視力舒顆粒制備工藝優(yōu)化及其物理指紋圖譜建立

唐 茜，韓云鳳，石 懿，楊春紅，賴先榮*，張富文

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137； 2.成都中醫(yī)大銀海眼科醫(yī)院股份有限公司，四川 成都 610081）

視力舒處方為成都中醫(yī)大瀛海眼科醫(yī)院院內(nèi)制劑，是根據(jù)陳達(dá)夫“補(bǔ)益肝腎、活血明目” 的近視治療理念，以“駐景丸加減方” 為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)，用于能近怯遠(yuǎn)、目睫無(wú)力、視物昏花等癥［1］，由菟絲子、楮實(shí)子、枸杞、山藥、青皮、葛根等11 味中藥組成，原方以湯劑形式服務(wù)于患者，多年臨床應(yīng)用效果滿意，為了最大程度方便患者用藥，課題組前期將其開(kāi)發(fā)成顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化視力舒顆粒制備工藝，并建立其物理指紋圖譜，以期為該制劑新藥開(kāi)發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 BSA124S 型、CPA225D 型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； UPH-I-10T 型（優(yōu)普） 純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）； ZDHW 型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）； YC-500 實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥機(jī)（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）； DHG-9624A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海將任實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； HCP108恒溫恒濕箱（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥材 菟絲子（批號(hào)200900671，產(chǎn)地遼寧）、枸杞子（批號(hào)201100371，產(chǎn)地寧夏）、炒茺蔚子 （批號(hào)200400771，產(chǎn)地四川）、麩炒山藥（批號(hào)200700771，產(chǎn)地河南）、芡實(shí)（批號(hào)191003931，產(chǎn)地廣東）、葛根（批號(hào)200901621，產(chǎn)地四川）、油松節(jié)（批號(hào)190800181，產(chǎn)地四川）、伸筋草 （批號(hào)200800261，產(chǎn)地四川）、炒楮實(shí)子（批號(hào) 200600201，產(chǎn)地湖北）、麩炒青皮 （ 批號(hào)200500531，產(chǎn)地四川） 均購(gòu)自成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定為正品。炒楮實(shí)子、麩炒青皮符合2015 年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》 藥用標(biāo)準(zhǔn)，其余藥材均符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部藥用標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試劑 金絲桃苷 （批號(hào)DST201013-023，純度≥98.0%）、葛根素 （批號(hào)DSTDG000201，純度≥98.0%）、橙皮苷（批號(hào)DSTDG003801，純度≥98.0%） 對(duì)照品均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司?？扇苄缘矸?（批號(hào)A16GS145576）、微晶纖維素（批號(hào)Z11N11W130285）、糊精（批號(hào)T02D11Z13024）、甘露醇（批號(hào)M24GS149532）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司； 蔗糖 （批號(hào)20130624） 購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）； 磷酸為色譜純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 濃縮液制備 按處方量稱取11 味藥材共150 g，加11倍量水煎煮3 次，每次80 min，合并濾液，過(guò)濾濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.08，即得。

2.2 干膏粉制備 由于處方干膏得率較大，若采用稠浸膏制粒則輔料用量較多，從而加大了服藥量，故選擇制成干膏粉進(jìn)行濕法制粒。前期發(fā)現(xiàn)，真空干燥得到的干膏黏性大，難以粉碎，故采用噴霧干燥。以葛根素、金絲桃苷、橙皮苷含量，物料干燥情況，出粉率為指標(biāo)，設(shè)定噴霧壓力為0.05 MPa，風(fēng)機(jī)頻率為40 Hz，蠕動(dòng)速度為10 r/min，對(duì)噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)口、出風(fēng)口溫度進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表1，最終確定兩者分別為130、79 ℃。

表1 噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)口、出風(fēng)口溫度考察結(jié)果

2.3 顆粒制備 將干膏粉與輔料混勻，乙醇潤(rùn)濕制軟材，16 號(hào)篩搖擺制粒，干燥整粒，即得，平行制備15 批（編號(hào)SLS1～SLS15）。

