斑馬魚chac1基因的表達特征及其在髓系造血中的功能研究

陳紫涵，周 靜，王德成，晏 博

(1.三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，三峽大學感染與炎癥損傷研究所，三峽大學基礎醫(yī)學院，湖北宜昌 443002；2.上海市(復旦附屬)公共衛(wèi)生臨床中心結核病研究中心，上海 201508)

谷胱甘肽是一種含硫醇的三肽，在真核生物中主要以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的形式存在，其中GSH是真核生物維持和調節(jié)組織氧化還原穩(wěn)態(tài)所必需的[1，2]。近年來越來越多的研究聚焦于GSH降解途徑[3，4]，以探討GSH穩(wěn)態(tài)對細胞功能的影響。γ-谷氨酰環(huán)轉移酶(γ-glutamyl cyclotransferase，γ-GCT，GGCT)是調節(jié)抗氧化劑GSH代謝的γ-谷氨酰循環(huán)的主要酶之一，其可以催化γ-谷氨酰肽氨基酸分解為5-氧代脯氨酸和游離氨基酸，同時也可以作為GSH限速酶，與γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)作用從而調節(jié)GSH的合成[5]。近年來，還發(fā)現了一些新的能降解GSH的酶，2009年在哺乳動物細胞中發(fā)現了一種定位于胞質中的新型促凋亡蛋白CHAC1/MGC4504，參與內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER)的未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)，位于ATF4-ATF3-CHOP級聯通路的下游[6]，隨后chac1被證實屬于γ-GCT家族，有與γ-GCT家族成員類似的BtrG/γ-GCT折疊，作為一種新型特異性降解GSH的酶，在促凋亡信號傳導和氧化還原生物學中發(fā)揮著重要作用[7，8]。

隨著研究的逐漸深入，發(fā)現chac1的表達水平與多種疾病密切相關。chac1基因作為鐵死亡標志物和促凋亡誘導因子[9]，在炎癥、神經系統(tǒng)氧化應激、動脈病變、實體腫瘤、白血病等疾病的發(fā)生或發(fā)展中發(fā)揮作用[10-16]。有趣的是，近期一項有關凋亡中性粒細胞的代謝組學研究提示，GSH代謝是凋亡中性粒細胞中最易受干擾的代謝途徑之一，chac1作為GSH降解酶，在凋亡的中性粒細胞中表達增加[17]。在肺部炎癥疾病中，轉錄組學研究提示chac1可能參與誘導肺泡巨噬細胞(AM)的凋亡，從而加速炎癥的消退[18]。這些研究提示了chac1可能與先天免疫細胞的發(fā)育及功能相關，但具體機制還不清楚。為進一步探索基于代謝和轉錄組的先天性免疫細胞功能提供了思路。

有研究顯示，在生物早期發(fā)育時注射嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino antisense oligo，MO)下調斑馬魚(Daniorerio)chac1的表達[19]，發(fā)現chac1敲除胚胎致死率較高，提示chac1可能在斑馬魚早期發(fā)育中所必需，但其在斑馬魚胚胎和組織中的表達特征及在早期造血發(fā)育中扮演的角色仍不明確。本研究運用CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚chac1基因，并通過蘇丹黑B染色、qRT-PCR檢測髓系造血發(fā)育過程中關鍵轉錄因子的表達情況，以期了解chac1基因在早期造血發(fā)育過程中可能的作用，從而為相關疾病治療提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RNAiso Plus購自Takara(9109)，HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(R323-01)，Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix購自翌圣生物科技股份有限公司(11184ES25)，Cas9 Nuclease購自近岸蛋白質科技有限公司(E365-01A)，RNase-free water購自武漢塞維爾生物技術有限公司(G4700-500ML)，蘇丹黑染料購自BBI LIFE SCIENCES(4197-25-5)，三卡因(E10521-10G)、PTU(P7629-10G)購自Alorich，PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，sgRNA購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

