魚中氯芬新殘留檢測方法建立及食用安全性分析

王繼耀，程江峰

(1.青島科技大學(xué)，海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東青島266237)

氯芬新(lufenuron)是一種苯甲酰脲類殺蟲劑，適用于對擬除蟲菊酯和有機磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的害蟲的防治，也可用于魚類魚虱病的防治[1-3]。氯芬新是通過干擾新合成的角質(zhì)層中甲殼素的形成來擾亂生物關(guān)鍵發(fā)育階段的蛻皮過程致其死亡[4-5]，因而對甲殼類水生生物具有很大的危害性。隨著氯芬新在農(nóng)業(yè)方面的用量的逐年增加，其很容易通過循環(huán)廢水、農(nóng)業(yè)徑流等途徑進入水體環(huán)境，對水生生物造成危害，并在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈對消費者造成毒害作用[6]。為防止氯芬新殘留對消費者健康、水產(chǎn)行業(yè)發(fā)展及國際貿(mào)易造成不良影響，我國、美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟獸用藥品委員會等機構(gòu)制訂了許多針對氯芬新的國際公約、法規(guī)及限量標準。我國規(guī)定氯芬新在結(jié)球甘藍和蘋果中的最大殘留限量為1.00 mg/kg，在柑、橘和橙中的最大殘留量限量為0.50 mg/kg，在韭菜和番茄中的最大殘留限量為3.00 mg/kg[7]。歐盟獸用藥品委員會(EU)發(fā)布制定氯芬新在鮭科和鰭魚類中氯芬新的最大殘留限量值為1.35 mg/kg[8]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)也發(fā)布公告確定氯芬新在鮭中的最大殘留限量為1.35 mg/kg[9]。歐盟食品安全局(EFSA)在2020年規(guī)定氯芬新在牛的肌肉、脂肪、肝臟中的最大殘留限量為0.02 mg/kg，在果蔬為0.01～0.80 mg/kg[10]。

目前，氯芬新在歐盟是針對魚虱病的專用漁藥，在我國尚沒有批準使用，其在魚中的殘留多是由于違規(guī)使用和濫用造成的，并可通過食物鏈對消費者造成不良影響。 QuEChERS作為一種快捷、簡便、價格低廉同時可提供高質(zhì)量藥物殘留分析的前處理方法，已經(jīng)在藥物殘留檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11-14]。本研究以草魚為代表基質(zhì)，采用QuEChERS法對樣品進行前處理，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)，建立了魚中氯芬新殘留的檢測方法；同時采用建立的方法測試了采集自不同地區(qū)的13種128份魚類樣品；分別采用FDA和歐盟等制定鮭以及歐盟制定部分動物源性食品中的氯芬新最大殘留限量，結(jié)合風險熵值法進行安全性分析。本研究通過建立針對氯芬新的專一藥物殘留的方法，并利用該技術(shù)首次對我國13種魚類樣品中氯芬新殘留量進行了測試，并進行了風險評估，以期為我國水產(chǎn)品中氯芬新殘留狀況、潛在安全風險分析提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯芬新農(nóng)藥殘留檢測方法學(xué)研究所用草魚(Ctenopharyngodonidella)空白基質(zhì)樣品采自山東省青島市的水產(chǎn)品養(yǎng)殖基地。

128份魚類樣品分別采自北京、天津、江蘇、浙江和河北等省市的集貿(mào)市場或水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)，具體份數(shù)見表1。

乙腈、乙酸銨(均為色譜純，德國Merck公司)；氯化鈉、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)、十八烷基硅烷鍵合相(C18)(美國Agilent科技公司)；陶瓷均質(zhì)子(美國Agilent科技公司)；氯芬新標準溶液(lufenuron，1 mg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI)，美國Thermo Fisher公司)；Himac CR 22G高速離心機(日本Hitachi公司)；XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)大儀器廠)；分析天平(感量0.01 g，德國賽多利斯公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

1.3.1.1 樣品制備

草魚中可食部分參考GB/T 30891—2014《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》中取樣方法進行。取3尾草魚清洗后去頭、骨、內(nèi)臟，取肌肉魚皮等可食部分絞碎混合均質(zhì)。均質(zhì)后的樣品在-20 ℃冰箱中保存，使用時提前解凍。

1.3.1.2 提取方法

準確稱取勻質(zhì)樣品5.00 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入陶瓷均質(zhì)子，加入10 mL乙腈，渦旋5 min，加入4 g無水Na2SO4、1 g NaCl，以8 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL刻度離心管中。再加入10 mL乙腈，重復(fù)提取一次，合并兩次提取的上清液于50 mL刻度離心管中，再加乙腈定容至20 mL混勻。

