桂枝茯苓丸對慢性阻塞性肺疾病小鼠氣道重塑的影響

張 真，楊億然，劉 雨，譚宇軍，吳 哲，譚光波，胡學(xué)軍，鄧秀娟*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208； 2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是一種以不可逆的氣流受限為特征的常見肺系疾病，氣道重塑是COPD 發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理特征，源自于氣道組織的反復(fù)損傷-修復(fù)過程，是導(dǎo)致患者氣流受限和激素抵抗的主要原因［1-3］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelialmesenchymal transition，EMT） 是指上皮細(xì)胞失去極性并轉(zhuǎn)化為可移動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)學(xué)改變包括上皮細(xì)胞連接和極性復(fù)合物的破壞，以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重組［4］。目前，EMT 已被認(rèn)為是許多呼吸系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)，與氣道纖維化、氣道重塑和隨后的氣流阻塞有關(guān)［5］。大量研究表明，核因子活化B 細(xì)胞的κ 輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB） 所介導(dǎo)的蝸牛同源蛋白（Snail） 是EMT、細(xì)胞粘附和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，NF-κB/Snail 通路在EMT中具有重要作用［6-8］，與COPD 氣道重塑密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，COPD 氣道重塑是在外來六淫之毒的持續(xù)作用下，肺絡(luò)受損，內(nèi)生痰瘀之毒，痹阻肺絡(luò)而成，“毒損肺絡(luò)” 是其關(guān)鍵病機(jī)［9-12］。桂枝茯苓丸出自《金匱要略》，是治療癥瘕積聚的經(jīng)典名方，具有活血化痰、消癥通絡(luò)的功效。因此，本研究以“毒損肺絡(luò)” 為理論基礎(chǔ)，探討桂枝茯苓丸對NF-κB/Snail 介導(dǎo)的EMT 的影響，進(jìn)而揭示其改善COPD 氣道重塑的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠40 只，體質(zhì)量18～22 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘） 2019-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號43072721100875058］，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK （湘） 2019-0009］，溫度22 ～24 ℃，相對濕度50% ～60%，晝夜12 h/12 h 交替照明，自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn) （倫理號 LLBH-202203140006）。

1.2 藥物與試劑 金圣牌香煙，由江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，焦油含量8 mg，煙氣煙堿含量0.8 mg，CO 含量9 mg。桂枝茯苓丸（國藥準(zhǔn)字Z20027562） 購自成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，按每100 丸（15 g） 加450 mL 蒸餾水的比例溶解（即每30 mL 藥液含1 g 藥物），現(xiàn)用現(xiàn)配。NF-κB抑制劑EVP4593 （貨號A4217，美國APExBIO 公司）； 4%多聚甲醛固定液（貨號BL539A，北京蘭捷柯科技有限公司）； 白細(xì)胞介素-8 （interleukin-8，IL-8） ELISA 試劑盒（貨號MU30010，武漢貝茵萊生物科技有限公司）； 白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6） ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA 試劑盒、兔單抗E-鈣粘蛋白、兔單抗Snail、兔單抗IκBα、小鼠單抗NF-κB、小鼠單抗β-actin （貨號KE10007、KE10002、E-cadherin、20874-1-AP、13099-1-AP、10268-1-AP、66535-1-Ig、66009-1-Ig，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）； 兔單抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、兔單抗p-IκBα、兔單抗p-NF-κB ［貨號ab124964、ab133462、ab76302，艾博抗（上海） 貿(mào)易有限公司］； 蘇木素伊紅染液、HRP 標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HPR 標(biāo)記羊抗兔二抗 （ 貨號 AWI0020b、AWS0001、AWS0002，長沙艾碧維生物科技有限公司）。

1.3 儀器 自制亞克力透明煙熏箱1.6 m×0.5 m×0.25 m （包含頂部和側(cè)面2 個(gè)直徑8 cm 的進(jìn)出氣孔），由上海易雕實(shí)業(yè)有限公司定制； LH-75 型管道風(fēng)機(jī)（深圳市世化電器照明有限公司）； PFTMR 型小動(dòng)物肺功能檢測儀（上海塔望智能科技有限公司）； TS-1 型搖床、GL-88B 型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； H1650R 型臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀科教儀器有限公司）；JB-13 型磁力攪拌器、PHS-3C 型精密PH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）； PW-812 型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、MB-530 型多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）； DYY-60 型電泳儀、DYCZ-24DN 型電泳槽、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）； BioPrep-24 型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司）； ChemiScope6100 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) （上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、桂枝茯苓丸組、EVP4593 組、桂枝茯苓丸+EVP4593 組，每組8 只，模型組和給藥組采用被動(dòng)吸煙的方式造模，每天熏煙2 次，每次使用20 支香煙，持續(xù)60 min，中途間隔4 h，每熏煙6 d，休息1 d，總計(jì)60 d。

