積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移與侵襲的抑制作用

陳 曦，朱 玲，李 靖，許國瑩，葉耘峰

（江蘇護理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，它對人類健康構(gòu)成嚴重威脅，在所有惡性腫瘤中的死亡率排名第四。結(jié)直腸癌在治療效果和預(yù)后方面存在高度異質(zhì)性，即使是病理類型和臨床分期相同，其療效和預(yù)后也可能存在顯著差異［1］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT） 是一類生物調(diào)控過程，是正常發(fā)育中所必需的。但EMT 也在纖維化的發(fā)生等多種病理條件下發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包含改變細胞結(jié)構(gòu)，促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和增殖等［2］。腫瘤的侵襲與遷移是導(dǎo)致腫瘤患者出現(xiàn)不良預(yù)后的主要原因之一，是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征。越來越多的研究證明EMT 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

積雪草酸是一種已知的三萜類物質(zhì)，具有抗炎、降低血糖血脂、神經(jīng)保護、抗抑郁等多種重要的生物活性［3］。目前已有研究報道積雪草酸對舌癌、乳腺癌等的惡性腫瘤具有良好的體外抑制作用［4-5］，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸能夠增強結(jié)腸癌HCT116 細胞對臨床常規(guī)化療藥物奧沙利鉑的敏感性。本研究以結(jié)腸癌HCT116、SW480 細胞為研究對象，探討積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響，并基于Wnt/β-catenin 信號通路初步探討其作用機制，為積雪草酸用于結(jié)腸癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 人結(jié)腸癌HCT116 與SW480 細胞購自美國ATCC 細胞庫，用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、相對濕度95%的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 積雪草酸（批號JXCS20200603） 購自南京春秋生物工程有限公司； 胎牛血清 （ 貨號SH30084.02）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（貨號SH30809.01B） 購自美國HyClone 公司； CCK-8 試劑（貨號CA1210） 購自北京索萊寶科技有限公司； 二甲基亞砜 （DMSO，貨號276855）、Wnt/β-catenin 信號通路激動劑 LiCl （貨號L9650） 購自美國Sigma 公司； Giemsa 染液（貨號C0133）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； Transwell 小室（貨號3422a） 購自美國Corning 公司； Matrigel 基質(zhì)膠 （貨號356234） 購自美國BD 公司； SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（貨號BL502B）、4% 多聚甲醛（貨號BL539A） 購自合肥白鯊生物科技有限公司； NC 膜（貨號HF13502S25） 購自美國Millipore 公司； 波形蛋白（Vimentin，貨號5741T）、β-連環(huán)蛋白 （β-catenin，貨號 8480T）、c-myc （貨號18583S）、細胞周期蛋白1 （cyclin D1，貨號55506T）、存活蛋白（survivin，貨號2808T）、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（批號32935S） 購自美國Cell Signaling Technology 公司；肌動蛋白抗體（β-actin，貨號BS6007M） 抗體購自美國Bioworld 公司； 神經(jīng)性鈣粘附蛋白 （N-Cadherin，貨號A19083）、Snail （貨號A5243）、上皮性鈣粘附蛋白 （ECadherin，貨號A3044）、基質(zhì)金屬蛋白酶2 （MMP2，貨號A11144）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （MMP9，貨號A0289） 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器 TS100 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）； 細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）； MINI-4 小型垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司）； iMark酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 精密稱取積雪草酸適量溶于無菌DMSO中，配制成積雪草酸溶液（母液20 mmol/L，-20 ℃保存），給藥時以培養(yǎng)基稀釋至實驗所需劑量； 精密稱量LiCl溶于無菌培養(yǎng)基中，給藥劑量為20 mmol/L。

2.2 CCK-8 法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期細胞，每孔5 000 個接種于96 孔板，約70% ～80% 細胞貼壁后加入含0.1%DMSO （對照組） 及10、20、30、40、50、60 μmol/L積雪草酸溶液的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清） 分別處理24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育2 h，于450 nm 波長處檢測光密度（OD）值，計算細胞存活率。