顯微注射儀PCO-1500(上海玉研科學儀器有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9032(Blue Pard)，凝膠成像系統(tǒng)Tanon-3500(上海天能科技有限公司)，生物顯微鏡ECLIPSE Ci(Nikon)，離心機5424R(Eppendorf)，實時熒光定量PCR儀CFX96TM Real-Time System(BIO RAD)，Nanodrop 2000核酸濃度檢測儀(Thermo Fisher)，盤旋式混合器KB-3-D(其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 斑馬魚品系及養(yǎng)殖條件

本實驗所用野生型AB斑馬魚成魚或胚胎均由本課題組繁育，專人飼養(yǎng)于(28.5±0.5)℃恒溫自動循環(huán)水系統(tǒng)中，以光照養(yǎng)殖14 h后黑暗養(yǎng)殖10 h作為斑馬魚的光照周期，養(yǎng)殖環(huán)境為pH 7.0～8.0，鹽度0.25‰～0.50‰，電導率500～800 μS/cm。用于顯微注射的胚胎由雌魚和雄魚按照1 ∶1的比例放置于產卵缸中，用擋板分隔開，次日取單細胞時期受精卵進行顯微注射操作后移入胚胎培養(yǎng)液(MgSO4·7H2O 0.163 g/L，KCl 0.03 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.04 g/L)中置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 序列和生物信息學分析

從Ensemble網站(http：//asia.ensembl.org/index.html)獲取人、小鼠、斑馬魚的Chac1蛋白氨基酸序列，使用CLC Sequence Viewer 8軟件進行氨基酸序列比對，使用NCBI數據庫中CD-Search工具查找基因家族保守結構域并做出標識。使用NCBI數據庫HomoloGene板塊成對比較智人與不同物種(黑猩猩、恒河猴、家牛、大鼠、小鼠、非洲爪蟾、斑馬魚)之間氨基酸和核苷酸序列的一致性和相似性。

用MEGA 11軟件的Clustal W方法進行蛋白質氨基酸序列比對[20]，NJ法(Neighbor-Joining Algorithm)構建系統(tǒng)進化樹[21]。

1.4 基因表達分析

組織的基因表達譜分析：選擇3尾3個月以上的成年斑馬魚并分離出不同組織，斑馬魚在收集組織前禁食1天。斑馬魚死亡后解剖，取出心、鰾、腸道、卵巢、精巢、肌肉、肝臟、腎臟、眼睛、脾臟、腦，分別浸泡于1 mL RNAiso Plus中并用TRizol法提取總RNA。

胚胎期的基因表達譜分析：根據斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段，收集野生型斑馬魚0、0.5、1、3、5、10、12、24、48、72、96、120 hpf共12個時相的胚胎樣本，每個時期隨機收集30個受精卵用于總RNA的提取。

TRizol法提取不同樣本的總RNA后測定其濃度和純度。通過HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)對1 μg總RNA逆轉錄成第一鏈cDNA，反應體系為20 μL，反應程序為42 ℃，2 min；37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。逆轉錄后的cDNA稀釋5倍作為實時熒光定量PCR的模版，并置于-20 ℃長期保存。

1.5 斑馬魚chac1基因的敲除和鑒定

在NCBI gene數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中找到目的基因序列，利用在線設計網站CRISPRscan(https：//www.crisprscan.org/？page=gene)選擇得分最高的3條sgRNA序列。在金斯瑞生物科技公司合成sgRNA。將3條sgRNA與Cas9蛋白按1∶1體積混勻后，注射到單細胞時期野生型斑馬魚胚胎中，同批次等體積注射3條混合scramble sgRNA與Cas9的混合物作為對照[22]，chac1 sgRNA和scramble sgRNA靶序列見表1。收集1 dpf的突變組和對照組胚胎，50 mmol/L NaOH和1 mol/L Tris-HCl提取基因組DNA，用PCR擴增引物進行PCR反應，對擴增產物sanger測序以進行突變效率檢測。PCR擴增引物序列見表2。同時，收集1、3、5、7 dpf的突變組和對照組的存活胚胎或幼魚各20枚，TRizol法提取總RNA后逆轉為第一鏈cDNA，qRT-PCR定量突變斑馬魚chac1的3個靶位點的轉錄本活性，qRT-PCR引物序列見表3。