2.2 給藥 小鼠給藥劑量參考人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表［13］，得到桂枝茯苓丸組灌胃劑量為273 mg/kg，EVP4593 組皮下注射劑量為1 mg/kg［14］。各組在第61 天（即造模結(jié)束后第1天） 開始灌胃或（和） 皮下注射給藥，每天1 次，連續(xù)14 d，其中桂枝茯苓丸+EVP4593 組在皮下注射EVP4593 后立即灌胃桂枝茯苓丸藥液，空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。灌胃過程中，模型組死亡2 只，桂枝茯苓丸組死亡1 只，桂枝茯苓丸+EVP4593 組死亡1 只。

2.3 肺功能指標(biāo)檢測 小鼠腹腔注射1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg） 麻醉后，分離暴露氣管，進(jìn)行氣管插管固定，使用小動(dòng)物肺功能檢測儀測定每分鐘通氣量（minute ventilation volume，MV）、吸氣峰流量（peak inspiratory flow，PIF） 及呼氣峰流量（peak expiratory flow，PEF）。肺功能測定過程中，空白組失敗2 只，模型組失敗1 只，EVP4593 組失敗2 只，桂枝茯苓丸+EVP4593 組失敗1 只。

2.4 肺組織病理檢查 取小鼠左肺組織于4% 多聚甲醛中固定24 h，脫水后石蠟包埋切片。HE 染色觀察肺組織病理形態(tài)，肺部炎癥的嚴(yán)重程度通過炎癥評分進(jìn)行半定量分析［15］，定義為0 分，無炎癥； 1 分，輕度炎癥，偶見炎性細(xì)胞灶； 2 分，中度炎癥，大部分肺泡、支氣管或血管壁有1 ～5 層炎性細(xì)胞； 3 分，重度炎癥，大部分肺泡、支氣管或血管壁有5 層以上炎性細(xì)胞。每張切片取5 個(gè)視野的炎癥評分均值作為最終結(jié)果。按照文獻(xiàn)［16］報(bào)道方法，選取最小內(nèi)徑/最大內(nèi)徑＞0.5，且基底膜周徑＜2 000 μm 的支氣管作為檢測對象，通過Image J （v1.53） 軟件測定氣道管壁總面積（wall area of bronchial tube，WAt） 和支氣管基底膜周徑（perimeter of basement membrane，Pbm），以Pbm為基值標(biāo)準(zhǔn)化，以WAt 與Pbm 比值代表氣道管壁厚度，每張切片選取5 個(gè)支氣管進(jìn)行測量。

Masson 染色觀察氣道纖維化改變，其中膠原纖維呈藍(lán)色。通過Image J （v1.53） 軟件測定藍(lán)染面積，以Pbm 為基值標(biāo)準(zhǔn)化，測得藍(lán)染區(qū)平均厚度（μm2/μm），每張切片選取5 個(gè)支氣管進(jìn)行測量。

2.5 ELISA 法檢測肺組織IL-6、IL-8 和TNF-α 水平 稱取100 mg 肺組織，剪碎后放入組織研磨器（勻漿管） 中，加入1 mL 1× PBS 溶液，制成勻漿，置于-20 ℃過夜，經(jīng)反復(fù)凍融2 次破壞細(xì)胞膜，2～8 ℃、5 000×g 離心5 min，取上清液備用。嚴(yán)格按ELISA 試劑盒說明書操作，檢測IL-6、IL-8和TNF-α 水平。

