不同新窖泥生化指標(biāo)在發(fā)酵馴化過程的變化趨勢(shì)及比較分析

姚亞林，付智勇，劉洪強(qiáng)，趙鑫帥，林 東，2*，李 浩*

(1.四川水井坊股份有限公司,四川成都 610000；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(白酒監(jiān)管技術(shù))，四川成都 611731)

泥窖是濃香型白酒釀造重要且獨(dú)特的發(fā)酵容器，在行業(yè)中常有“酒好還須窖池老”的說法[1]。泥窖的獨(dú)特性在于能夠?yàn)榫企w帶來以己酸乙酯為主體的復(fù)合香氣，使酒體風(fēng)味更加豐滿、聞香愉悅，這主要來源于窖泥中眾多復(fù)雜的功能微生物菌群發(fā)酵代謝[2]。因此窖泥在釀造中起著重要作用，既是微生物菌群的天然營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，也是白酒風(fēng)味產(chǎn)生的重要載體[3-4]。隨著行業(yè)發(fā)展，生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大對(duì)窖泥用量的需求與日俱增，窖泥的培養(yǎng)制作和老熟的技術(shù)也是白酒釀造工藝中關(guān)鍵的一環(huán)。施思等[5]采用化學(xué)法和物理法對(duì)窖泥進(jìn)行馴化，均起到增己降乳的功效，使綜合酒質(zhì)得到提高；有研究者[6-7]在人工窖泥中加入泥炭來探究其對(duì)窖泥制作的效果，發(fā)現(xiàn)泥炭有助于提升窖泥保水性，但不利于后期芽孢桿菌的培養(yǎng)；姜雨函等[8]對(duì)不同配方人工窖泥在發(fā)酵馴化過程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，水分、pH值、腐殖質(zhì)等指標(biāo)對(duì)窖泥培養(yǎng)有著重要影響；李學(xué)思等[9]對(duì)新窖連續(xù)使用過程中的窖泥指標(biāo)追蹤發(fā)現(xiàn)，窖泥水分、pH 值和速效鉀呈先增后減的變化趨勢(shì)，其他指標(biāo)也呈規(guī)律性變化。好的窖泥不僅在于其理化指標(biāo)的豐富程度，更為核心的是功能菌群豐度和己酸代謝能力[10]。

培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)窖泥，是新建窖池快速成熟產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)酒的重要條件。本研究設(shè)計(jì)了4 種不同窖泥配方，將4 種窖泥按傳統(tǒng)方式用于建新窖，連續(xù)投糧發(fā)酵，跟蹤窖泥的理化指標(biāo)和微生物生物量情況，結(jié)合每輪次發(fā)酵原酒風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，綜合分析窖泥在自然老熟馴化過程的質(zhì)量動(dòng)態(tài)變化，解析不同窖泥的特性和差異性，以期為窖泥制作和馴化提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

制作窖泥用原料：黃泥土、優(yōu)質(zhì)老窖泥、曲粉、優(yōu)質(zhì)成熟己酸菌液、池塘淤泥、魚骨等。

試劑及耗材：重鉻酸鉀、酒石酸銻鉀、亞硝基鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、高氯酸鈉、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、濃鹽酸、硼酸、NH3Cl、鉬酸銨、氟化銨、酚酞等，均為分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

儀器設(shè)備：色譜儀（安捷倫）、凱氏定氮儀、油浴鍋（奧斯豪儀器有限公司）、紫外分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司UV-2400）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥制作

根據(jù)本廠生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)4 種窖泥制作配方（A、B、C、D），按方法做好新窖泥后待用。

1.2.2 發(fā)酵

選擇新建窖池12 口，分別用A、B、C、D 4 種窖泥做窖池3 口，窖壁成型后，先用相同來源的丟糟填窖30 d，吸附泥土中的異雜味，起窖清窖后等待試驗(yàn)進(jìn)行。

按照傳統(tǒng)濃香型發(fā)酵工藝進(jìn)行投糧發(fā)酵，來源一致的糧糟做母糟，糧、糠、水、曲用量都保持一致，發(fā)酵周期60 d，進(jìn)行多輪次續(xù)糟發(fā)酵。

1.2.3 窖泥理化指標(biāo)分析

窖泥質(zhì)量品質(zhì)可通過感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物種群進(jìn)行表征，對(duì)連續(xù)發(fā)酵過程的理化指標(biāo)研究可用于闡述窖泥連續(xù)發(fā)酵下的質(zhì)量變化。窖泥水分和pH 采用烘干法和精密pH 計(jì)檢測(cè)，總氮通過凱氏定氮法檢測(cè)，有效磷測(cè)定采用0.5 mol/L 碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，窖泥腐殖質(zhì)檢測(cè)采用焦磷酸鈉-氫氧化鈉提取重絡(luò)酸鉀氧化容量法，上述方法均參考《釀酒分析與檢測(cè)》[11]和《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[1]；窖泥中己酸含量通過高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[12]；窖泥中芽孢桿菌傳統(tǒng)可培養(yǎng)計(jì)數(shù)采用MRS培養(yǎng)基，參照參考文獻(xiàn)[13]操作。

