三七皂苷類成分防治肝纖維化的研究進展

陳思思，王 俊，鄭杭生

（1.湖州市第三人民醫(yī)院，浙江 湖州 313000； 2.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310000）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF） 是肝臟在多種因素刺激下產(chǎn)生的慢性進行性肝臟損傷，如長期過量飲酒、病毒感染或長期服用肝毒性藥物等［1］。主要表現(xiàn)為肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC） 的激活，導致過多的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），如膠原蛋白、非膠原性糖蛋白、蛋白聚糖等在肝臟中沉積，從而促使HF 的發(fā)生與發(fā)展［2-3］。由于HF 具有可逆性，故及時有效的治療可防止肝硬化和肝癌的發(fā)生［4］。

三七皂苷類成分是五加科人參屬植物三七的主要活性成分，可統(tǒng)稱為三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS），其包含多種單體皂苷成分，如人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Re 等?，F(xiàn)代藥理學研究表明其在治療心血管疾病、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、改善物質(zhì)代謝等方面具有顯著功效［5-7］。近年來，隨著對三七皂苷類成分的深入研究，其在抗HF 作用方面取得了一些新進展，故有必要對HF 的發(fā)生機制進行系統(tǒng)闡述，并根據(jù)目前的研究結(jié)果對三七皂苷類成分治療HF 的分子機制進行綜述，為三七皂苷類成分治療HF 的研究提供理論依據(jù)。

1 肝纖維化發(fā)生的機制

HF 是肝臟在遭受多種因素長期、反復的刺激下引發(fā)慢性肝損傷后，在其修復的過程中產(chǎn)生的一種代償性反應，是慢性肝損傷發(fā)展為肝硬化或肝癌的重要中間環(huán)節(jié)［8］。中醫(yī)學者們根據(jù)HF 患者的臨床表現(xiàn)，將其歸為“淤血” “脅痛” “積聚” “黃疸” 等病癥范疇，認為其病機關(guān)鍵是肝血瘀阻所致的肝郁脾虛，常以“活血化瘀、軟堅散結(jié)” 為治療原則［9］。西醫(yī)認為HF 的發(fā)病機制主要是ECM 在細胞間質(zhì)過度沉積所致。

HF 的發(fā)生機制主要涉及氧化應激、炎癥反應、增殖、凋亡和多種細胞因子的作用等。HF 是在肝細胞損傷后進行自我修復、產(chǎn)生炎癥免疫反應和ECM 過量沉積的過程中所形成的，其中，ECM 過多沉積與降解相對不足是其形成的直接原因［10-11］。當肝臟遭受長期刺激后機體會產(chǎn)生氧化應激反應，導致自由基的大量生成，引起脂質(zhì)過氧化，從而造成肝細胞損傷； 肝細胞的損傷會引發(fā)枯否細胞活化，從而釋放出血小板衍生生長因子 （platelet derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF） 等炎癥細胞因子［12-13］。上述炎癥細胞因子和受損的肝細胞可直接活化HSC 成為肌成纖維細胞（myofibroblasts，MFs），后者通過高表達α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），產(chǎn)生大量I 型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白等ECM 成分沉積于肝臟內(nèi)，這是導致HF 形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［14］。正常情況下ECM 的降解或沉積受到基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs） 和金屬蛋白酶抑制劑 （tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）的共同調(diào)節(jié)，TIMPs 通過與MMPs 結(jié)合使其失去蛋白水解活性，從而抑制MMPs 的活化，阻止ECM 降解［15］。在肝臟遭受炎癥細胞因子的刺激過程中，TIMPs 的持續(xù)增多是導致MMPs 活性降低甚至失活的重要原因，“MMPs-TIMPs” 的平衡一旦被打破，就會造成ECM 大量沉積，推動HF 的進展。HSC 的活化機制非常復雜，目前報道的信號通路主要包括TGF-β1/Smad 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、ERK1/2-MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路和Wnt/βcatenin 信號通路等［16-20］，這些信號通路共同介導HSC 的活化增殖。最終ECM 沉積過多，肝臟形成纖維化（圖1）。HF 的不斷加重可導致肝硬化，甚至惡變形成肝癌。目前HF 的治療主要依靠藥物，西藥通過抑制肝臟細胞的炎癥反應，保護肝細胞，抑制HSC 活化增殖和ECM 的合成； 中藥則通過清除自由基，去除HF 形成的誘因，抑制HSC 的活化和增殖，阻斷ECM 的生成和促進ECM 的降解。