1.3.1.3 凈化方法

吸取5 mL上清液于含有復(fù)合凈化材料(400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水MgSO4)的15 mL離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min 高速離心5 min，取上清液2 mL，以氮氣吹至近干，加乙腈1 mL，過0.22 μm濾膜至進樣瓶，待測。

1.3.2 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱XB-C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；流速：0.300 mL/min；進樣量：10 μL；梯度洗脫程序如表2所示。

表2 流動相及梯度洗脫條件Tab.2 Mobile phase and gradient elution conditions

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(SRM)，負離子模式；噴霧電壓3 000 V；離子源溫度350 ℃；鞘氣壓力35 Arb；輔助氣壓力5 Arb；氯芬新的定性離子對為m/z509.0/325.9，定量離子對為m/z509.0/338.9，碰撞能分別為27 eV和20 eV。

1.4 檢測方法參數(shù)測定

1.4.1 標準溶液的配制及標準工作曲線的建立

氯芬新標準品以乙腈配制濃度為1 mg/mL的標準溶液，并稀釋至標準工作液(1.0 μg/mL)，避光4 ℃貯存。分別在5 g空白樣品中，加入適量氯芬新標準溶液，按照樣品處理方法進行同樣操作。得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL的基質(zhì)添加匹配標準溶液，經(jīng)HPLC-MS/MS測定。以定量離子峰面積(y)為縱坐標、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標繪制標準工作曲線，得到氯芬新的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.2 回收率、精密度、檢出限的測定

用不含氯芬新的陰性草魚樣品進行空白加標回收率實驗，選擇1.0、2.0、5.0和50.0 μg/kg四個濃度水平的加標量。稱取5 g樣品根據(jù)選擇的不同加標量，加入一定量的標準品，按1.3節(jié)進行前處理后，用HPLC-MS/MS儀測定并計算加標回收率。以添加回收樣品信噪比大于3得方法檢出限(limit of detection，LOD)，使用基質(zhì)匹配標準曲線校準計算樣品濃度。

1.4.3 魚類樣品測試方法

待測魚類樣品按上述方法進行提取、凈化和濃縮處理，經(jīng)HPLC-MS/MS 測定，基質(zhì)匹配外標法定量。魚類樣品檢測結(jié)果計算如公式1：

(公式1)

式中：X為魚類樣品中氯芬新的含量/(μg/kg)；C為魚類樣品溶液中氯芬新的質(zhì)量濃度/(ng/mL)；V為試樣最后的定容體積/mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量/g。

1.4.4 風險評價方法

采用風險熵值法(RQ)對魚類中氯芬新殘留進行安全性分析，計算方法見公式2，國際通用安全閾值為RQ=1。我國目前尚未制定水產(chǎn)品中的氯芬新殘留限量標準，因此MRL分別參照歐盟規(guī)定鮭中氯芬新的最大殘留限量值1 350 μg/kg和歐盟在部分動物源性食品中規(guī)定的氯芬新最大殘留限量值20 μg/kg進行安全性評估。根據(jù)RQ 值大小將風險分為3 個等級：RQ>1 為高風險，1≥RQ>0.1 為中等風險，RQ≤0.1 為低風險[15]。

(公式2)

其中X為魚類樣品中氯芬新的含量/(μg/kg)，MRL為氯芬新最大殘留限量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件

2.1.1 提取方法

樣品中提取農(nóng)藥殘留常用的溶劑主要有乙腈、甲醇、二氯甲烷和丙酮等[15-16]。因為二氯甲烷毒性較大，易造成環(huán)境污染，丙酮提取會產(chǎn)生大量油脂，所以不選作水產(chǎn)樣品的提取劑。本研究以草魚為基質(zhì)分別考察了乙腈、1%甲酸乙腈的提取效率。實驗發(fā)現(xiàn)，乙腈和1%甲酸乙腈兩者均可以在實驗中得到良好的提取效果，按照簡便快速的原則，本實驗選擇乙腈進行提取。

2.1.2 凈化方法

凈化前后草魚的總離子流圖(total ion chromatogram，TIC)譜圖如圖1所示。對于草魚基質(zhì)，復(fù)合凈化材料凈化后的色譜圖中雜峰更少，響應(yīng)值增強，表明較多的PSA和C18填料能更好地去除魚肉中的干擾成分，減小基質(zhì)干擾。因此選擇復(fù)合凈化材料即400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水MgSO4用于前處理的凈化。