2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇及測(cè)定 顆粒成型率、吸濕率、休止角是評(píng)價(jià)成型工藝是否符合要求、顆粒品質(zhì)穩(wěn)定性、顆粒質(zhì)量能否準(zhǔn)確分裝的關(guān)鍵指標(biāo)［2-4］，金絲桃苷、葛根素、橙皮苷保留率是保證顆粒藥效的重要指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)選擇以上指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.4.1 各成分含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.4.1.1 色譜條件 Swell Chromplus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脫（0 ～10 min，5% ～10%乙腈； 10～20 min，10% ～17%乙腈； 20～40 min，17% ～25%乙腈； 40～45 min，25% ～5%乙腈）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm （金絲桃苷、葛根素）、280 nm （橙皮苷）； 進(jìn)樣量10 μL。

2.4.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品金絲桃苷0.92 mg、橙皮苷2.38 mg、葛根素4.99 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.1.3 供試品溶液制備 精密稱取相當(dāng)于0.5 g 干膏粉的顆粒適量，置于具塞錐形瓶中，加20 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（頻率25 Hz，功率100 W） 處理1 h，放冷，稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.1.4 陰性樣品溶液制備 分別制備缺菟絲子、缺青皮、缺葛根的陰性樣品，按 “2.4.1.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4.1.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得各成分方程分別為金絲桃苷Y＝21.444X-0.964 2 （R2＝0.999 8），線性范圍2.48 ～92.00 μg/mL； 葛根素Y＝39.523X+23.316（R2＝0.999 9），線性范圍13.47 ～499.00 μg/mL； 橙皮苷Y＝15.307X+9.502 2 （R2＝0.999 8），線性范圍6.43 ～238.00 μg/mL，均在各自范圍線性關(guān)系良好。

2.4.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得金絲桃苷、橙皮苷、葛根素峰面積RSD 分別為1.88%、1.11%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.4.1.3” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷、橙皮苷、葛根素含量RSD 分別為1.26%、1.06%、1.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷、橙皮苷、葛根素峰面積RSD 分別為2.37%、1.17%、0.85%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定良好。

2.4.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取2 mL 各成分含量已知的供試品溶液6 份，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷平均加樣回收率分別為100.11%、101.84%、102.28%，RSD 分別為1.96%、1.77%、1.89%。

2.4.2 保留率測(cè)定 精密稱取干膏粉0.5 g、相當(dāng)于干膏粉0.5 g 的顆粒適量，按“2.4.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算保留率，公式為保留率＝ （制粒后成分含量/制粒前成分含量） ×100%。

2.4.3 成型率測(cè)定 參考文獻(xiàn)［5］ 報(bào)道，取顆粒適量（m1），稱定能通過(guò)1 號(hào)篩但被5 號(hào)篩截留的顆粒質(zhì)量（m2），計(jì)算成型率，公式為成型率＝ （m2/m1） ×100%

2.4.4 吸濕率測(cè)定 參考文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道，將恒重稱量瓶放在盛有過(guò)飽和氯化鈉溶液的干燥器中，置于25 ℃恒溫箱中平衡24 h 后取出，精密稱定質(zhì)量（m1）； 精密稱取顆粒適量（m2），平鋪于稱量瓶底部，放回25 ℃恒溫箱中24 h后取出，稱定質(zhì)量（m3），計(jì)算吸濕率，公式為吸濕率＝［（m3-m1-m2） /m2］ ×100%。

2.4.5 休止角測(cè)定 采用固定漏斗法［7］。用鐵架臺(tái)將3 個(gè)串聯(lián)漏斗固定，最下方漏斗與坐標(biāo)紙的距離為H，從最上方漏斗緩慢倒入顆粒，當(dāng)其形成的圓錐體頂尖與最下方漏斗頂尖發(fā)生接觸時(shí)停止傾倒，底部半徑為R，計(jì)算休止角，公式為休止角＝arctan （H/R）。

2.5 輔料篩選 以顆粒制備難易程度、溶化性、成型率為指標(biāo)進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表2，最終確定為甘露醇。