圖1 肝纖維化形成機制

2 三七皂苷類成分防治肝纖維化的細胞和分子作用機制

2.1 對氧化應激反應的影響 氧化應激反應是指機體受到外界因素刺激后造成“氧化-抗氧化” 平衡系統(tǒng)被破壞，相應的組織發(fā)生損傷，使得器官代謝活動發(fā)生異常的一種應激狀態(tài)。氧化應激是肝纖維化、酒精中毒性肝病、感染性肝炎和糖尿病肝病等多種肝臟疾病的共同發(fā)病機制，在此過程中所生成的過量氧自由基是氧化應激損傷發(fā)生的主要原由［21］。肝臟的氧化應激指標主要包括還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶 （ superoxide dismutase，SOD） 和丙二醛（malondialdehyde，MDA） 等。其中，GSH 廣泛存在于哺乳動物組織中，其作為一種重要的抗氧化劑，能夠清除多種活性氧物質(zhì)，有效減輕氧化應激反應對組織器官的損傷； SOD 是機體內(nèi)存在的一種主要的抗氧化金屬酶，可催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，減少氧自由基對肝細胞的傷害，對維持“氧化-抗氧化” 平衡起著至關(guān)重要的作用； MDA 作為脂質(zhì)過氧化反應的最終產(chǎn)物之一，是機體細胞氧化損傷的一個重要檢測指標，可通過直接激活枯否細胞和HSC，造成肝細胞的損傷甚至死亡［22］。董婧婧等［23］在開展三七（主要活性成分為三七總皂苷） 對慢性肝損傷保護作用的實驗研究中，以皮下注射四氯化碳（CCl4） 誘導建立大鼠慢性HF 模型，通過測定肝組織MDA 水平，評價三七對模型大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的影響，同時檢測肝組織中SOD、GSH、GSHPx 水平來衡量三七對模型大鼠的抗氧化能力，結(jié)果表明，三七通過提高模型大鼠肝組織中GSH 水平和SOD、GSH-Px活性，降低MDA 水平，以增強機體的抗氧化能力，實現(xiàn)對HF 的防治作用。硫氧還蛋白-1 （thioredoxin-1，Trx-1） 是一種小分子蛋白，具有多種生物學功能，其廣泛存在于原核生物和真核生物體內(nèi)。研究表明，Trx-1 與GSH 一樣具有還原性，可以通過調(diào)節(jié)機體氧化還原平衡來減輕肝臟的炎癥反應，減少氧化應激損傷，抵抗HF［24］。鄭灃［25］對三七皂苷抵抗納曲酮所致HF 的分子機制進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在納曲酮的長期作用下，小鼠肝臟中Trx-1 的表達顯著下降，而三七皂苷能誘導Trx-1 的高表達，且三七皂苷與納曲酮的聯(lián)合用藥能明顯緩解納曲酮引起的Trx-1 低表達，這一研究結(jié)果證實了三七皂苷很可能是通過誘導Trx-1 的高表達發(fā)揮抗HF 作用。此外，該研究也揭示了Trx-1 緩解HF的生物學作用是多方面的，包括抗氧化應激、調(diào)節(jié)炎癥反應、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、調(diào)節(jié)細胞周期和抑制細胞凋亡等多種作用，Trx-1 可以作為HF 預防和治療的一個重要靶點。

2.2 對炎癥免疫反應和肝細胞凋亡的影響 HF 是在肝臟炎癥和肝細胞壞死的基礎(chǔ)上，纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。肝臟炎癥作為HF 的驅(qū)動因素［26］，在病程早期，炎癥反應的長期、反復刺激會加劇肝組織損傷，造成肝細胞壞死，從而推動纖維化的進展。大量研究證實［27-28］，HF機體內(nèi)的一些炎癥細胞因子表達異常，其中，肝臟核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）、TGF-β 蛋白表達、肝組織中腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 和TGF-βmRNA 表達及血清中白細胞介素-1 （interleukin-1，IL-1）、IL-22、IL-6 水平升高，而血清IL-10 水平降低。NFκB 是炎癥反應最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，可激活HSC，促使其分泌IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-α 等細胞因子。TGF-β 能誘導肝細胞凋亡，促進HSC 增生，誘導ECM 形成，同時抑制ECM 降解，故TGF-β 水平可反映機體中肝組織炎癥壞死及纖維化的程度。TNF-α 可以增強HSC 的趨化性，激活HSC，同時，它能刺激肝臟的炎癥反應，進一步發(fā)揮促纖維化作用。IL-1、IL-22 和IL-6 可刺激HSC 增殖和促進膠原合成，同時通過抑制MMPs 產(chǎn)生、減少膠原降解，促進HF 生成。而IL-10 作為主要的負反饋免疫調(diào)節(jié)因子，主要通過下調(diào)TGF-β 和TNF-α 等炎癥因子的表達以抑制HSC 激活，同時也能調(diào)節(jié)ECM 的合成與降解，從而抑制HF 的發(fā)生［19，29-30］。研究顯示，三七總皂苷作用于CCl4誘導的HF 大鼠后能夠通過調(diào)控其細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，發(fā)揮抗HF 作用［31］，主要表現(xiàn)為抑制NF-κB、TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6 水平，升高IL-10 水平。

