基于JAK/STAT3 信號通路探討 “金汁” 糞菌移植對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用

張全輝，王萬春，鄧永文，陳教華，安明偉，張磊昌

（1.江西中醫(yī)藥大學研究生院，江西 南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006）

潰瘍性結腸炎是一種反復發(fā)作的自發(fā)性炎癥性腸道疾病，病因不明，且病情輕重不等［1］。大多數(shù)患者發(fā)病時多以腹瀉、黏液膿血便、腹痛等為主要表現(xiàn)［2-3］。本病好發(fā)于青壯年人群，且大多反復發(fā)作，癌變的可能性十分高，所以治療較為棘手。目前醫(yī)學手段雖對潰瘍性結腸炎的治療有一定作用，但是預后較易復發(fā)，難以治愈，給患者造成巨大痛苦及身心疲憊，嚴重降低生活質量，加重了家庭經(jīng)濟負擔，所以需尋找新的治療方法。

近年來糞菌移植是研究的熱點，是指將健康供者糞便中的菌群以特殊方式植入患者腸道，調節(jié)患者腸道菌群，恢復患者正常的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，從而為治療腸道菌群失調引起的各種內外腸疾病提供一種新的治療方法［4］。中藥“金汁” 不同于糞便細菌移植，后者可以說是對前者的繼承和創(chuàng)新。古代金汁的制作方法為于冬月，取人糞便（11歲至12 歲健康男孩糞便最佳），加入上好的井水或山泉水攪拌后，將經(jīng)過竹篩和紗布過濾后的糞汁裝入新壇子，蓋碗后用土密封，深埋在地下貯藏1 年至30 年不等，取出呈清澈如水。由于中藥“金汁” 獲取困難，現(xiàn)存量極少，目前的研究主要集中在新金汁，也就是糞菌移植。現(xiàn)代糞菌移植理論與金汁入藥有不謀而合之妙［5-6］。有研究已證實，糞菌移植對潰瘍性結腸炎有一定的治療效果，且認為JAK/STAT3 信號通路在潰瘍性結腸炎患者中的異常激活，從而導致腸道炎癥瀑布式反應和持續(xù)加重，是探求潰瘍性結腸炎發(fā)病機制和選擇藥物治療靶點的熱門研究之一［7］。因此，本研究以潰瘍性結腸炎小鼠模型為研究對象深入探究“金汁” 糞菌移植對其的影響，初步探討其作用機制，以期為中藥治療潰瘍性結腸炎提供參考。

1 材料

1.1 動物 48 只BALB/c 小鼠，雌雄各半，6～8 周齡，體質量19～20 g，由江西中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （贛） 2018-0003］，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度27 ℃，相對濕度55%，自由進食，適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究動物實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（倫理號JZLLSC20210073）。

1.2 藥物 參考文獻［8］ 報道方法，取供體小鼠新鮮糞便標本，按7 ∶15 （g/mL） 比例溶于無菌PBS 溶液中，分別采用2.0、1.0、0.5、0.25 mm 不銹鋼篩過濾，過濾后離心15 min，取菌體，無菌PBS 緩沖液沖洗3 次，重懸于25 mL PBS 溶液中制成糞菌液，即得“金汁”，其中約含11 g 糞便，放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 PBS 緩沖液（批號22059494，合肥白鯊生物科技有限公司）； ELISA 試劑盒（批號202112，北京長惠恒遠生物科技有限公司）； BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（批號P0010S，上海碧云天生物技術有限公司）； 總RNA 試劑盒［批號A6010，普洛麥格（北京） 生物技術有限公司］； 兔源JAK、STAT3、p-STAT3 抗體 （批號 3344S、9139T、4113S，美國Cell Signaling Technology 公司）； Tofacitinib（JAK 抑制劑） （批號477600-75-2，美國MedChemExpress公司）。

1.4 儀器 離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；MB16-414 型酶標儀（上海皓莊儀器有限公司）； A51685 型PCR 儀［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］； DYY-1C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將小鼠隨機分為正常組、模型組、“金汁” 組、“金汁” +Tofacitinib 組，每組12 只。參照參考文獻［9］ 報道的造模方法，正常組給予蒸餾水，其余各組給予含2% DSS 的蒸餾水，飲用8 d 誘導建立潰瘍性結腸炎模型。第8 天開始全部換成蒸餾水。第9 天開始灌胃給藥，正常組和模型組給予蒸餾水，“金汁” 組給予糞便濾液灌腸 （每次0.2 mL，每天2 次），“金汁” +Tofacitinib 組給予糞便濾液灌腸（每次0.2 mL，每天2 次） +Tofacitinib 腹腔注射（5 mg/kg，每天1 次），連續(xù)干預5 d。

