Na+、K+ 、溫度和pH對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

沈方方，武慧慧，張佳鑫，陳軍平，趙道全，2，孫文喜，2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)垣分院，河南長(zhǎng)垣453400；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，鄭州450000)

烏蘇里擬鲿(Pseudubagrusussuriensi)，俗稱(chēng)牛尾巴，隸屬于鲇形目(Silurformes)鲿科(Bagridae)擬鲿屬，在我國(guó)各大水系均有分布。其肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美，且無(wú)肌間刺，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的青睞。早期，擬鲿的野生資源十分豐富，僅次于同科的黃顙魚(yú)，但由于過(guò)度捕撈和生境破壞等因素，野生資源日益減少，目前，在自然水域中已很難收集到野生個(gè)體[1]。因此，加強(qiáng)烏蘇里擬鲿人工繁育及集約化養(yǎng)殖除了能滿(mǎn)足市場(chǎng)消費(fèi)需求外，對(duì)保護(hù)其野生種質(zhì)資源也具有重要意義。

魚(yú)類(lèi)精子活力與受精力密切相關(guān)，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)精子質(zhì)量最好的評(píng)價(jià)指標(biāo)，也是人工授精和精液保存的基礎(chǔ)[2]。研究表明，對(duì)烏蘇里擬鲿的研究工作從2001年開(kāi)始，多集中在人工繁育[3，4]、生物遺傳學(xué)[5，6]、養(yǎng)殖生物學(xué)[7，8]、飼料營(yíng)養(yǎng)學(xué)[9，10]等方面，關(guān)于精子活力方面的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。精子活力除了受親魚(yú)質(zhì)量、性腺發(fā)育程度等內(nèi)在因素影響外，還會(huì)受到滲透壓、pH、溫度、離子等環(huán)境因子的影響[11，12]。近年來(lái)，針對(duì)赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelusakaara)、擬赤梢魚(yú)(Pseudaspiusleptocephalus)、瓦氏雅羅魚(yú)(Amuride)、薩羅羅非魚(yú)(Sarotherodonmelanotheron)等多種魚(yú)類(lèi)開(kāi)展了精子活力的相關(guān)研究[13-16]，并篩選出精子激活介質(zhì)中適宜的離子濃度、溫度、pH等相關(guān)指標(biāo)，為其人工繁殖和資源保護(hù)提供了理論基礎(chǔ)。烏蘇里擬鲿的規(guī)模化繁殖仍依賴(lài)于人工授精，且其無(wú)法體外取精，只能通過(guò)殺魚(yú)取精的方式獲得精液，因此對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的要求極其重要。本研究對(duì)比分析了不同濃度Na+溶液、K+溶液、溫度和pH對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響，旨在為烏蘇里擬鲿人工繁殖提高受精率提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在繁殖季節(jié)(6月中旬)，自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)垣分院水產(chǎn)基地隨機(jī)選取6尾體格健壯、健康無(wú)傷、成熟度好的3齡烏蘇里擬鲿雄魚(yú)，體長(zhǎng)30～35 cm，體質(zhì)量0.5～1.2 kg。

1.2 方法

1.2.1 催產(chǎn)和精液采集

催產(chǎn)藥物為寧波生物制藥三廠生產(chǎn)的魚(yú)類(lèi)催產(chǎn)激素。在胸鰭基部，采用二次注射的方法：第一針催產(chǎn)藥劑量，促黃體釋放激素(LRH-A2)6 μg/kg魚(yú)體重、絨毛膜促性腺激素(HCG)500單位/kg魚(yú)體重；12 h后，注射第二針，促黃體釋放激素(LRH-A2)4 μg/kg魚(yú)體重、絨毛膜促性腺激素(HCG)300單位/kg魚(yú)體重；12 h后殺魚(yú)取精。采精前用毛巾擦干魚(yú)體，取精巢放在干凈的紗網(wǎng)上包住，將精液擠入干凈的離心管中，立即放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采集過(guò)程避免血、黏液等污染精液，避免沾水。

1.2.2 精子激活液的配置

不同離子濃度的激活液：用去離子水和氯化鈉(分析純)、氯化鉀(分析純)，配置不同濃度溶液，氯化鈉濃度為0、10、25、50、75、100 mmol/L，氯化鉀濃度為0、20、45、75、100、130 mmol/L 。

不同溫度的激活液：將去離子水、玻片放入燒杯后置于熱水浴鍋或冰水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度，溫度分別設(shè)為(4.0 ± 1.0)、(8.0 ± 1.0)、(10 ± 1.0)、(14.0 ± 1.0)、(18.0 ± 1.0)、(21.0 ± 1.0)、(24.0 ± 1.0)、(27.0 ± 1.0)、(30.0 ± 1.0)℃ 。

不同pH值的激活液：不同pH值溶液用0.1 mol/L的 NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl溶液與去離子水配置，pH值由梅特勒-托利多pH 計(jì)測(cè)定，共設(shè)置 8 個(gè)梯度pH，分別為4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