表2 輔料篩選結(jié)果

2.6 Plackett-Burman 試驗(yàn) 在濕法制粒過(guò)程中，影響顆粒成型的因素主要有藥輔比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、干燥時(shí)間、干燥溫度［8-9］。本實(shí)驗(yàn)在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)，分別采用AHP、CRITIC、AHPCRITIC 混合加權(quán)法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，因素水平見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.6.1 AHP 法 AHP 法屬于主觀賦權(quán)法［10-11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析成分和3 個(gè)物理屬性指標(biāo)重要性，將各指標(biāo)劃分為4個(gè)層次，由層次劃分結(jié)果構(gòu)成兩兩比較優(yōu)先判斷矩陣，權(quán)重系數(shù)見(jiàn)表5，再按文獻(xiàn) ［12］ 報(bào)道計(jì)算一致性比率（CR），測(cè)得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率、吸濕率、休止角的權(quán)重系數(shù)分別為0.242 7、0.242 7、0.242 7、0.136 2、0.082 5、0.053 0，CR ＝0.010 9＜0.10，表明權(quán)重系數(shù)有效。

表5 各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

2.6.2 CRITIC 法 CRITIC 作為客觀賦權(quán)法［13-14］，是完全利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)［15］。本實(shí)驗(yàn)將表4數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率均越大越好，吸濕率、休止角均越小越好，參考文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道計(jì)算權(quán)重，測(cè)得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率、吸濕率、休止角權(quán)重系數(shù)分別為0.161 9、0.117 6、0.129 7、0.230 4、0.236 6、0.123 8。

2.6.3 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法 將AHP 法與CRITIC 法結(jié)合進(jìn)行權(quán)重分配時(shí)，能兼顧主客觀因素，使評(píng)分更科學(xué)，公式為ω綜合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，測(cè)得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率、吸濕率、休止角的權(quán)重系數(shù)分別為0.256 3、0.186 0、0.205 1、0.204 5、0.066 5、0.081 6。

2.6.4 綜合評(píng)分計(jì)算 結(jié)果見(jiàn)表6，可知3 種評(píng)分方法兩兩之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.98 （P＜0.01），表明三者具有一致性； AHP 法、CRITIC 法所得權(quán)重相關(guān)系數(shù)為-0.620（P＞0.05），即反映的信息不具有疊加性，表明AHPCRITIC 混合加權(quán)法更全面。

表6 Plackett-Burman 試驗(yàn)綜合評(píng)分計(jì)算結(jié)果（分）

2.6.5 方差分析 采用Minitab 19 軟件對(duì)表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表7。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 輔料用量、潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù)、干燥溫度對(duì)綜合評(píng)分具有顯著影響（P＜0.05），故選擇三者進(jìn)行后續(xù)考察。同時(shí)，固定潤(rùn)濕劑用量為45%，干燥時(shí)間為120 min。

表7 Plackett-Burman 試驗(yàn)方差分析

2.7 Box-Behnken 響應(yīng)面法 采用Design-Expert 10.0 軟件，以輔料用量（A）、潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù)（B）、干燥溫度（C）為影響因素，各指標(biāo)綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按-1、0、1 水平編碼，結(jié)果見(jiàn)表8～9。由此可知，3 種評(píng)分方法兩兩之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.98 （P＜0.01），表明三者具有一致性；AHP 法、CRITIC 法所得權(quán)重相關(guān)系數(shù)為-0.557 （P＞0.05），即反映的信息不具有疊加性，表明AHP-CRITIC 混合加權(quán)法更全面。

表8 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果

表9 Box-Behnken 響應(yīng)面法綜合評(píng)分計(jì)算結(jié)果（分）

采用Design-Expert 10.0 軟件對(duì)表8 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，方差分析見(jiàn)表10，可知模型P＜0.01，具有高度顯著性； 相關(guān)系數(shù)R2＝0.953 3＞0.9，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性較好，可用于分析； 各因素影響程度依次為B＞A＞C，并且均有極顯著影響（P＜0.01）。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2，可知最優(yōu)工藝為輔料用量0.31 倍，潤(rùn)濕劑（乙醇） 體積分?jǐn)?shù)87.35%，干燥溫度60 ℃，綜合評(píng)分為98.61 分，考慮到在生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)中的便利性，將潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù)修正為87%。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