2.2 小鼠DAI 評分、脾臟指數(shù)和結腸長度測定 采用盲法觀察記錄小鼠的體質量、腹瀉和便血等臨床特征，參照文獻［10］ 報道方法，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI），評分標準見表1。給藥結束后，麻醉小鼠，摘眼球取血，全血離心后取血清； 取血后處死，分離得到脾臟和結腸，測量結腸長度，計算脾臟指數(shù)，公式為脾臟指數(shù)＝脾臟質量/小鼠體質量。

表1 DAI 評分標準

2.3 ELISA 法檢測血清炎癥因子水平 參照ELISA 試劑盒操作說明書檢測血清IL-6、TNF-α、IL-4 水平。

2.4 結腸大體形態(tài)觀察 取結腸末端的一部分于10%福爾馬林中固定，根據(jù)粘連程度、炎癥和潰瘍形成情況進行結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分。粘連情況評分標準為0 分，無粘連； 1 分，粘連（結腸與其他組織剝離較易）； 2 分，重度粘連。炎癥和潰瘍形成情況評分標準為0 分，無炎癥和潰瘍； 1 分，局部充血無潰瘍； 2 分，有1 處潰瘍不伴充血或腸壁增厚； 3 分，有l(wèi) 處潰瘍伴炎癥； 4 分，大于2 處潰瘍伴炎癥； 5 分，大于2 處潰瘍和（或） 炎癥大于l cm；6～8 分，潰瘍和（或） 炎癥大于2 cm，病變范圍每增加1 cm，計分加1 分。

2.5 比色法檢測結腸組織MPO 活性 取200 mg 結腸組織，以鄰聯(lián)茴香胺為底物，加2 g/L 十六烷基三甲基溴化胺（HTAB），于655 nm 波長處，用UV-200 型紫外分光光度計測定5 min 內樣品的吸光度（A） 變化均值，計算髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） 活性。

2.6 結腸組織病理變化觀察 取結腸末端的一部分于10%福爾馬林中固定，經(jīng)包埋、切片、脫蠟后，行蘇木素-伊紅（HE） 染色，樹膠封片后于顯微鏡下觀察組織形態(tài)，并隨機拍攝圖像評估組織形態(tài)變化。

2.7 免疫組化法檢測結腸組織增殖及炎癥相關蛋白表達取結腸組織切片，常規(guī)脫蠟至水，采用檸檬酸鈉熱修復抗原，3%過氧化氫室溫處理滅活內源性酶，封閉后孵育一、二抗，采用鏈霉親和素-POD 孵育組織，DAB 顯色，蘇木素復染封片后，于顯微鏡下觀察分析Ki-67、PCNA 及IL-6、TNF-α、IL-4 表達情況。

2.8 Western blot 法檢測結腸組織JAK、p-STAT3、STAT3蛋白表達 取適量結腸組織，用RIPA 蛋白裂解液裂解，抽提總蛋白，并進行蛋白濃度測定。蛋白樣本變性后，進行SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉，給予對應的一抗、二抗孵育后，采用化學發(fā)光法進行顯影成像，分析JAK、p-STAT3、STAT3 蛋白表達情況。

2.9 RT-qPCR 法檢測結腸組織JAK、STAT3 mRNA 表達取適量結腸組織，采用TRIzol 法提取組織總RNA，采用分光光度計測定RNA 濃度，并進行逆轉錄。參照試劑盒說明書配制反應體系，置于實時熒光定量PCR 儀內進行反應，以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCT法檢測JAK、STAT3 mRNA表達。

2.10 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠DAI 評分和脾臟指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組小鼠DAI 評分和脾臟指數(shù)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組小鼠DAI 評分和脾臟指數(shù)降低（P＜0.05），且“金汁” +Tofacitinib 組效果更佳，見表2。

表2 各組小鼠DAI 評分和脾臟指數(shù)比較（±s，n＝12）

表2 各組小鼠DAI 評分和脾臟指數(shù)比較（±s，n＝12）

注： 與正常組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別DAI 評分/分脾臟指數(shù)/（mg·g-1）正常組0.00±0.003.92±0.28模型組10.50±1.98＃8.52±1.01?！敖鹬苯M3.50±1.00*5.56±0.75*“金汁”+Tofacitinib 組2.50±0.52*4.02±0.55*