2.6 Western blot 法檢測肺組織EMT 和NF-κB/Snail 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 稱取25 mg 肺組織，加入300 μL RIPA 裂解液，在生物樣品均質(zhì)儀中研磨為組織勻漿，冰上裂解10 min，12 000 r/min 離心15 min，提取上清液，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE 凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加稀釋后的一抗E-cadherin （1 ∶5 000）、α-SMA （1 ∶1 000）、Snail （1 ∶500）、IκBα （1 ∶1 000）、p-IκBα （1 ∶10 000）、NF-κB （1 ∶1 000）、p-NF-κB（1 ∶1 000）、β-actin （1 ∶5 000），4 ℃孵育過夜，次日室溫放置30 min，1×PBST 洗膜3 次，每次15 min，加稀釋后的二抗（1 ∶5 000） 室溫孵育90 min，1×PBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，通過Image J（v1.53） 軟件測定各條帶光密度值，以β-actin 為內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布或（和） 方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桂枝茯苓丸對COPD 小鼠肺功能的影響 與空白組比較，模型組小鼠MV、PIF 和PEF 值降低（P＜0.05）； 與模型組比較，各給藥組小鼠MV、PIF 和PEF 值升高（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 組最為顯著（P＜0.05），而桂枝茯苓丸組和EVP4593 組間比較無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠肺功能比較（±s）Tab.1 Comparison of mouse lung function levels in each group （±s）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與桂枝茯苓丸組比較，△P＜0.05； 與EVP4593 組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只MV/mLPEF/（mL·s-1）PIF/（mL·s-1）空白組648.62±3.214.95±0.343.77±0.29模型組519.32±5.12*2.09±0.39*2.06±0.24*桂枝茯苓丸組730.62±4.07＃3.51±0.42＃2.54±0.22＃EVP4593 組632.41±2.83＃3.54±0.21＃2.62±0.27＃桂枝茯苓丸+EVP4593 組640.25±3.67?！鳌?.09±0.15?！鳌?.24±0.17?！鳌?/p>

3.2 桂枝茯苓丸對COPD 小鼠肺組織病理形態(tài)的影響 空白組小鼠肺泡腔完整，黏膜上皮細(xì)胞無脫離壞死，黏膜下腺體無增生，氣道周圍少見炎性細(xì)胞，氣管腔內(nèi)無分泌物，基底膜和平滑肌無增生；與空白組比較，模型組小鼠肺泡間隔增厚，支氣管的基底膜和平滑肌增生，支氣管壁增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤，氣管腔內(nèi)可見上皮細(xì)胞脫離或分泌物，并存在不同程度的狹窄，肺組織炎癥評分和氣道管壁厚度均增加（P＜0.05）； 與模型組比較，各給藥組小鼠上述病理改變減輕，肺組織炎癥評分和氣道管壁厚度均降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 組最為顯著（P＜0.05），而桂枝茯苓丸組和EVP4593 組間比較無明顯差異（P＞0.05），見圖1、表2。

表2 各組小鼠肺組織炎癥評分和氣道管壁厚度比較（±s）Tab.2 Comparison of mouse lung inflammation score and airway wall thickness in each group （±s）

表2 各組小鼠肺組織炎癥評分和氣道管壁厚度比較（±s）Tab.2 Comparison of mouse lung inflammation score and airway wall thickness in each group （±s）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與桂枝茯苓丸組比較，△P＜0.05； 與EVP4593 組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只炎癥評分/分氣道管壁厚度/（WAt·Pbm-1）空白組80.00±0.0016.25±1.31模型組63.00±0.76*41.51±2.35*桂枝茯苓丸組72.00±0.76＃34.43±1.95＃EVP4593 組81.75±0.71＃33.51±1.68＃桂枝茯苓丸+EVP4593 組71.00±0.76?！鳌?4.59±1.70?！?/p>

3.3 桂枝茯苓丸對COPD 小鼠肺組織膠原纖維的影響 與空白組比較，模型組小鼠氣道藍(lán)染區(qū)厚度增加（P＜0.05），膠原纖維增多； 與模型組比較，各給藥組小鼠氣道藍(lán)染區(qū)厚度減?。≒＜0.05），膠原纖維減少，其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 組最為顯著（P＜0.05），而桂枝茯苓丸組和EVP4593 組間比較無明顯差異（P＞0.05），見圖2、表3。

圖2 各組小鼠肺組織Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining of mouse lung tissue for each group （×100）

表3 各組小鼠氣道藍(lán)染區(qū)厚度比較（±s）Tab.3 Comparison of the thickness of mouse airway blue staining area in each group （±s）