2.3 細胞形態(tài)觀察 收集對數(shù)生長期細胞均勻接種于6 孔板中，貼壁后設(shè)置積雪草酸低、中、高劑量組（10、20、30 μmol/L），另設(shè)置對照組給予含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 收集對數(shù)生長期細胞均勻接種于6 孔板中，按“2.3” 項下方法進行分組給藥。使用無菌槍頭垂直劃線，PBS 洗滌2 次后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于0、48 h 觀察并拍照，計算細胞劃痕愈合率，公式為細胞劃痕愈合率＝ ［（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積） /0 h劃痕面積］ ×100%。

2.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移、侵襲能力 收集對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化后使用無FBS 培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后接種于小室上層，每孔200 μL （細胞密度為2.5×105/mL），小室下層加入600 μL 含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，按“2.3” 項下方法進行分組給藥。48 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3次，Giemsa 染液染色30 min，PBS 洗滌3 次，擦去小室上層細胞。隨機選擇3 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。侵襲實驗則用無血清培養(yǎng)基按1 ∶10 比例稀釋Matrigel 膠，并將其均勻平鋪在Transwell 小室上層（每孔50 μL），培養(yǎng)箱水化2 h后，其余步驟同遷移實驗。

2.6 Western blot 法檢測細胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達 收集對數(shù)生長期細胞，均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞融合率達70% ～80% 后，按“2.3” 項下方法進行分組給藥，作用24 h 后，收集各組細胞，提取總蛋白。使用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉30 min，TBST 洗膜3 次，每次5 min，一抗（1 ∶1 000） 4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜3次，每次5 min，二抗（1 ∶10 000） 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次5 min，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J 軟件分析蛋白灰度值，β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達。

2.7 Wnt/β-cantenin 通路在積雪草酸調(diào)控結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲中的作用 收集對數(shù)生長期HCT116 細胞，均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對照組（0.1% DMSO）、積雪草酸組（20 μmol/L）、積雪草酸+LiCl 組（積雪草酸20 μmol/L，LiCl 20 mmol/L），Transwell 遷移、侵襲實驗步驟同“2.5” 項，Western blot 實驗步驟同“2.6” 項。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞存活率的影響 與對照組比較，給藥劑量高于20 μmol/L 時，積雪草酸對HCT116、SW480 細胞的增殖均具有抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），且隨著給藥劑量的增加，增殖抑制效果增強。積雪草酸處理HCT116 與SW480 細胞24 h 后的IC50值分別為45.34、34.97 μmol/L，故選擇10、20、30 μmol/L 劑量進行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞存活率的影響（±s，n＝3）

3.2 積雪草酸對SW480 和HCT116 細胞形態(tài)的影響 對照組SW480、HCT116 細胞呈梭形，細胞觸角明顯； 積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細胞隨著藥物劑量逐漸增加，部分細胞觸角變短，形狀逐漸規(guī)則，細胞失去間質(zhì)型細胞形態(tài)特征，呈現(xiàn)上皮型細胞形態(tài)特征，見圖2。提示積雪草酸對SW480 和HCT116 細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程產(chǎn)生抑制作用。

圖2 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞形態(tài)的影響（×100）

3.3 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞遷移能力的影響與對照組比較，積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細胞劃痕愈合率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖3。與對照組比較，積雪草酸各劑量組SW480 與HCT116 細胞遷移率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖4。提示積雪草酸能夠有效抑制SW480、HCT116 細胞的遷移。

圖3 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞劃痕愈合能力的影響（×40，±s，n＝3）

圖4 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞遷移能力的影響（×100，±s，n＝3）

3.4 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞侵襲能力的影響與對照組比較，積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細胞侵襲率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖5。提示積雪草酸能降低SW480 和HCT116 細胞侵襲能力。

圖5 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞侵襲能力的影響（×100，±s，n＝3）

3.5 積雪草酸對 HCT116 細胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達的影響 根據(jù)細胞劃痕與Transwell 遷移及侵襲實驗結(jié)果，積雪草酸對HCT116 細胞的體外轉(zhuǎn)移抑制效率較高，故選擇其進行蛋白表達驗證。與對照組比較，積雪草酸各劑量組HCT116 細胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達降低 （P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin 蛋白表達升高（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖6。