建筑工程整個(gè)造價(jià)管理中，決策階段造價(jià)管理非常重要，因項(xiàng)目決策內(nèi)容對(duì)造價(jià)有著決定性影響，所以建設(shè)企業(yè)要分析各方面因素，深入分析項(xiàng)目市場(chǎng)需求與發(fā)展前景等，以此科學(xué)確定項(xiàng)目建設(shè)規(guī)模，并通過科學(xué)計(jì)算方法估算工程投資。工程決策階段投資預(yù)測(cè)，不能局限于靜態(tài)投資，還要對(duì)工程項(xiàng)目動(dòng)態(tài)投資情況做好充分的預(yù)測(cè)。

每輪次發(fā)酵結(jié)束后，緩火流酒，分段摘酒，除酒頭外，取前段20 kg 綜合酒樣，分析主體風(fēng)味化合物己酸乙酯的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方窖泥的水分和pH變化規(guī)律

窖泥的水分是微生物正常繁殖代謝的重要基礎(chǔ)，適當(dāng)?shù)乃质墙涯嗥焚|(zhì)的前提條件。對(duì)不同配方的窖泥在連續(xù)發(fā)酵過程中水分變化趨勢(shì)研究見圖1，同期比較，A、B 配方窖泥的保水性較好于C、D。窖泥水分呈先升后降再緩慢上升的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，其波動(dòng)變化的原因可能是初始的發(fā)酵產(chǎn)生大量自由水，隨即被窖泥吸收，隨著發(fā)酵延長(zhǎng)，微生物馴化對(duì)水分的需求、糟醅降解物質(zhì)的附著、窖池底泥對(duì)水分的吸收等多個(gè)反應(yīng)共同作用，水分呈動(dòng)態(tài)變化，而最終其持水性與初始狀態(tài)相差不遠(yuǎn)，表明微生物菌群形成一定程度穩(wěn)態(tài)，并且在窖泥制作前端已經(jīng)找到品質(zhì)穩(wěn)定窖泥的水分要求。長(zhǎng)期馴化使得功能微生物菌群趨于穩(wěn)定，而微生物的穩(wěn)定性以水分穩(wěn)定作為表現(xiàn)。

圖1 不同配方窖泥的水分變化

適合的pH 值不僅可促進(jìn)酒精發(fā)酵，也有利于窖內(nèi)微生物繁殖代謝[14]。由圖2 可知，隨泥窖連續(xù)發(fā)酵，4種配方的pH隨窖泥發(fā)酵周期延長(zhǎng)呈下降而后不同的趨勢(shì)，在第7 輪發(fā)酵后，C、D 與A、B 呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），其中B、D 配方窖泥初始pH 值基本一致，多輪發(fā)酵后的pH 值呈顯著差異（P＜0.05）。pH 值與窖泥的多項(xiàng)指標(biāo)密切相關(guān)，pH 值能影響窖泥細(xì)菌總量，還能影響窖泥功能菌群梭菌綱細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[15]，當(dāng)pH 值低于4.0 時(shí)，不利于產(chǎn)己酸菌株生產(chǎn)己酸。本研究中窖泥整體都偏酸性，其中A、B配方窖泥發(fā)酵后的pH偏小。

圖2 不同配方窖泥的pH變化

2.2 不同配方窖泥的有效磷與腐殖質(zhì)變化規(guī)律

窖泥中的腐殖質(zhì)主要由有機(jī)質(zhì)成分與土壤復(fù)合轉(zhuǎn)化而來，能夠?yàn)椴糠治⑸锾峁┯幸娴纳L(zhǎng)環(huán)境，是豐富窖泥微生物豐度的重要因子，也起到離子交換作用、保水作用和緩沖作用[16]。由圖3可知，隨發(fā)酵進(jìn)行，各配方窖泥的腐殖質(zhì)含量變化規(guī)律基本一致；隨發(fā)酵輪次增加，腐殖質(zhì)呈先急劇下降，再緩慢增加的波動(dòng)變化趨勢(shì)。