表3 各組小鼠氣道藍(lán)染區(qū)厚度比較（±s）Tab.3 Comparison of the thickness of mouse airway blue staining area in each group （±s）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與桂枝茯苓丸組比較，△P＜0.05； 與EVP4593 組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只氣道藍(lán)染區(qū)厚度/（μm2·μm-1）空白組87.25±1.01模型組631.51±2.35*桂枝茯苓丸組718.23±1.95＃EVP4593 組817.91±1.68＃桂枝茯苓丸+EVP4593 組711.59±1.70?！鳌?/p>

3.4 桂枝茯苓丸對COPD 小鼠肺組織IL-6、IL-8 和TNF-α 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠肺組的IL-6、IL-8 和TNF-α 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織IL-6、IL-8 和TNF-α 水平降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 組最為顯著（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠肺組織IL-6、IL-8 和TNF-α 水平比較（pg/mL，±s）Tab.4 Comparison of IL-6，IL-8 and TNF-α levels in mouse lung tissue of each group （pg/mL，±s）

表4 各組小鼠肺組織IL-6、IL-8 和TNF-α 水平比較（pg/mL，±s）Tab.4 Comparison of IL-6，IL-8 and TNF-α levels in mouse lung tissue of each group （pg/mL，±s）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與桂枝茯苓丸組比較，△P＜0.05； 與EVP4593 組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只IL-6IL-8TNF-α空白組828.74±2.9042.26±3.2431.46±4.19模型組686.77±7.31*88.72±5.19*72.44±6.82*桂枝茯苓丸組760.61±6.95＃65.64±3.61＃46.21±4.07＃EVP4593 組872.11±6.13?！?7.13±4.59?！?2.25±5.38?！鞴鹬蜍咄?EVP4593 組750.07±4.74?！鳌?4.82±5.70＃△▲41.72±4.27?！鳌?/p>

3.5 桂枝茯苓丸對COPD 小鼠肺組織EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠肺組織E-cadherin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），α-SMA 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織E-cadherin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），α-SMA 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 組最為顯著 （P＜0.05），見圖3、表5。

圖3 各組小鼠肺組織EMT 相關(guān)蛋白條帶圖Fig.3 Bands of EMT related proteins in mouse lung tissues of each group

表5 各組小鼠肺組織EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of EMT-related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

表5 各組小鼠肺組織EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of EMT-related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與桂枝茯苓丸組比較，△P＜0.05； 與EVP4593 組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只 E-cadherinα-SMA空白組80.53±0.120.07±0.01模型組60.12±0.03*0.63±0.04*桂枝茯苓丸組70.28±0.09＃0.30±0.02＃EVP4593 組80.27±0.06＃0.39±0.02?！鞴鹬蜍咄?EVP4593 組70.38±0.04?！鳌?.27±0.03＃△▲

3.6 桂枝茯苓丸對COPD 小鼠肺組織NF-κB/Snail通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠肺組織p-IκBα、p-NF-κB 和Snail 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p-IκBα/IκBα 和p-NF-κB/NF-κB 比值升高（P＜0.05）； 與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織p-IκBα、p-NF-κB 和Snail 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p-IκBα/IκBα 和p-NF-κB/NF-κB 比值降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 組最為顯著（P＜0.05），見圖4、表6。

圖4 各組小鼠肺組織NF-κB/Snail 通路相關(guān)蛋白條帶圖Fig.4 Bands of NF-κB/Snail pathway related proteins in mouse lung tissues of each group

表6 各組小鼠肺組織NF-κB/Snail 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.6 Comparison of NF-κB/Snail pathway related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

表6 各組小鼠肺組織NF-κB/Snail 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.6 Comparison of NF-κB/Snail pathway related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與桂枝茯苓丸組比較，△P＜0.05； 與EVP4593 組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只p-IκBαp-IκBα/IκBαp-NF-κBp-NF-κB/NF-κBSnail空白組80.13±0.010.17±0.010.10±0.020.19±0.010.12±0.01模型組60.66±0.06*0.88±0.07*0.57±0.04*0.95±0.07*0.58±0.05*桂枝茯苓丸組70.37±0.04＃0.48±0.06＃0.28±0.03＃0.55±0.06＃0.32±0.03＃EVP4593 組80.44±0.03?！?.59±0.04?！?.37±0.02?！?.73±0.06＃△0.43±0.05?！鞴鹬蜍咄?EVP4593 組70.27±0.02?！鳌?.39±0.06?！鳌?.21±0.02＃△▲0.44±0.03?！鳌?.26±0.01?！鳌?/p>