細胞凋亡的調(diào)控機制非常復雜，細胞是否發(fā)生凋亡與“促凋亡基因-凋亡基因” 之間的平衡直接相關(guān)。細胞凋亡受多種基因調(diào)控，Bcl-2 和Bax基因發(fā)揮著重要作用，其中，Bax基因能促進細胞凋亡，而Bcl-2 基因則能抑制細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，HF 模型大鼠肝組織中Bax和Bcl-2 的表達較正常組均升高，表明機體在通過代償機制來升高抗凋亡蛋白的表達以對抗肝細胞凋亡［32］。在此基礎(chǔ)上，給予三七總皂苷干預10 周后，與模型組比較，三七總皂苷中、高劑量組（100、200 mg/kg）Bcl-2 表達升高，Bax表達則降低，說明三七總皂苷可以通過升高Bcl-2 表達，同時降低Bax表達，以抑制肝細胞的凋亡，發(fā)揮抗HF 作用。

2.3 對肝臟線粒體功能的影響 線粒體作為能量轉(zhuǎn)換細胞器，能夠提供能量、促進新陳代謝，對維持細胞的正常生理功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。肝臟線粒體氧化磷酸化功能改變被認為與HF 的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)［33］。線粒體DNA 三磷酸腺苷（adenine triphosphate，ATP） 酶6 亞基和8 亞基基因的突變會直接導致ATP 酶合成減少，造成線粒體中ATP 水平下降從而影響肝細胞的正常生理功能，致使肝細胞壞死，誘導HF 發(fā)生［34］。李劍瑜等［35］對人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1干預下，HF 大鼠肝臟線粒體DNA ATP 酶6 亞基和ATP酶8 亞基的基因突變情況和線粒體中ATP 水平變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1能減少肝臟線粒體DNA ATP 酶6 亞基和ATP 酶8 亞基的基因突變，抑制線粒體ATP 水平下降，恢復肝細胞的正常生理功能，延緩HF的發(fā)生發(fā)展。此外，李劍瑜等［36］還發(fā)現(xiàn)，HF 大鼠中肝臟線粒體質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運能力降低，同時伴隨著線粒體膜流動性減弱，導致氧化磷酸化功能異常，ATP 無法合成，造成肝細胞內(nèi)能量代謝障礙，加速HF 的形成。人參皂苷Rg1能夠保護大鼠肝臟線粒體的質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運能力，使肝臟線粒體微黏度降低，增加線粒體膜流動性，恢復線粒體的氧化磷酸化功能，維持肝細胞的正常生理功能，防止HF 的產(chǎn)生。

在HF 形成的早中期階段，大量肝細胞遭受破壞會促使巨噬細胞和肝細胞產(chǎn)生過量的NO，而NO 能夠抑制肝細胞線粒體的呼吸鏈和蛋白合成以加重肝細胞損傷，促使疾病進展，其水平與HF 程度呈正相關(guān)性［37］。研究表明，三七總皂苷能降低HF 小鼠血清中的NO 水平，保護肝細胞，減輕HF 程度［38］。