3.2 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理形態(tài)的影響 正常組小鼠結腸組織結構清晰，形態(tài)完整； 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織結構破壞，滲出大量炎性細胞，結腸長度縮短（P＜0.05），形態(tài)損傷評分升高（P＜0.05）； “金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組小鼠結腸組織漿膜層結構逐漸完整，組織形態(tài)逐漸改善，結腸長度增長（P＜0.05），形態(tài)損傷評分降低（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織HE 染色（×100）

表3 各組小鼠結腸長度、形態(tài)損傷評分比較（±s，n ＝12）

表3 各組小鼠結腸長度、形態(tài)損傷評分比較（±s，n ＝12）

注： 與正常組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別結腸長度/cm形態(tài)損傷評分/分正常組8.25±0.820.25±0.05模型組5.65±0.84＃2.75±0.56?！敖鹬苯M6.84±0.55*1.50±0.70*“金汁”+Tofacitinib 組7.69±0.48*0.75±0.20*

3.3 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠血清炎癥因子水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05），IL-4 水平降低（P＜0.05）； 與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組小鼠血清IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05），IL-4 水平升高（P＜0.05），且“金汁” +Tofacitinib 組效果更佳，見表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-4 水平比較（pg/mL，±s，n＝12）

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-4 水平比較（pg/mL，±s，n＝12）

注： 與正常組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別IL-6TNF-αIL-4正常組12.25±2.2527.68±5.63145.36±20.36模型組105.25±20.65＃130.25±15.69＃30.05±8.02?！敖鹬苯M68.09±14.36*50.32±10.36*75.36±12.08*“金汁”+Tofacitinib 組55.08±13.05*45.05±8.69*80.25±14.39*

3.4 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織MPO 活性的影響 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織MPO 活性升高（P＜0.05）； 與模型組比較，“金汁” 組和 “金汁” +Tofacitinib 組小鼠結腸組織MPO 活性降低（P＜0.05），且“金汁” +Tofacitinib 組效果更佳，見表5。

表5 各組小鼠結腸組織MPO 活性比較（±s，n＝12）

表5 各組小鼠結腸組織MPO 活性比較（±s，n＝12）

注： 與正常組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別MPO/（U·mg-1）正常組0.25±0.06模型組0.96±0.15?！敖鹬苯M0.54±0.12*“金汁”+Tofacitinib 組0.31±0.09*

3.5 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織增殖及炎癥相關蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織Ki-67、IL-6、TNF-α 蛋白表達升高（P＜0.05），PCNA、IL-4 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組小鼠結腸組織Ki-67、IL-6、TNF-α蛋白表達降低（P＜0.05），PCNA、IL-4 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖2～3。

圖2 各組小鼠結腸組織Ki-67、PCNA、IL-6、TNF-α、IL-4 蛋白免疫組化染色圖（×200）

圖3 各組小鼠結腸組織Ki-67、PCNA、IL-6、TNF-α、IL-4 蛋白表達（±s，n＝12）

3.6 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織JAK、p-STAT3、STAT3 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組小鼠結腸組織JAK、p-STAT3、STAT3 蛋白表達降低 （P＜0.05），且 “金汁” +Tofacitinib 組效果更佳，見圖4、表6。

圖4 各組小鼠結腸組織JAK/STAT3 通路相關蛋白條帶圖

表6 各組小鼠結腸組織JAK、p-STAT3、STAT3 蛋白表達比較（±s，n＝12）

表6 各組小鼠結腸組織JAK、p-STAT3、STAT3 蛋白表達比較（±s，n＝12）

注： 與正常組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別JAKp-STAT3STAT3正常組0.50±0.050.53±0.150.86±0.17模型組2.68±0.45＃2.89±0.41＃ 1.65±0.35＃“金汁”組1.25±0.14* 1.85±0.24* 1.55±0.28“金汁”+Tofacitinib 組1.08±0.09* 1.05±0.09* 1.06±0.08*

3.7 “金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織JAK、STAT3 mRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織JAK、STAT3 mRNA 表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組小鼠結腸組織JAK、STAT3 mRNA 表達降低（P＜0.05），且“金汁” +Tofacitinib組效果更佳，見表7。

表7 各組小鼠結腸組織JAK、STAT3 mRNA 表達比較（±s，n＝12）

表7 各組小鼠結腸組織JAK、STAT3 mRNA 表達比較（±s，n＝12）

注： 與正常組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別JAK mRNASTAT3 mRNA正常組1.00±0.001.00±0.00模型組5.05±0.36＃6.17±0.45?！敖鹬苯M2.72±0.25*2.15±0.36*“金汁”+Tofacitinib 組2.43±0.20*1.96±0.24*