圖6 積雪草酸對HCT116 細胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.6 積雪草酸對HCT116 細胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達的影響 與對照組比較，積雪草酸各劑量組HCT116 細胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖7。

圖7 積雪草酸對HCT116 細胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.7 Wnt/β-cantenin 通路在積雪草酸調(diào)控結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲中的作用 與積雪草酸組比較，LiCl+積雪草酸組HCT116 細胞遷移、侵襲率升高（P＜0.05，P＜0.01），Ncadherin、β-catenin 蛋白表達升高 （P＜0.01），E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.01），見圖8。提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路激動劑LiCl 處理可逆轉(zhuǎn)積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移與侵襲的抑制作用。

圖8 LiCl 逆轉(zhuǎn)積雪草酸對HCT116 細胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響（×100，±s，n＝3）

4 討論

結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率較高的臨床惡性腫瘤，預(yù)計到2030 年全球負擔(dān)將增加60%［6］。伴有遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的5 年生存率較低，50%的轉(zhuǎn)移患者會在5 年內(nèi)復(fù)發(fā)并死亡［7-8］，并且?guī)缀跛械慕Y(jié)直腸癌患者都會產(chǎn)生化療藥物的耐藥性，限制其療效，最終導(dǎo)致治療失?。?-10］。因此，為改善結(jié)直腸癌患者的臨床治療效果及提升預(yù)后，開發(fā)安全有效的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床新藥物勢在必行，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化已被報道為上皮細胞來源的腫瘤細胞遷移和侵襲的重要生物學(xué)過程［11］。

研究證實，積雪草酸對多種腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移具有抑制作用。積雪草酸可以促進乳腺癌細胞凋亡與細胞周期阻滯，有效抑制人乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 的生長，還能夠通過PI3K/Akt 信號通路抑制WAVE3 的激活，從而抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231 的侵襲［12］。積雪草酸通過介導(dǎo)線粒體損傷促進肺癌細胞的凋亡，并抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的肺癌A549 細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［13-14］。積雪草酸還可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活Grp78/IRE1α/JNK 和Calpain 通路抑制舌癌的生長［15］。同時，也有研究初步證實積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移具有抑制作用［16］。本研究深入探討了積雪草酸抑制結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機制。

金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs） 家族能夠降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，與腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤高度相關(guān)，在人類結(jié)腸癌中MMP-2 與MMP-9均過量表達［17-18］。MMP-9 和MMP-2 的高表達會減弱基底膜的屏障作用，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲［19］。本研究通過劃痕愈合與Transwell 遷移及侵襲實驗證實積雪草酸對HCT116 與SW480 細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，并通過Western blot 結(jié)果證實積雪草酸可抑制結(jié)腸癌HCT116 細胞的MMP-9、MMP-2 表達，并劑量依賴性地抑制間質(zhì)指標(biāo)N-cadherin、Vimentin、Snail 表達，促進上皮指標(biāo)E-cadherin 表達，從而抑制細胞EMT 進程。

Wnt/β-catenin 信號通路主要由細胞外因子（Wnt）、跨膜受體卷曲蛋白、β-catenin 和T 細胞因子等組成，已被證實在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)過度激活，這一異常激活增加Snail 的轉(zhuǎn)錄，并抑制E-cadherin，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加［15］。且Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活可調(diào)控其下游靶基因cyclinD1、c-myc 和survivin，進一步促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、增殖、遷移和侵襲［17，20］。本研究顯示，積雪草酸可有效抑制結(jié)腸癌HCT116 細胞Wnt/βcatenin 信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-myc、cyclin D1 和survivin 的表達，抑制效果呈劑量依賴性，且Wnt/β-catenin信號通路激動劑可逆轉(zhuǎn)積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲及EMT 相關(guān)蛋白與β-catenin 蛋白表達的作用。

綜上所述，積雪草酸能夠抑制結(jié)腸癌細胞HCT116 與SW480 的遷移、侵襲及EMT 進程，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，而這一作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路活化有關(guān)。