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    中華大蟾蜍皮化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性

    2023-11-23 10:58:02孟令杰孔慶宏呂慧婧黎成錦郭朝霞
    中成藥 2023年11期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞毒蟾蜍乙酸乙酯

    孟令杰,孔慶宏,姜 念,呂慧婧,黎成錦,郭朝霞,劉 云,3*

    (1.遵義醫(yī)科大學(xué),貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563000; 2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563000; 3.遵義醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563000)

    蟾蜍屬動(dòng)物有250 多種,分布于世界各地,我國(guó)有近10 種,主要有大蟾蜍華西亞種Bufobufo andrewsiSchmidt、大蟾蜍中華亞種Bufobufo gargarizansCantor 以及黑眶蟾蜍BufomelanostitusSchneider 三種[1]。其中,蟾皮為中華大蟾蜍和黑眶蟾蜍除去內(nèi)臟的干燥皮,是臨床常用中藥,具有清熱解毒、利水消腫的功效[2]?!侗静菥V目》 中記載蟾蜍皮主治惡瘡、破癥結(jié)、腫毒、腸頭挺出和一切惡腫[3]。我國(guó)民間多用蟾皮治療原發(fā)性肝癌、肺癌等,特別是以干蟾皮為原料制成的華蟾素注射液抗癌效果顯著,例如給癌癥晚期患者靜脈滴注華蟾素注射液,在沒有顯著不良事件或疾病進(jìn)展的情況下,40%患者病情平穩(wěn)或顯示出輕微的腫瘤體積收縮[4-5]?,F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究表明,蟾皮具有抗腫瘤、強(qiáng)心等作用[6-8],其化學(xué)成分主要包括蟾蜍甾烯類、生物堿類[9-14]。為進(jìn)一步完善蟾皮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本研究采用多種色譜學(xué)方法和波譜學(xué)技術(shù)對(duì)中華大蟾蜍皮95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行研究,從中發(fā)現(xiàn)1 個(gè)結(jié)構(gòu)新穎且具有顯著抗結(jié)腸癌活性的蟾蜍甾烯類化合物。

    1 材料

    Bruker AVANCE-500 MHz NMR 核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker 公司); Agilent 1260/6120 液質(zhì)聯(lián)用-單四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Aglient 公司); LCMSIT-TOF 質(zhì)譜儀(日本島津公司); GX-281 全自動(dòng)制備液相色譜(法國(guó)Gilson 公司); 半制備HPLC色譜柱(10 mm×250 mm,5 μm,sunfire C18,美國(guó)Waters 公司); 制備型HPLC 色譜柱[30 mm×150 mm,5 μm,XB-C8,月旭科技(上海) 股份有限公司]; 中壓制備液相色譜系統(tǒng) (瑞士Buchi 公司); N1200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (日本EYELA 公司);Sephadex LH-20 凝膠(美國(guó)GE 公司); DLK-5010快速低溫冷卻循環(huán)機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司); SHZ-D (Ⅲ) 循環(huán)水式多用真空泵(河南予華儀器有限公司); BS-100A 自動(dòng)部分收集器(上海滬西電器有限公司); SpectraMAX i3x 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司); 200 ~300目柱層析硅膠、GF254薄層板(青島海洋化工有限公司)。中華大蟾蜍皮購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng),經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)宋長(zhǎng)偉博士鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor 的干燥皮。

    人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、HT-29 (上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司); 五氟尿嘧啶(5-FU,上海麥克林生化科技股份有限公司); 胎牛血清(以色列BI 公司); PBS (北京索萊寶公司); SRB、DMSO (美國(guó)Sigma 公司)。

    2 提取與分離

    取中華大蟾蜍皮20 kg 粉碎,95%乙醇20 L 加熱回流提取3 次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮得浸膏1 kg,將浸膏加水混懸至5 000 mL,依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取,減壓濃縮后得石油醚部位(95 g) 和乙酸乙酯部位(220 g)。

