能滿足對患病虹鱒的治療作用。

綜合MIC和MPC與不同劑量鹽酸多西環(huán)素在血漿中的藥時曲線對比，單次口灌40 mg/kg劑量下，患病虹鱒中血藥濃度可以達到MIC并持續(xù)16 h以上，可以滿足虹鱒殺鮭氣單胞菌病治療需要。若綜合考慮不同劑量鹽酸多西環(huán)素在血漿、肌肉、腎臟和肝臟中的藥物濃度，單次口灌60 mg/kg劑量，在治療殺鮭氣單胞菌病達到較好效果的同時，可以維持在防耐藥突變濃度之上較長時間，防止殺鮭氣單胞菌產(chǎn)生耐藥性。

4 結(jié)論

(1)頭孢哌酮、硫酸新霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶、阿奇霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟、慶大霉素、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素和氟苯尼考共17種藥物對本研究3株殺鮭氣單胞菌高度敏感；3株殺鮭氣單胞菌對復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、青霉素、阿莫西林、頭孢唑林5種藥物耐藥。

(2)綜合最小抑菌濃度、最小殺菌濃度和防耐藥突變濃度3個指標(biāo)，鹽酸多西環(huán)素最小抑菌濃度和最小殺菌濃度相對較低，防耐藥突變選擇窗更狹窄，建議鹽酸多西環(huán)素為治療虹鱒殺鮭氣單胞菌的優(yōu)先選擇用藥。

(3)40 mg/kg劑量單次給藥，鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒血漿中的峰濃度為1.19 μg/mL，達峰時間為4 h，且血藥濃度維持在MIC以上16 h，可以滿足虹鱒殺鮭氣單胞菌病治療需要。

(4)60 mg/kg劑量單次給藥，鹽酸多西環(huán)素在患病虹鱒血漿、肌肉、腎臟和肝臟中的藥物濃度維持在MIC以上的時間分別為23、18、23.5和23.5 h，在血漿、肝臟和腎臟中的藥物濃度可以維持在MPC之上的時間分別為6、23.5和23.5 h，此使用劑量既能達到治療虹鱒殺鮭氣單胞菌病的作用，又能有效防止耐藥性的產(chǎn)生。