4 討論

肺不僅多氣，還是多血、多津之臟，其性易瘀易滯，在六淫等外來之毒的作用下，肺絡(luò)受損，反復(fù)外感，留痰生瘀，導(dǎo)致絡(luò)氣不暢，日久痰瘀化毒，積伏絡(luò)脈，痹阻肺絡(luò)，形成COPD 氣道重塑的病理狀態(tài)［10］。桂枝茯苓丸出自張仲景的《金匱要略》，由桂枝、茯苓、赤芍、牡丹皮及桃仁組成，是活血化痰、消癥通絡(luò)之名方［17］，可使瘀祛痰消、絡(luò)通毒除，氣道通暢，其應(yīng)用符合“毒損肺絡(luò)”的中醫(yī)病機(jī)思路。

COPD 氣道重塑涉及網(wǎng)狀基底膜增厚、膠原沉積、氣道纖維化和平滑肌細(xì)胞增生等過程［18］。各種炎癥因子和生長因子參與了氣道的頻繁損傷-修復(fù)，慢性炎癥是氣道重塑的重要原因［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COPD 小鼠肺組織IL-6、IL-8 和TNF-α水平升高，同時(shí)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 膠原沉積，符合中醫(yī)中“毒損肺絡(luò)、痰瘀痹阻” 的認(rèn)識； 經(jīng)桂枝茯苓丸干預(yù)后，COPD 小鼠以上指標(biāo)得到明顯改善，提示桂枝茯苓丸可解痰瘀之毒，暢通肺絡(luò)痹阻。

EMT 是上皮細(xì)胞失去其細(xì)胞粘附和頂端-基底極性的特征，并獲得遷移、侵襲和產(chǎn)生ECM 成分的間充質(zhì)細(xì)胞特性［20］。EMT 的生物標(biāo)志包括Ecadherin 的丟失，和（或） 間充質(zhì)標(biāo)志物的增多，如N-鈣粘蛋白、波形蛋白和α-SMA 等［21］。研究表明，EMT 所引發(fā)的上皮細(xì)胞功能異常在COPD 氣道重塑中起重要作用［22］。

NF-κB 是一種具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下與IκBα 形成復(fù)合體，處于被抑制狀態(tài)。一些胞外信號 （包括IL-6［23］、IL-8［24］和TNF-α［6］等炎性因子） 在膜受體的介導(dǎo)下，可激活I(lǐng)κB 激酶，進(jìn)而磷酸化IκBα，使其泛素化降解，最終導(dǎo)致NF-κB 解除抑制而激活，易位到細(xì)胞核以促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)［25］。Snail 蛋白是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，已被證實(shí)可直接作用于E-cadherin 并抑制其表達(dá)，還可上調(diào)Vimentin 和Fibronectin 等間充質(zhì)標(biāo)志物，從而誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生［26］?，F(xiàn)有研究表明，NF-κB 可通過直接激活、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和阻斷泛素化降解等途徑增加Snail 的水平［6，8，26-28］，NF-κB/Snail 通路在EMT 中的作用已得到廣泛共識。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COPD 小鼠存在氣道重塑，同時(shí)伴有p-IκBα、p-NF-κB 和Snail 表達(dá)增加，p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB 比值升高，E-cadherin 表達(dá)降低和α-SMA 表達(dá)增加，并且以上指標(biāo)均可被EVP4593 （NF-κB 信號阻斷劑） 所抑制，提示NFκB/Snail 通路介導(dǎo)了EMT 的發(fā)生，并可能是COPD小鼠氣道重塑的重要原因。桂枝茯苓丸組與EVP4593 組結(jié)果相似，提示桂枝茯苓丸可通過抑制NF-κB/Snail 通路介導(dǎo)的EMT 來改善COPD 氣道重塑。兩者合用療效比單用更好，提示桂枝茯苓丸的治療機(jī)制可能涉及多種途徑，還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究證實(shí)了NF-κB/Snail 信號通路所介導(dǎo)的EMT 參與了COPD 氣道重塑，而桂枝茯苓丸可能通過“活血化痰、消癥通絡(luò)” 改善以上過程。