    取乙酸乙酯部位200 g,經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚-乙酸乙酯(1 ∶0 ~0 ∶1) 梯度洗脫,得到Fr.1~Fr.16。Fr.12 (26 g) 經(jīng)ODS 柱分離,以甲醇-水(1 ∶1 ~1 ∶0) 梯度洗脫,得到Fr.12.1 ~Fr.12.6。Fr.12.3 (2.8 g) 經(jīng)制備HPLC 純化,以甲醇-水(3 ∶7 ~1 ∶0) 梯度洗脫 (體積流量8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm),得到Fr.12.3.1 ~Fr.12.3.6。Fr.12.3.2 (1.3 g) 經(jīng)Sephadex LH-20柱分離,以二氯甲烷-甲醇 (1 ∶1) 洗脫,得到Fr.12.3.2.1~Fr.12.3.2.4。Fr.12.3.2.1 (18 mg)經(jīng)半制備HPLC 純化,以24% 乙腈洗脫(體積流量2.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm),得到化合物1(3.7 mg,tR=88 min); Fr.12.3.2.4 (32 mg) 經(jīng)反相半制備HPLC 純化,以25% 乙腈洗脫(體積流量2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm),得到化合物5(0.7 mg,tR=75 min)、4 (1.8 mg,tR=80 min)。Fr.10 (14.8 g) 經(jīng)Sephadex LH-20 柱分離,以甲醇洗脫,得到 Fr.10.1 ~ Fr.10.10。Fr.10.4(2.5 g) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-甲醇(1 ∶0~0 ∶1) 梯度洗脫,得到Fr.10.4.1 ~Fr.10.4.6。Fr.10.4.4 (1.1 g) 經(jīng)ODS 柱分離,以甲醇-水(4 ∶6~1 ∶ 0) 梯度洗脫,得到Fr.10.4.4.1 ~Fr.10.4.4.6。Fr.10.4.4.1 (58 mg) 經(jīng)制備HPLC純化,以54%甲醇洗脫(體積流量5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm),得到化合物2 (1.9 mg,tR=101 min); Fr.10.4.4.3 經(jīng)制備HPLC 純化,以55%甲醇洗脫(體積流量5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm),得到化合物3 (1.9 mg,tR=101 min)。

    3 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1: 白色無(wú)定型粉末,ESI-MSm/z:481 [M+Na]+,939 [2M+Na]+,HR-ESI-MSm/z:481.219 5 [M+Na]+,分子式C26H34O7。[α]20D+10.8 (c1.0,CH3OH); UV (CH3OH)λmaxlog 203 (3.47),212 (2.45),294 (2.75) nm;3 414,3 082,2 925,1 725,1 633,1 536,1 430,1 378,1 266,1 123,1 044,954,789,615 cm-1。1H-NMR、13C-NMR 譜顯示結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)六元不飽和內(nèi)酯環(huán) [δH7.36 (brs,H-21),8.01 (brd,J=9.8 Hz,H-22),6.23 (d,J=9.8 Hz,H-23);δC118.3 (C-20),153.5 (C-21),150.8 (C-22),114.1 (C-23),164.0 (C-24)];2 個(gè)角甲基 [δH0.81 (s,H-18),δC17.4;δH0.91 (s,H-19),δC16.6]; 3 個(gè)連氧次甲基[δH3.93 (s,H-2),δC68.3;δH3.75 (d,J=1.2 Hz,H-15),δC60.8;δH5.47 (dd,J=9.4,1.2 Hz,H-16),δC76.5]; 2 個(gè)連氧季碳 [δC75.6(C-5),73.5 (C-14)]; 1 個(gè)乙酰基 [δH1.85(s,H-26),δC20.3 (C-26),171.6 (C-25)]。根據(jù)以上信息,結(jié)合前期從蟾皮中分離鑒定化合物的情況[15-18],初步推斷化合物1 具有蟾蜍甾烯母核。在HMBC 譜中,可觀察到H-1 與C-2,H-2 與C-3,H-3 與C-5,H-19 與C-1、C-5 的相關(guān)信號(hào),表明2 個(gè)羥基分別位于C-2、C-5 位; 同時(shí),HMBC譜還顯示H-8 與C-13、C-14,H-15 與C-14、C-17,H-18 與C-12、C-13、C-17 的相關(guān)信號(hào),提示結(jié)構(gòu)中存在14β,15β-環(huán)氧片段; 此外,H-16 與C-20、C-25,H-26 與C-25 的相關(guān)信號(hào)確定乙酰基片段位于C-16 位。綜上所述,化合物1 的平面結(jié)構(gòu)見圖1。在NOESY 譜中,可觀察到H-2 與H-4b,H-9與H-2,H-7b、H-17、H-7b 與H-15、H-16 的相關(guān)信號(hào),提示上述質(zhì)子均為α 構(gòu)型; 同時(shí)可觀察到H-8 與H-18、H-19 的相關(guān)信號(hào),提示上述質(zhì)子為β 構(gòu)型。見表1、圖2。確定化合物1 為 (2β,5β,14β,15β,16β) -2,15-二羥基-14,15-環(huán)氧-16-乙?;?蟾蜍甾-20,22-二烯。

