生物法調(diào)控右旋糖酐分子量的研究進(jìn)展

相萍萍

（上海健康醫(yī)學(xué)院附屬衛(wèi)生學(xué)校（上海健康護(hù)理職業(yè)學(xué)院（籌）），上海 200237）

右旋糖酐（Dextran）是一種微生物多糖，分子式為(C6H10O5)n，是由α-D-葡萄糖基聚合而成的高分子量同多糖，因?yàn)橛倚囚酆隙鹊牟顒e，所獲得的右旋糖酐的分子量也不盡相同，不同分子量的右旋糖酐在食品行業(yè)有不同的應(yīng)用。重均分子量在1×106～2×106的高分子量右旋糖酐可以作為食品添加劑使用，添加到面包中可增加柔軟度、增大體積、改善面包的質(zhì)地[1]；還可以用于果糖糖漿以及糖果中阻止蔗糖結(jié)晶[2]。重均分子量在1×105～1×106的右旋糖酐可用作糕點(diǎn)和飲料中的增稠劑、保濕劑和乳化劑等[3]；重均分子量小的右旋糖酐還可以作為益生元，作為人類和動物食品的營養(yǎng)添加劑[4]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵法生產(chǎn)的右旋糖酐不僅黏度大，而且分子量太高，為了得到特定分子量的右旋糖酐，需要將分子量高的右旋糖酐進(jìn)行調(diào)控降解。本文綜述了生物法調(diào)控右旋糖酐分子量的研究進(jìn)展。

1 發(fā)酵法

合成右旋糖酐所用的菌株主要是明串珠菌和鏈球菌，所選擇使用的菌株不同，合成的右旋糖酐的分子結(jié)構(gòu)也有所差異。腸膜明串珠菌是當(dāng)前合成右旋糖酐最常用的菌株。右旋糖酐主要是以蔗糖為底物，經(jīng)腸膜明串珠菌發(fā)酵而合成，合成原理為腸膜明串珠菌分泌合成酶右旋糖酐蔗糖酶到細(xì)胞外，右旋糖酐蔗糖酶會進(jìn)一步催化蔗糖生成D-葡萄糖基，并將生成的D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移到糖鏈上聚合形成分子量不同的右旋糖酐。

1.1 單一菌株發(fā)酵法

傳統(tǒng)的單一游離菌株發(fā)酵法是通過優(yōu)化培養(yǎng)基，控制反應(yīng)條件如底物（蔗糖）濃度、接種量、發(fā)酵時間等合成一些中小分子量的右旋糖酐。但是這種方法的合成反應(yīng)終體系的黏度較大，很難實(shí)現(xiàn)右旋糖酐的分離純化，且右旋糖酐的產(chǎn)量及質(zhì)量的穩(wěn)定性較差。此外，發(fā)酵培養(yǎng)基如蛋白胨、牛肉膏、無機(jī)鹽等可能未反應(yīng)完全，體系中會有部分殘留，導(dǎo)致雜質(zhì)較多，且發(fā)酵時間較長，目標(biāo)產(chǎn)物得率較低。

有文獻(xiàn)報道[5]，游離菌產(chǎn)生的右旋糖酐的分子量更接近于藍(lán)色葡聚糖的分子量（200 萬），遠(yuǎn)大于固定化菌生成的右旋糖酐的分子量。QADER 等[6]利用海藻酸鈣固定化菌發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐，通過對右旋糖酐分子量及分子量分布的研究發(fā)現(xiàn)，固定化菌產(chǎn)生的右旋糖酐的相對分子質(zhì)量為50 000。王清等[7]調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源與氮源的含量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中其他條件不變時，增大碳源以及氮源的含量，合成的右旋糖酐分子量（百萬數(shù)量級）增大，因此可以通過適當(dāng)調(diào)整碳源與氮源的含量調(diào)控右旋糖酐的分子量。

采用固定化微生物技術(shù)，利用化學(xué)或物理手段將發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐的菌株固定在一塊特定的微小區(qū)域內(nèi)或附著于某一塊載體上進(jìn)行固定化，可以得到固定化菌。固定化菌發(fā)酵法對右旋糖酐分子量控制比游離菌發(fā)酵法更顯著，固定化菌的保存時間相對較長，并且對外界環(huán)境的耐受能力強(qiáng)，且固定化菌可重復(fù)使用。但是，固定化后的菌體活性下降，發(fā)酵生成的大分子右旋糖酐會存在固定化小球內(nèi)或依附于小球表面，黏度較大，容易和固定化菌纏繞在一起，從而堵塞固定化小球的孔徑，使大分子右旋糖酐無法及時從固定化小球中擴(kuò)散出去。大分子右旋糖酐在小球內(nèi)不斷堆積，最后使固定化小球溶脹破裂。