4 討論

有研究認為，潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制可能是由于腸道免疫系統(tǒng)失衡，引起腸道免疫反應從而引發(fā)疾?。?1-12］，所以近年來越來越多的學者轉向對腸道微生態(tài)的研究［13］。“金汁” 為民間中藥之一，在《本草綱目》 中也有利用糞便治療疾病的記載。糞菌移植是近年來興起的現(xiàn)代治療方法，與中醫(yī)中的“金汁” 有異曲同工之處［14］。因此，本研究使用“金汁” 對潰瘍性結腸炎小鼠進行糞菌移植，并探討其機制。

本研究結果顯示，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib組給藥后DAI 評分均降低，表明“金汁” 糞菌移植可一定程度上改善潰瘍性結腸炎小鼠的腸道損傷。HE 染色顯示模型組小鼠正常細胞結構消失，滲出大量炎性細胞； 而“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組漿膜層結構逐漸完整，組織形態(tài)逐漸改善，表明“金汁” 糞菌移植可有效減輕結腸黏膜的局部炎癥，修復組織。有研究表明，潰瘍性結腸炎患者血清中IL-6 水平升高，且與病變程度及累及范圍相關，病情緩解后IL-6 水平降低［15-16］。一方面，IL-6 本身具有廣泛的促炎作用，可改變結腸上皮細胞電解質的分泌，使內皮細胞通透性增強，中性粒細胞大量涌出浸潤，加重炎癥反應； 另一方面，IL-6 的高水平還會引起JAK/STAT3 通路的異常激活。IL-4 屬于抗炎性細胞因子，主要由激活的T淋巴細胞分泌，能有效抑制單核巨噬細胞合成的IL-1β、TNF-α 等促炎性因子分泌，且可降低單核巨噬細胞對氧自由基的分泌能力。此外，IL-4 還可以抑制促炎癥因子IL-8及PGE2的合成與分泌，從而減輕和緩解炎癥反應的程度［17-18］。本研究結果顯示，與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組IL-6、TNF-α 水平降低，IL-4 水平升高，表明“金汁” 糞菌移植可以有效改善炎癥反應。除此之外，與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib組MPO 活性較低，這也進一步驗證了糞菌移植可以減輕腸道的炎癥反應。

有臨床研究顯示，Ki-67 是一種細胞核抗原，可反應細胞增殖，且發(fā)現(xiàn)在腸癌組織中的Ki-67 呈現(xiàn)高表達，而在癌旁組織中表達明顯較低［19］。本研究結果顯示，與模型組比較，“金汁” 組和 “金汁” +Tofacitinib 組Ki-67、IL-6、TNF-α 表達降低，PCNA、IL-4 表達升高，表明“金汁” 糞菌移植對腸道炎癥反應有所改善。許話等［20］研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子與生長因子是JAK/STAT3 信號通路重要的啟動因子，其通過與JAK 激酶偶聯(lián)的相應受體結合，介導信號蛋白的級聯(lián)活化反應，從而在機體炎癥反應及腫瘤形成過程中發(fā)揮重要的作用。STAT3 是信號傳導通路家族的重要成員之一，其在人體免疫反應、炎癥反應及腫瘤形成等病理過程中發(fā)揮著重要的調控作用。林麗艷等［21］研究發(fā)現(xiàn)，許多細胞因子和生長因子可通過JAK/STAT3 信號通路將細胞外信號傳遞到細胞核內。此外，吳成成等［8］認為該通路在人體免疫反應、炎癥反應以及腫瘤形成的病理過程中有重要的調控作用，在此傳導過程中，IL-6 持續(xù)過表達可以激活此通路從而引發(fā)炎癥反應。本研究結果顯示，與模型組比較，“金汁” 組和“金汁” +Tofacitinib 組JAK、p-STAT3、STAT3 蛋白及JAK、STAT3 mRNA 表達降低，表明“金汁”糞菌移植可通過調控JAK/STAT3 通路對潰瘍性結腸炎有改善作用。

綜上所述，“金汁” 糞菌移植可改善潰瘍性結腸炎小鼠炎癥和臨床癥狀，保護結腸黏膜，可能是通過抑制JAK/STAT3 信號通路異常激活實現(xiàn)的，這為潰瘍性結腸炎的臨床治療提供了新的思路。除此之外，還應保持對未知風險的警惕，需要大規(guī)模的實驗來確定“金汁” 糞菌移植的安全性和可行性。