    表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR datas of compound 1

    圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1

    圖2 化合物1 的1H-1HCOSY、HMBC、NOESY 相關(guān)譜圖Fig.2 1H-1HCOSY,HMBC,NOESY correlation spectra of compound 1

    化合物2: 白色無(wú)定形粉末,ESI-MSm/z:403.3 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.98 (1H,dd,J=9.7,2.6 Hz,H-22),7.41(1H,d,J=2.6 Hz,H-21),6.27 (1H,d,J=9.7 Hz,H-23),4.12 ( 1H,m,H-3),3.76(1H,m,H-3),2.53 (1H,dd,J=9.5,6.0 Hz,H-17),1.07 (3H,s,19-CH3),0.70 (3H,s,18-CH3);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:164.8 (C-24),150.5 (C-21),149.3 (C-22),125.0 (C-20),115.4 (C-23),86.0 (C-14),74.8 (C-1),69.4 (C-3),52.2 (C-17),49.6(C-13),43.1 (C-8),41.7 (C-12),41.2 (C-10),38.7 (C-9),34.3 (C-4),33.1 (C-15),33.0 (C-2),31.8 (C-5),29.8 (C-16),27.4(C-6),22.5 (C-7),22.2 (C-11),19.4 (C-19),17.3 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19] 報(bào)道基本一致,故鑒定為1β-羥基蟾毒靈。

    化合物3: 白色無(wú)定形粉末,ESI-MSm/z:401.3 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:9.58 (1H,m,H-19),8.02 (1H,dd,J=9.6,2.6 Hz,H-22),7.45 (1H,d,J=2.6 Hz,H-21),6.30 (1H,d,J=9.6 Hz,H-23),4.11(1H,m,H-3),3.76 (1H,m,H-3),2.58(1H,dd,J=9.5,6.5 Hz,H-17),0.70 (3H,s,18-CH3);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:208.1 (C-19),164.8 (C-24),150.5 (C-21),149.4 (C-22),125.0 (C-20),115.4 (C-23),85.7 (C-14),66.5 (C-3),52.3 (C-17),52.1(C-10),49.7 (C-13),43.3 (C-8),41.8 (C-12),36.0 (C-9),33.2 (C-4),32.6 (C-15),30.4 (C-5),29.7 (C-16),29.3 (C-6),27.0(C-2),22.5 (C-7),22.2 (C-1),22.2 (C-11),17.1 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20] 報(bào)道基本一致,故鑒定為19-oxobufalin。