1.2.3 精子活力觀察

用解剖針蘸取微量精液于載玻片上，用5 mL注射器吸取適量的精子激活液滴加1滴至精液，并迅速用針頭將其攪勻，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，不加蓋玻片，于10×40倍光學(xué)顯微鏡(ZEISS)下觀察精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。參考多個(gè)文獻(xiàn)中對(duì)精子活力的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16-18]，結(jié)合烏蘇里擬鲿精子特性，采用快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(FT)和精子壽命(LT)兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，每個(gè)激活液重復(fù)6次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 spss 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-Way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na+ 對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

Na+濃度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響如表1所示。在Na+濃度為10～50 mmol/L的溶液中，隨著Na+濃度的增加，精子活力逐漸增強(qiáng)；Na+濃度為50 mmol/L時(shí)，精子活力最強(qiáng)，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(33.0 ± 5.7)s，壽命時(shí)間為(67.3 ± 10.4)s，激活時(shí)整體運(yùn)動(dòng)劇烈。Na+濃度為25 mmol/L時(shí)，壽命時(shí)間與50 mmol/L組無(wú)顯著差異外，顯著高于其他濃度組；Na+濃度增加到100 mmol/L時(shí)，精子活力下降明顯，顯著低于其他濃度組。適宜的Na+濃度可以延長(zhǎng)擬鲿精子活力壽命。

表1 烏蘇里擬鲿精子在不同濃度 Na+ 溶液中的活力Tab.1 Sperm viability of P.ussuriensi in different concentrations of Na+ solution

2.2 K+ 對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

K+濃度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響如表2所示。K+濃度為45 mmol/L時(shí)，精子活力最強(qiáng)，壽命時(shí)間為(68.2 ± 12.6)s，隨著濃度升高，壽命時(shí)間顯著下降，K+濃度為100 mmol/L或以上時(shí)，精子完全失活。適宜K+濃度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力存在激活作用。

表2 烏蘇里擬鲿精子在不同濃度 K+ 溶液中的活力Tab.2 Sperm viability of P.ussuriensi in different concentrations of K+ solution

2.3 溫度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

溫度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響如表3所示。當(dāng)溫度在4～21 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，烏蘇里擬鲿精子活力變化不明顯，當(dāng)溫度高于21 ℃時(shí)，精子活力降低，壽命時(shí)間縮短。表明烏蘇里擬鲿精子在4～21 ℃時(shí)活力較強(qiáng)，但整體差異不大。

表3 烏蘇里擬鲿精子在不同溫度下的活力Tab.3 Sperm viability of P.ussuriensi at different tmperature

2.4 pH對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

pH對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響如表4所示。pH為4～11時(shí)，隨著pH的升高精子活力先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)pH為8時(shí)，精子活力最強(qiáng)，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命時(shí)間分別為(31.5 ± 5.6)s、(65.3 ± 6.9)s，均顯著高于pH 4～5和pH 10～11時(shí)。結(jié)果表明，精子適宜pH值為7～8。

表4 烏蘇里擬鲿精子在不同pH下的活力Tab.4 Sperm viability of P.ussuriensi at different pH

3 討論

3.1 Na+ 、K+ 對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

滲透壓是精子維持活力的主要因素，其大部分能量消耗在滲透壓調(diào)節(jié)上。Na+、K+是組成魚(yú)類(lèi)精漿的重要物質(zhì)也是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的重要因素，可以通過(guò)選擇適宜的Na+、K+濃度來(lái)提高精子活力和延長(zhǎng)精子壽命時(shí)間[17，19]。研究表明淡水魚(yú)類(lèi)精子被激活的適宜Na+濃度范圍是50～120 mmol/L，如拉式鱥(Phoxinuslagowskii)[17]、翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)[20]、多線(xiàn)盤(pán)鮈(DiscogobiomultilineatusCui)[21]、齊口裂腹魚(yú)(Schizothoraxprenanti)[22]、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[23]、大口鲇(SilurusmeriordinalisChen)[24]等(表5所示)，在其N(xiāo)a+濃度最適條件下，精子被激活時(shí)活力最強(qiáng)。本研究表明，烏蘇里擬鲿精子的Na+最適濃度為50 mmol/L，與同屬鲇形目的黃顙魚(yú)和大口鲇接近，三者的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間也較接近。生存環(huán)境要求相近的魚(yú)類(lèi)，可能其精子對(duì)Na+濃度的適應(yīng)性較為接近，但關(guān)于其影響機(jī)制的報(bào)道較少，還需要進(jìn)一步研究。

表5 幾種淡水魚(yú)類(lèi)精子最適Na+ 、K+濃度Tab.5 The most appropriate concentration of Na+ and K+ for the sperm vitality of several fishes