圖3 不同配方窖泥腐殖質(zhì)含量變化

磷元素是微生物細(xì)胞的重要組成部分，微生物死亡分解后，會(huì)融入窖泥增加其有效磷含量。土壤中的有效磷除配料中帶入外，其余為微生物細(xì)胞分解產(chǎn)生，程偉[17]的研究表明有效磷含量與土壤中微生物的生物量和代謝物量呈正相關(guān)。由圖4 可知，各配方窖泥有效磷含量呈劇烈波動(dòng)變化，表明在前期連續(xù)發(fā)酵過程中，微生物活動(dòng)劇烈，大量微生物繁殖或者被淘汰，還未完全達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；在第6—7 輪次，C、D 的有效磷含量維持在低水平的狀態(tài)，A、B 的有效磷含量處于相反波動(dòng)的狀態(tài)，這一定程度上表征此階段微生物種群生物活動(dòng)劇烈。劉梅等[18]對(duì)窖泥指標(biāo)的研究表明，有效磷和腐殖質(zhì)只能作為判斷窖泥的一項(xiàng)指標(biāo)，與窖泥質(zhì)量好壞并無顯著聯(lián)系。本研究中腐殖質(zhì)和有效磷含量的波動(dòng)是連續(xù)發(fā)酵過程中微生物菌群的優(yōu)勝劣汰與定向馴化的表現(xiàn)。

圖4 不同配方窖泥有效磷含量變化

2.3 不同配方窖泥的氨態(tài)氮變化規(guī)律

氨態(tài)氮作為總氮的重要組成部分，可直接被窖泥微生物吸收利用，一定程度上反應(yīng)了窖泥對(duì)窖泥微生物代謝需氮的供給能力[19]。如圖5 所示，各配方窖泥氨態(tài)氮含量在前期發(fā)酵馴化過程中變化趨勢(shì)基本趨于一致；隨發(fā)酵輪次增加，初期窖泥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，其含量急劇下降，隨后趨于動(dòng)態(tài)平穩(wěn)狀態(tài)，可能是各輪次發(fā)酵殘余營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)累積的結(jié)果。

圖5 不同配方窖泥氨態(tài)氮含量變化

圖6 不同配方窖泥梭菌生物量變化

2.4 不同配方窖泥的梭菌生物量變化規(guī)律

2.5 不同配方窖泥發(fā)酵的原酒風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律

不同配方窖泥在連續(xù)發(fā)酵過程中，生成原酒中的己酸乙酯含量隨發(fā)酵輪次變化如圖7 所示，A、B配方窖泥投糧隨發(fā)酵輪次進(jìn)行，生成原酒的己酸乙酯含量呈先上升后緩降的變化趨勢(shì)，C、D的己酸乙酯含量呈先上升再下降再上升的變化趨勢(shì)，其中A、B 配方窖泥產(chǎn)酒的己酸乙酯含量在發(fā)酵6、7 輪次顯著高于C、D（P＜0.05）。結(jié)合梭菌生物量變化情況，表明在連續(xù)發(fā)酵過程中，A、B 配方窖泥在不斷馴化和累積產(chǎn)己酸菌群，更有利于產(chǎn)己酸菌群的累積和繁殖，其生物量相比于C、D更為豐富。

圖7 不同配方窖泥發(fā)酵原酒中己酸乙酯含量變化

3 結(jié)論

基于白酒現(xiàn)代化消費(fèi)升級(jí)，對(duì)優(yōu)質(zhì)基酒的需求量不斷提升，濃香型白酒生產(chǎn)始終以窖池為主[20]，老窖出好酒，窖池質(zhì)量（優(yōu)質(zhì)窖泥）對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味和品質(zhì)有著重要影響，而好的窖泥配方是做好窖泥的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，不同配方窖泥在連續(xù)多輪次發(fā)酵馴化過程中，窖泥的理化指標(biāo)隨之變化：4種窖泥的水分無顯著差異，C、D 窖泥在發(fā)酵第7 輪的pH 值顯著高于A、B 窖泥；A 窖泥有效磷含量累積顯著高于其他3 種窖泥，而腐殖質(zhì)、氨態(tài)氮含量的變化趨勢(shì)較為一致，其中氨態(tài)氮呈急劇下降后趨于平穩(wěn)；4 種窖泥的芽孢桿菌可培養(yǎng)活菌數(shù)上無明顯差別；在生產(chǎn)酒樣的己酸乙酯累積體現(xiàn)上，A、B窖泥顯著高于C、D，表明其在己酸乙酯的合成累積上可能占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