    化合物4: 白色無(wú)定形粉末,ESI-MSm/z:413.3 [M-H]-。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.95 (1H,dd,J=9.6,2.6 Hz,H-22),7.59(1H,d,J=2.6 Hz,H-21),6.30 (1H,d,J=9.6 Hz,H-23),3.80 (1H,dd,J=9.7,6.1 Hz,H-17),3.60 (1H,m,H-3),2.78 (1H,dd,J=12.7,5.4 Hz,H-17),1.20 (3H,s,19-CH3),0.77 (3H,s,18-CH3);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 201.9 ( C-12),164.5 ( C-24),151.8 (C-21),149.1 (C-22),142.6 (C-11),132.9 (C-9),123.2 (C-20),115.7 (C-23),83.6 (C-14),71.6 (C-3),60.5 (C-13),45.2 (C-17),44.3 (C-5),42.5 (C-10),41.1(C-8),39.8 (C-4),39.2 (C-1),35.3 (C-2),34.0 (C-15),29.0 (C-16),28.7 (C-19),27.4(C-6),22.7 (C-7),16.7 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8] 報(bào)道基本一致,故鑒定為 (3α,5β,14β) -3,11,14-trihydroxy-12-oxo-bufa-9 (11),20,22-trienolide。

    化合物5: 白色無(wú)定形粉末,ESI-MSm/z:423.1 [M+Na]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.60 (1H,dd,J=9.2,2.6 Hz,H-22),7.58(1H,brs,H-21),6.35 (1H,d,J=9.2 Hz,H-23),4.96 (1H,m,H-16),4.10 (1H,m,H-3),2.55 (1H,d,J=8.2 Hz,H-17),2.18(1H,d,J=3.2 Hz,H-4a),2.15 (1H,m,H-6a),1.80 (1H,m,H-6b),1.50 (1H,m,H-4b),0.95 (3H,s,19-CH3),0.83 (3H,s,18-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11] 報(bào)道基本一致,故鑒定為(3β,5β,16α) -3,5,16-trihydroxy-bufa-14,20,22-trienolide。

    4 細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)

    以五氟尿嘧啶(5-FU) 為陽(yáng)性對(duì)照,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、HT-29,以每孔8×103個(gè)的密度接種至96 孔板中,在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后取出,分別加入含供試藥物的培養(yǎng)液200 μL 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,加入預(yù)冷的10%TCA,4 ℃固定2 h,棄去TCA 固定液,用去離子水洗板5 次,甩盡多余的液體,室溫晾干,每孔加入100 μL 0.4% SRB 染料,室溫靜置20 min,用0.1%醋酸溶液洗去未與細(xì)胞蛋白結(jié)合的SRB 染料,共5 次,室溫晾干,每孔加入100 μL 10 mmol/L Tris 緩沖液,使其充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè),計(jì)算IC50值,結(jié)果見表2。由此可知,化合物1~4 對(duì)HCT-116、HT-29 細(xì)胞具有增殖抑制作用(P<0.05)。

    表2 各化合物細(xì)胞毒活性比較(±s,n=3)Tab.2 Comparison of cytotoxic effects of various compounds (±s,n=3)

    表2 各化合物細(xì)胞毒活性比較(±s,n=3)Tab.2 Comparison of cytotoxic effects of various compounds (±s,n=3)

    注: 與5-FU 比較,#P<0.05。

    化合物IC50/(μmol·L-1)HCT-116HT-29 1 2.67±2.14#9.80±3.29#2 0.08±0.03#1.17±0.99#3 0.36±0.07#0.24±0.11#4 2.11±0.10#0.45±0.13#5-FU32.23±26.1818.38±4.21

    5 討論

    本研究從中華大蟾蜍皮中分離鑒定了1 個(gè)新的蟾蜍甾烯類化合物(化合物1) 以及4 個(gè)已知類似物(化合物2~5)。由于樣品量所限,對(duì)化合物1~4 進(jìn)行了初步的藥效學(xué)評(píng)價(jià),結(jié)果表明化合物1 ~4均對(duì)結(jié)腸癌HCT-116 和HT-29 細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用,且效應(yīng)強(qiáng)于5-FU。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了蟾蜍類藥材化學(xué)成分的多樣性,為構(gòu)效關(guān)系的探討提供了證據(jù)。同時(shí),蟾皮化學(xué)成分豐富,其中的微量化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究。

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