表1 chac1 sgRNA和scramble sgRNA靶序列Tab.1 chac1 sgRNA and scramble sgRNA target sequences

表2 PCR擴增引物序列Tab.2 List of primers for PCR amplification

表3 qRT-PCR引物序列Tab.3 List of primers for qRT-PCR

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

以ef1a為內參，利用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix在Real-Time PCR上進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，反應體系為10 μL：mix 5 μL，H2O 3.6 μL，Primer F 0.2 μL，Primer R 0.2 μL，cDNA 1 μL；反應條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)；65 ℃，5 s，95 ℃。引物序列見表3。用2△△Ct法處理實驗數據得出基因的相對表達量。統(tǒng)計結果為三次獨立重復實驗。

1.7 蘇丹黑染色

收取3 dpf的野生型和chac1突變型斑馬魚幼魚，放入1 mL 4%的多聚甲醛固定液中4 ℃過夜固定。第二天移除固定液并用1 mL PBST洗3次，加入500 μL蘇丹黑常溫染色30 min。70%乙醇洗凈后，用PBST搖洗3次×5 min。最后加入1 mL 70%甘油，置于-20 ℃保存。

1.8 統(tǒng)計學處理

所有相關實驗至少獨立重復3次，使用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數據都顯示為平均值±SEM。用T-test方法進行差異顯著性分析，對于所有比對結果，P>0.05表示無顯著性差異；0.01

2 結果

2.1 斑馬魚Chac1蛋白的序列特征

從Ensemble網站獲取斑馬魚chac1基因序列，其CDS長度為591 bp，編碼由197個氨基酸組成的蛋白質。將斑馬魚Chac1與其他11個不同物種的CHAC1進行多序列比對，并用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示(圖1A)，斑馬魚Chac1的進化分枝與哺乳動物分開，且與大多數物種保持了高度的進化關系，尤其與斑點叉尾的親緣關系最近，其次是塞內加爾多鰭魚和青鳉。利用CLC Sequence Viewer 8軟件對人、小鼠和斑馬魚chac1進行氨基酸序列比對，發(fā)現ChaC樣結構域作為專門降解谷胱甘肽的結構域在不同物種中高度保守(圖1B)。利用NCBI數據庫HomoloGene板塊將人與不同物種chac1的氨基酸和核苷酸進行比對，發(fā)現斑馬魚與人的氨基酸一致性為60.6%，基因相似性為63.4%(表4)。

2.2 chac1基因在斑馬魚胚胎和成魚不同組織中的表達特征

為了確定chac1基因在斑馬魚發(fā)育過程中的表達模式，我們檢查了斑馬魚不同發(fā)育階段的胚胎和成魚不同組織chac1 mRNA的表達量。結果顯示chac1從斑馬魚胚胎的合子期到囊胚期中均為高表達(圖2A)，提示斑馬魚chac1是母源基因。chac1基因在斑馬魚成魚不同組織(心、魚鰾、腸道、卵巢、精巢、肌肉、肝臟、腎臟、眼睛、脾臟、腦)中都有表達，但其表達水平在肌肉、卵巢、腦中明顯較高(圖2B)，提示chac1在這些組織中參與重要功能，可能導致不同類型的疾病。

圖2 chac1基因在斑馬魚中的表達特征Fig.2 Expression characteristics of chac1 gene in D.rerioA：chac1在斑馬魚胚胎發(fā)育不同階段的表達譜(以12hpf為對照組)；B：chac1在成年斑馬魚不同組織中的表達譜(以心臟組織為對照組)。“*”表示0.010.05)。下圖同