2.4 對HSC 活化與凋亡的影響 HSC 作為體內(nèi)重要的間充質(zhì)細胞，正常情況下，其在肝臟中處于靜止狀態(tài)。當肝臟受損后，產(chǎn)生的大量炎癥細胞因子可直接激活HSC 為MFs，后者可產(chǎn)生大量Ⅰ/Ⅲ膠原、透明質(zhì)酸等ECM 成分沉積于肝臟內(nèi)，最終導致HF 的形成［39］。由此可見，HSC 的活化是導致ECM 過度沉積和HF 持續(xù)進展的主要驅(qū)動力［40-41］，因此通過抑制HSC 的活化或誘導其凋亡可有效逆轉(zhuǎn)HF 的發(fā)生發(fā)展［42］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路的異常激活與HF、肝癌密切相關(guān)［43-44］。賀微微等［20］研究了人參皂苷Rg1對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病小鼠HF 的作用，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)人參皂苷Rg1處理后的小鼠肝組織纖維化程度明顯降低，并能有效抑制I/Ⅲ膠原的表達。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)模型組小鼠TGF-β1/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路呈過度激活狀態(tài)，而人參皂苷Rg1能夠有效抑制這2 個通路的活化，說明人參皂苷Rg1可能是通過抑制TGF-β1/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路發(fā)揮其抗HF 的作用。Jiang 等［45］發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷通過調(diào)節(jié)Jak2/Stat3 信號通路以抑制HSC 的活化，能改善大鼠肝臟總膽紅素、總膽汁酸、ALT 和AST 水平，發(fā)揮抗HF 作用。另有研究表明，三七總皂苷可以通過誘導活化的HSC 凋亡逆轉(zhuǎn)HF，且隨著三七總皂苷劑量增加，細胞凋亡的比例隨之增高［46］。

2.5 對ECM 沉積與降解的影響 ECM 的過渡沉積是HF形成的最終環(huán)節(jié)，ECM 作為調(diào)節(jié)肝臟自身分化、增殖及代謝的一類大分子物質(zhì)，主要由膠原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白和透明質(zhì)酸鹽等多種成分組成，其中，膠原蛋白是ECM 的主要成分［47］。ECM 主要受TIMPs 和MMPs 的共同調(diào)節(jié)，其中，MMPs 主要來源于靜止的HSC 及MFs 等，而TIMPs 是肝臟中MMPs 的主要生理抑制劑［48］。TIMPs 作為MMPs 活化的抑制劑，可通過與其結(jié)合來阻斷MMPs 的蛋白水解活性，進而阻止ECM 的分解。在疾病的進展過程中會出現(xiàn)MMPs 的分泌減少和活性的下降，與此同時伴隨著TIMPs 水平的增加［15］，進而導致ECM 難以溶解，加重HF。董向前等［49］將不同劑量人參皂苷Rg1干預CCl4所致HF 大鼠，通過光鏡和電鏡觀察實驗大鼠肝組織的病理變化，結(jié)果顯示人參皂苷Rg1作為三七總皂苷中抗HF 的主要單體成分，可減輕HF 大鼠肝細胞脂肪空泡變性程度、減少HSC周圍和Disse 間隙的膠原纖維沉積，同時有助于膠原的吸收。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1和三七總皂苷很可能是通過降低肝組織中TIMP-1 mRNA 表達發(fā)揮抗HF 作用［50］。姜輝等［51］通過觀察三七總皂苷對HF 大鼠肝組織MMP-13 和TIMP-1 表達的影響發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷干預10 周后，能抑制肝組織TIMP-1 表達，同時升高MMP-13 蛋白與mRNA 表達，促進膠原的降解。

3 結(jié)語與展望

HF 作為大多數(shù)慢性肝病過程中的重要病理過程，如不能及時得到有效治療，將最終進展為肝硬化甚至是肝癌。尋找能夠有效控制HF，防止慢性肝病進展為肝硬化或肝癌，提高慢性肝病患者的生活質(zhì)量與生存率的藥物或治療手段，是近年來醫(yī)藥學家們研究的主要目標。

近些年來，中醫(yī)藥學辨證治療HF 具有良好的應用前景，中醫(yī)藥學者們正在不斷探索能夠有效治療HF 的中藥制劑。研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷類成分（包括三七總皂苷及其主要單體成分） 展現(xiàn)出了優(yōu)良的抗HF 作用，體外細胞實驗和體內(nèi)動物研究結(jié)果顯示，其作用機制主要包括增強機體的抗氧化能力以減少氧化應激損傷、下調(diào)炎癥細胞因子同時上調(diào)負反饋免疫調(diào)節(jié)因子、抑制肝細胞凋亡、保護肝臟線粒體以維持肝細胞的正常生理功能、抑制HSC 活化并誘導活化的HSC 凋亡、減少ECM 沉積并促進其降解等。由此可見，三七皂苷類成分治療HF 具有多成分、多靶點的特點。

抗HF 的研究道路可謂機遇與挑戰(zhàn)并存，多點分子靶向藥物以及中西醫(yī)結(jié)合治療可能是未來研究的熱點。