窖泥的有效磷、腐殖質(zhì)和氨態(tài)氮是為窖泥微生物提供營(yíng)養(yǎng)成分和保水性能等生存環(huán)境的重要因子，其含量會(huì)隨窖池不斷發(fā)酵馴化先下降，在發(fā)酵過程中逐漸累積到一定合適程度后趨于平衡，其中有效磷變化并無明顯規(guī)律,但從長(zhǎng)時(shí)間而言，有研究報(bào)道[21]成熟期的窖泥有效磷顯著高于演替期窖泥，本研究窖泥對(duì)象都處于發(fā)酵演替階段。適量的腐殖質(zhì)有利于窖泥的保水性能、提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，過多反而會(huì)因含有機(jī)質(zhì)太多生成腐敗氣味。發(fā)酵過程腐殖質(zhì)的積累主要來源于微生物和糟醅與窖泥的復(fù)合作用，隨發(fā)酵進(jìn)行積累到一定豐度后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，而不同窖齡窖泥的含量也會(huì)存在一定差異。氨態(tài)氮是氨基酸在降氨菌和一系列物化變化降解生成的，氨態(tài)氮的生成與累積在一定程度上表征降氨菌這類菌群的生物豐度。據(jù)研究報(bào)道[22]，不同窖齡窖泥中氨態(tài)氮含量存在明顯差異，氨態(tài)氮含量隨窖齡（5 年、10 年、20 年）增加逐漸豐富，其對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖、蛋白和酶類合成代謝以及維持窖內(nèi)微環(huán)境均具有重要作用，曾波等[23]研究發(fā)現(xiàn)窖底泥的氨態(tài)氮顯著高于窖壁泥，這對(duì)窖底產(chǎn)酸微生物豐度高有一定正面作用。本研究中，4 種窖泥的氨態(tài)氮均迅速降低至低水平，這與新窖泥微生物類群快速代謝有一定關(guān)系，表明窖泥還處于發(fā)展階段。

窖泥水分是體現(xiàn)窖泥的持水性能，反應(yīng)窖泥品質(zhì)的理化指標(biāo)，適宜的水分有利于窖泥這種天然培養(yǎng)基繁殖代謝、保藏厭氧或兼性厭氧微生物。本研究中不同配方窖泥在多輪次發(fā)酵過程中其水分基本在34%上下波動(dòng)，這與我們前期文獻(xiàn)報(bào)道[1，9，24]中的正常品質(zhì)窖泥水分指標(biāo)基本一致，表明前期配方的水分設(shè)定是比較合理的。窖池在經(jīng)過多輪次自然發(fā)酵后會(huì)呈現(xiàn)窖泥發(fā)干、板結(jié)的情況，生產(chǎn)人員[25]會(huì)采用酒頭、尾水、黃水、曲藥等原材料配成的養(yǎng)窖液養(yǎng)護(hù)窖壁，滋潤(rùn)窖泥。窖泥pH 值能反應(yīng)窖池發(fā)酵是否正常，影響著窖泥微生物自身的繁殖代謝及其參與的生化反應(yīng)。魯少文[15]對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的人工窖泥研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃梭菌（ClostridiumIV）與窖泥的pH 值呈正相關(guān)，且隨著pH 值降低，己酸的合成代謝速率降低，最終使得己酸累積量降低，即pH 值的降低不適合己酸菌繁殖及己酸的生產(chǎn)累積；Liang[26]研究發(fā)現(xiàn)，四大酯的合成累積也與pH值呈負(fù)相關(guān)，表明弱堿性環(huán)境更利于酯類物質(zhì)的合成；劉梅[18]研究發(fā)現(xiàn)窖泥質(zhì)量越好，其pH 值越接近于7，認(rèn)為偏向中性原因可能是窖泥有一定的酸緩沖能力和窖泥內(nèi)發(fā)生某些轉(zhuǎn)化有機(jī)酸反應(yīng)的能力較強(qiáng)。由此可以推論，pH 值偏低會(huì)影響濃香型白酒主體風(fēng)味己酸乙酯的合成累積和風(fēng)味骨架的形成，在培養(yǎng)人工窖泥的過程中，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整pH 值及其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，將窖泥朝發(fā)酵培養(yǎng)后呈微酸、弱堿性方向馴化。

本研究以4 種不同配方的窖泥進(jìn)行多輪次發(fā)酵，探究窖泥制作方法和窖泥在發(fā)酵中的變化特性。研究發(fā)現(xiàn)A、B 組窖泥在己酸乙酯的合成累積上顯著優(yōu)于C、D 組窖泥，從窖泥指標(biāo)（除pH 外）的變化趨勢(shì)而言，認(rèn)為A、B 窖泥整體優(yōu)于C、D 窖泥。同時(shí)對(duì)新窖泥在演替階段的生化變化進(jìn)行了初步探索，為新窖泥制作和初步發(fā)酵演替提供了一定的理論支撐。