2.3 CRISPR/Cas9構建chac1基因突變斑馬魚

我們通過CRIPSR/Cas9基因編輯工具構建chac1基因突變斑馬魚模型，設計了3條具有不同靶位點的sgRNA(圖3A)，與Cas9混合后共注射到野生型斑馬魚單細胞時期胚胎中以構建chac1的突變體(圖3C)。1天后對突變組胚胎的PCR產物進行一代測序檢測其突變效率，發(fā)現PCR產物在PAM序列之后出現亂峰(圖3B)，說明Cas9對靶序列的切割導致斑馬魚chac1在基因水平上發(fā)生錯亂，導致轉錄提前出現終止密碼子，進而使基因沉默。3條sgRNA都能高效誘導靶位點發(fā)生突變，3條sgRNA聯合注射導致的突變效率為100%(表5)。同時，利用qRT-PCR技術分析突變斑馬魚chac1 3個靶位點的轉錄本活性，結果顯示突變品系中chac1的mRNA水平在顯微注射后1、3、5、7天均存在不同程度的下降(圖3D)。chac1基因敲除斑馬魚模型構建成功。

圖3 利用CRISPR/Cas9技術構建斑馬魚chac1突變體Fig.3 Targeting strategy for generating D.rerio chac1 crispant by CRISPR/Cas9A：chac1基因結構與位點突變示意圖；B：基因敲除斑馬魚胚胎PCR產物一代測序峰圖，圖中紅色方框為PAM區(qū)域；C：斑馬魚顯微注射示意圖；D：qRT-PCR檢測野生型及敲除品系的斑馬魚不同靶位點chac1的mRNA水平(每個樣本為3次生物學獨立重復收集，每次每組25尾幼魚)

表5 不同靶位點的sgRNA突變效率Tab.5 sgRNA mutation efficiency at different target sites

2.4 chac1突變促進斑馬魚中性粒細胞的生成

通過蘇丹黑B染色觀察發(fā)現3 dpfchac1突變斑馬魚較野生型斑馬魚的蘇丹黑B染色陽性信號明顯增多(圖4A)。進一步利用qRT-PCR檢測了斑馬魚粒細胞標志物mpo、lyz的mRNA表達量均升高(圖4B)。以上結果表明斑馬魚中性粒細胞的早期發(fā)育與chac1基因有關。

圖4 斑馬魚chac1基因突變表型分析Fig.4 Phenotype analysis of chac1 gene mutation in D.rerio larvagesA：(左)用于中性粒細胞量化的代表性圖片，紅色箭頭所指為中性粒細胞，(右)斑馬魚幼魚全身中性粒細胞數量統(tǒng)計(n=20)；B：斑馬魚中性粒細胞標志物mRNA的水平變化(n=20)

2.5 斑馬魚chac1缺失影響髓系造血基因表達

為了解釋chac1敲除后早期中性粒細胞增多的現象，我們進一步檢測了chac1敲除后pu.1、cebpa、cebp1等髓系造血發(fā)育相關轉錄調控因子的mRNA表達變化，并發(fā)現pu.1在chac1突變體中表達明顯上調(圖5)。該結果提示斑馬魚chac1可能通過調節(jié)髓系造血相關轉錄因子的表達進而調控骨髓祖細胞向中性粒細胞的分化過程。

圖5 造血相關轉錄因子pu.1、cebpa、cebp1的mRNA水平變化Fig.5 Changes in mRNA levels of hematopoietic transcription factors such as pu.1，cebpa，and cebp1