圖1 使用復(fù)合凈化材料凈化前(A)和凈化后(B)草魚的TIC譜圖Fig.1 TIC spectrum of grass carp before(A)and after(B)purification with composite purification material

2.2 檢測方法評價

2.2.1 氯芬新基質(zhì)匹配標準曲線

以定量離子峰面積(y)為縱坐標、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線，得到氯芬新的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。在0.5～100.0 ng/mL線性范圍內(nèi)，氯芬新的線性回歸方程為Y=20.030 3X-2.679 2，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.995。

2.2.2 檢出限

空白草魚中添加氯芬新濃度為1.0 μg/kg時，峰形信號明顯，信噪比(S/N)大于3，確定方法檢出限(LOD)為1.0 μg/kg，色譜圖如圖2所示。結(jié)果表明，氯芬新檢出限為1.0 μg/kg，靈敏度滿足檢測要求。

圖2 草魚樣品中氯芬新添加濃度為1.0 μg/kg時提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of grass carp samples at a concentration of 1.0 μg/kg of lufenuron addition

2.2.3 精密度和準確度

精密度和準確度結(jié)果如表3所示，氯芬新的平均回收率為79.16%～106.33%，相對標準偏差RSD(n=6)為1.63%～7.26%。此實驗方法滿足GB/T 27404-2008對回收率60%～120%、精密度<15%的要求，具有較好的回收率和重復(fù)性，可以用于魚肉中氯芬新殘留的測定。

表3 氯芬新在陰性樣品中的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviations of lufenuron in negative samples(n=6)

2.3 魚類中氯芬新殘留安全性分析

2.3.1 魚類中氯芬新殘留檢測結(jié)果

在鳙、鯉、鯽、鱘、虹鱒、鰱、鳊、鱖和大菱鲆中未檢出氯芬新殘留。在25份魚類樣品檢出氯芬新殘留，其中加州鱸、草魚、大黃魚和烏鱧中氯芬新殘留的檢出率分別為37.21%、29.41%、40.00%和16.67%，殘留含量值分別為1.38～343.02、1.37～58.43、1.05～33.19和1.49～1.87 μg/kg。

結(jié)果表明，在檢出的陽性魚類樣品中，鱸中的氯芬新殘留的檢測值和檢出數(shù)量均很高。造成鱸中氯芬新殘留檢測值較高的原因之一可能是存在氯芬新違規(guī)使用情況。有研究表明鱸會感染魚虱病和其他寄生蟲病[18]，為防止鱸大量死亡，在鱸養(yǎng)殖等水產(chǎn)養(yǎng)殖中會使用氯芬新殺死魚虱[1-3]。鱸中的氯芬新殘留的檢測值和檢出數(shù)量較高這一現(xiàn)象在我國已有科學(xué)研究中均未見報道，因此亟需引起高度重視，并進一步深入調(diào)查。

2.3.2 魚類中氯芬新殘留的安全性分析

計算得到不同魚類樣品中氯芬新殘留的RQ值見表4。采用FDA和歐盟鮭魚中氯芬新的最大殘留限量值1 350 μg/kg計算得到草魚、烏鱧和大黃魚為低風險，加州鱸中等風險；采用歐盟在部分動物源性食品中的最大殘留限量值20 μg/kg進行計算，得到僅烏鱧為低風險，草魚、大黃魚和加州鱸均為高風險，尤其是加州鱸RQ值是風險值的17倍之多，表明鱸中存在較嚴重的氯芬新殘留食用風險。

表4 不同品種魚中氯芬新殘留風險熵值Tab.4 Risk entropy values of lufenuron residues in different fish species

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS進行前處理法，基質(zhì)匹配外標法定量，建立了魚類中氯芬新殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。同時對13種128份魚類樣品進行檢測，在鳙、鯉、鯽、鱘、虹鱒、鰱、鳊、鱖和大菱鲆中均未檢出氯芬新殘留，表明這些品種的魚類存在氯芬新殘留食用風險很小。參照歐盟制定鮭中氯芬新殘留最大殘留限量值1 350 μg/kg計算，草魚、烏鱧和大黃魚為低風險，加州鱸為中等風險；參照歐盟動物源產(chǎn)品中最大殘留限量值20 μg/kg進行計算，烏鱧為低風險，草魚、大黃魚和加州鱸魚為高風險，尤其是加州鱸RQ值是風險值的17倍之多。表明在我國部分魚類養(yǎng)殖過程中可能存在較為嚴重的氯芬新違規(guī)使用現(xiàn)象，存在氯芬新污染的風險。