表10 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析

按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均綜合評(píng)分為98.76 分，RSD 為0.12%，與預(yù)測(cè)值98.61 分接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.8 物理指紋圖譜建立

2.8.1 物理指標(biāo)選擇及測(cè)定 結(jié)合文獻(xiàn)［17-18］ 報(bào)道及顆粒劑物理性質(zhì)、粉體學(xué)性質(zhì)，選擇堆積性、均一性、流動(dòng)性、穩(wěn)定性作為一級(jí)指標(biāo)，松密度、振實(shí)密度、相對(duì)均齊度指數(shù)、豪斯納比、休止角、干燥失重、吸濕性作為二級(jí)指標(biāo)。參考文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)收載，將15 批樣品物理指標(biāo)轉(zhuǎn)換成0～10，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 物理指紋圖譜指標(biāo)轉(zhuǎn)化值測(cè)定結(jié)果

2.8.2 圖譜生成及相似度分析 采用Excel 軟件對(duì)15 批樣品物理指標(biāo)轉(zhuǎn)化值進(jìn)行處理，繪制雷達(dá)圖，再對(duì)其平均值繪制雷達(dá)圖，得到對(duì)照物理指紋圖譜（SLS R），見(jiàn)圖3。然后，采用SPSS 22.0 軟件中的夾角余弦法進(jìn)行相似度分析，發(fā)現(xiàn)各批樣品之間的相似度均大于0.997，與對(duì)照物理指紋圖譜的相似度均在0.999 以上，表明其穩(wěn)定性良好。

圖3 15 批視力舒顆粒物理指紋圖譜

2.9 樣品含量測(cè)定 取15 批樣品，按“2.4.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表12。由此可知，各成分含量穩(wěn)定，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表12 各成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

視力舒顆粒制備工藝優(yōu)化的過(guò)程遵循了質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD） 理念［20］。本實(shí)驗(yàn)以3 種成分指標(biāo)、3 個(gè)物理評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)得值的綜合評(píng)分為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對(duì)5 個(gè)潛在工藝參數(shù)采用Plackett-Burman 試驗(yàn)進(jìn)行篩選，再結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。

在工藝優(yōu)化的多指標(biāo)決策中，權(quán)重具有重要地位，其合理性會(huì)直接影響排序準(zhǔn)確性［21］。本實(shí)驗(yàn)考察了AHP 法、CRITIC 法、AHP-CRITIC 混合加權(quán)法，其中AHP 法依據(jù)成分指標(biāo)與物理評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)顆粒質(zhì)量影響的重要性，主觀進(jìn)行了層次劃分； CRITIC 法是利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，可消除人為因素，結(jié)果兩者所得權(quán)重系數(shù)反映的信息不具有疊加性，故采用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法，同時(shí)兼顧主客觀因素，可使評(píng)分更科學(xué)合理。

顆粒物理屬性是其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要方面，可作為HPLC含量測(cè)定的補(bǔ)充，從而其全面質(zhì)量控制提供了新思路，同時(shí)物理指紋圖譜可對(duì)其物理性質(zhì)進(jìn)行全面反映［17］。本實(shí)驗(yàn)按優(yōu)化工藝制備了15 批視力舒顆粒，建立了其物理指紋圖譜，并采用HPLC 法對(duì)關(guān)鍵成分進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各批樣品質(zhì)量具有較高的一致性，可為相關(guān)新藥開(kāi)發(fā)、工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暫定視力舒顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為物理指紋圖譜與對(duì)照物理指紋圖譜的相似度應(yīng)大于0.9，金絲桃苷、葛根素、陳皮苷含量分別應(yīng)大于0.08%、0.48%、0.32%。