3 討論

chac1作為UPR下游的促凋亡因子，是GSH分解代謝通路中的重要基因，在凋亡信號轉導、氧化還原、鐵死亡等多種生物學反應中發(fā)揮著重要作用。目前現有研究中，因為chac1敲除胚胎致死率較高，所以仍缺少chac1敲除模型以深入研究chac1的生理病理功能。CRISPR/Cas9作為一種強大的基因編輯工具[23，24]，可對基因組DNA進行修飾，在建立人類疾病模型[25]和個性化治療人類疾病中起重要作用[26]。本研究利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術，探討了斑馬魚chac1基因的表達特征及其在髓系造血中的功能，發(fā)現斑馬魚chac1基因可能通過調節(jié)髓系造血相關轉錄因子從而影響斑馬魚中性粒細胞的形成。這將有助于深入了解chac1基因在斑馬魚早期造血中可能發(fā)揮的作用，同時為分析相關疾病的發(fā)病機制及尋找潛在治療策略提供思路。

生物信息學分析發(fā)現斑馬魚chac1的ChaC樣結構域作為專門降解GSH的結構域，在不同物種中高度保守，表明CHAC1降解GSH的功能在生物進化過程中非常重要，可能具有重要功能。同時chac1在發(fā)育過程中也具有獨特的表達模式，我們的結果首次證明chac1是母源表達基因，同時，chac1在斑馬魚卵巢及腦組織中均高表達，這與chac1在小鼠中的表型相吻合[27]，但與小鼠不同，chac1在斑馬魚的心臟、肝臟、心臟等組織中表達較低，這有可能是因為在個體基因水平上，同一基因的發(fā)育軌跡在不同物種中進展不同，chac1有可能是發(fā)育動態(tài)基因，其編碼的蛋白質在表達上呈現出時間差異有關[28，29]。

相關研究表明斑馬魚骨髓細胞分為粒細胞和單核/巨噬細胞兩個亞類，他們與炎癥、腫瘤、感染等疾病有關[30-32]。為了深入了解chac1在斑馬魚骨髓細胞早期造血中的生理功能，我們分析了突變斑馬魚基因靶位點的轉錄本活性以進行突變效率的驗證[33]，成功構建了chac1 crispant斑馬魚。對斑馬魚進行蘇丹黑染色，使成熟中性粒細胞染色[34]，發(fā)現3dpf的chac1 crispant斑馬魚全身蘇丹黑陽性信號較對照組更多。提示在定向造血階段，斑馬魚中性粒細胞發(fā)育與chac1有關。有研究表明，骨髓細胞的成熟是由多種組織特異性轉錄因子決定的，骨髓祖細胞需要這些轉錄因子來促進他們的成熟和分化[35]。PU.1是骨髓祖細胞(CMP)進一步分化發(fā)展的重要轉錄因子，其缺失會導致小鼠髓系和淋巴系細胞出現發(fā)育缺陷[36]。CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)家族成員的轉錄因子C/EBPα和C/EBPε在髓系形成中起重要作用[37，38]。因此，造血轉錄因子的表達差異在正常造血調控中十分重要，我們發(fā)現在定向造血階段，chac1 crispant的pu.1水平上調，與我們SB染色的結果相符。同時，CHAC1是一種促凋亡因子，中性粒細胞的凋亡可能與CHAC1消耗GSH有關，敲除CHAC1可能會影響中性粒細胞的凋亡。值得注意的是，C/EBPα和C/EBPε的斑馬魚同源物cebpa、cebp1這兩種與中性粒細胞發(fā)育成熟有關的轉錄因子[39]，在本研究中其表達量并沒有改變，這有可能是因為我們在這里測定的是3dpf斑馬魚整體的基因表達變化趨勢，包括免疫細胞和非免疫細胞，其具體的作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，本研究對斑馬魚chac1的序列表征進行了生物信息學分析，分析了chac1在發(fā)育過程中表達模式。同時利用CRISPR/Cas9定向基因編輯技術敲除了斑馬魚chac1基因后，發(fā)現chac1基因突變斑馬魚可能通過調節(jié)髓系造血相關轉錄因子pu.1進而影響斑馬魚中性粒細胞的形成。在接下來的研究中，我們將運用chac1基因突變斑馬魚模型進一步研究chac1在造血及免疫中的生理病理功能，以深入了解chac1在相關疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。