K+濃度對(duì)魚(yú)類(lèi)精子活力的影響有很大差異(表5所示)，在鮭科和鯉科魚(yú)類(lèi)中研究較為深入，K+對(duì)鮭科魚(yú)類(lèi)精子活力存在一定的抑制作用，但對(duì)鯉科魚(yú)類(lèi)精子活力存在明顯的促進(jìn)作用[16，19，20]。MORISAWA等[25，26]、BAYNES等[27]研究表明，精液中較高濃度的K+是抑制鮭科魚(yú)類(lèi)精子活力的主要因素，當(dāng)精液排入淡水使K+濃度降低后，精子便被激活，如虹鱒(SalmongairdneriiRichardson)和大馬哈魚(yú)(Oncorhynchusketa)；在鯉科魚(yú)類(lèi)中，如拉氏鱥[17]、湖擬鯉(Rutilusrutiluslacustris)[19]、烏原鯉(Procyprismterus)[28]、大鱗鲃(Barbuscapito)[29]、彩鯽(Cruciancarp)[30]等，稀釋液中適宜的K+濃度能增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)精子的活力，延長(zhǎng)其壽命時(shí)間。本研究表明，K+促進(jìn)烏蘇里擬鲿精子活力的最適濃度為45 mmol/L，較高的K+濃度導(dǎo)致精子活力降低或失活，可能是由于滲透壓調(diào)節(jié)消耗的能量過(guò)多或滲透壓太大直接導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損而死亡，類(lèi)似于理科魚(yú)類(lèi)，而有別于鮭科魚(yú)類(lèi)。

3.2 溫度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

溫度是影響精子活力的主要環(huán)境因素之一，但具體機(jī)制尚不明確，魚(yú)類(lèi)精子的能量資源有限，溫度升高促進(jìn)精子活力的同時(shí)會(huì)降低精子壽命時(shí)間，與一般認(rèn)為的“高溫促進(jìn)精子活力，低溫抑制精子活力”的結(jié)論相符[31，32]。這種現(xiàn)象可能原因是溫度通過(guò)改變精子內(nèi)酶的活性及代謝水平進(jìn)而影響精子活力。多數(shù)魚(yú)類(lèi)精子活力隨著溫度的升高而增強(qiáng)，到達(dá)最適溫度后，隨著溫度的升高精子活力會(huì)顯著減弱，如北方須鰍(Barbatulabarbatulanuda)(最適溫度 5～20 ℃)[33]、圓斑星鰈(Veraspervariegatus)(最適8～12 ℃)[34]、拉氏鱥(最適20 ℃±1.0 ℃)[17]、點(diǎn)籃子魚(yú)(Siganusguttatus)(最適20～25 ℃)[35]、斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)(最適 25～31 ℃)[36]等。本研究結(jié)果表明，整體來(lái)看溫度對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響差異不顯著，可能其精子對(duì)溫度變化的耐受性較強(qiáng)，適應(yīng)范圍較廣。研究還發(fā)現(xiàn)，4 ℃時(shí)精子活力較高，壽命時(shí)間最長(zhǎng)，可能是低溫抑制了精子新陳代謝的速度，能量消耗速度減緩或低溫條件下，精子運(yùn)動(dòng)頻率降低，使壽命延長(zhǎng)[12，17，33]。因此，在人工授精過(guò)程中，低溫保存對(duì)維持精子活力和提高受精率具有重要作用。

3.3 pH對(duì)烏蘇里擬鲿精子活力的影響

大多數(shù)淡水魚(yú)類(lèi)精漿pH界于7.0～9.0，偏堿性，精子在中性或偏堿性的溶液中活力較強(qiáng)且受精率較高，酸性溶液會(huì)降低或抑制精子活力和受精率[37]。齊口裂腹魚(yú)[22]、瓦氏雅羅魚(yú)(Amuride)[15]在pH 7.0的條件下精子活力最強(qiáng)，拉氏鱥[17]、湖擬鯉[19]、多線(xiàn)盤(pán)鮈[21]、點(diǎn)籃子魚(yú)[35]精子活力的最適pH為8.0，而斜帶石斑魚(yú)精子活力最強(qiáng)時(shí)的pH 值為8.4[36]，虹鱒的精子活力和受精率在pH 9.0時(shí)達(dá)到最高[35]，大多數(shù)魚(yú)類(lèi)精子活力的適宜pH與精漿的pH范圍一致。本研究結(jié)果表明，烏蘇里擬鲿的適宜pH為7～8，在pH 8.0時(shí)精子活力最強(qiáng)且壽命時(shí)間最長(zhǎng)。表明烏蘇里擬鲿在人工授精時(shí)，選擇偏堿性的水環(huán)境較為合適。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，烏蘇里擬鲿精子活力的適宜Na+濃度為25～75 mmol/L，最適為50 mmol/L，K+最適濃度為45 mmol/L，在配置精子保存液和稀釋液時(shí)可供參考。建議在開(kāi)展人工繁殖的過(guò)程中，精液在4 ℃保存，受精水環(huán)境在21 ℃左右，pH在7～8。