1.2 雙菌株發(fā)酵法

雙菌株發(fā)酵法生產(chǎn)特定分子量的右旋糖酐是通過在含蔗糖的發(fā)酵體系中加入兩種菌種的種子發(fā)酵液，一種菌株能催化蔗糖生成右旋糖酐，另一種菌株能夠產(chǎn)生分解酶分解大分子右旋糖酐，通過調(diào)控發(fā)酵工藝條件如發(fā)酵溫度、時間、pH 值、兩種菌株混合發(fā)酵時間、兩種菌株種子發(fā)酵液的加入比例等，調(diào)控合成分子量不同的右旋糖酐，控制效果明顯優(yōu)于單菌株發(fā)酵法。

KIM 等[8]將腸膜明串珠菌與斯達(dá)式油脂酵母混合發(fā)酵，通過研究培養(yǎng)基成分、兩種菌株的種子培養(yǎng)液的加入比例、pH 值以及溫度，在最優(yōu)反應(yīng)條件下合成了重均分子量為75 000 的右旋糖酐；廖安平等[9]通過向含蔗糖的培養(yǎng)基中加入腸膜明串珠菌以及圓弧青霉菌種子培養(yǎng)液混合發(fā)酵，調(diào)控發(fā)酵條件，最終獲得產(chǎn)物中重均分子量為40 000 的右旋糖酐占80%。曹研研[10]研究了產(chǎn)分解酶右旋糖酐酶的棘孢青霉菌和右旋糖酐蔗糖酶的腸膜明串珠菌聯(lián)合發(fā)酵對右旋糖酐分子量控制的影響，發(fā)現(xiàn)順序發(fā)酵法對分子量的控制效果比混合發(fā)酵法好，右旋糖酐重均分子量能較好地控制在5 000 ～10 000。

相比傳統(tǒng)的單一菌株發(fā)酵法，雙菌株發(fā)酵體系中多加入了一種能產(chǎn)生右旋糖酐酶的菌株，右旋糖酐酶分解體系中右旋糖酐蔗糖酶合成的大分子右旋糖酐向目標(biāo)分子量片段的藥用右旋糖酐集中，此方法能較好地實(shí)現(xiàn)特定分子量右旋糖酐的定向合成，但反應(yīng)體系較復(fù)雜，產(chǎn)物中仍有未反應(yīng)完全的雜質(zhì)，仍需要用有機(jī)試劑輔助分離。

2 酶法

酶法合成右旋糖酐需要先分離、提純特定的細(xì)菌發(fā)酵分泌的合成右旋糖酐的合成酶 ——右旋糖酐蔗糖酶，然后利用右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐。相對于傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法，酶法反應(yīng)條件更加穩(wěn)定，對右旋糖酐分子量的定向控制效果更顯著。酶法合成的目標(biāo)分子量右旋糖酐的均一度好、產(chǎn)物純度高，且反應(yīng)體系更加簡單，沒有發(fā)酵培養(yǎng)基等雜質(zhì)的干擾，易于提取精制，更有利于進(jìn)一步探索特定分子量右旋糖酐合成過程中的機(jī)理研究。酶法通常可以分為單酶法和雙酶法。

2.1 單酶法

單酶法根據(jù)酶在體系中的狀態(tài)可以分為游離酶法和固定化酶法。其中固定化酶是利用物理或化學(xué)方法，將游離酶封鎖在固體材料或?qū)⑵湎拗圃谀骋粎^(qū)域內(nèi)。王曉[11]和鄒青松[12]分別利用固定化右旋糖酐蔗糖酶和游離右旋糖酐蔗糖酶，通過控制蔗糖濃度、發(fā)酵時間以及催化反應(yīng)中右旋糖酐蔗糖酶的濃度等反應(yīng)條件，調(diào)控發(fā)酵產(chǎn)物中不同分子量葡聚糖的含量。但是這兩種方法生成的右旋糖酐重均分子量多集中在重均分子量大于1×106和重均分子量小于1×104的區(qū)域。

此外，與游離酶法相比較，固定化酶具有回收方便、相對穩(wěn)定性高、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，且采用固定化酶法可以減少體系的復(fù)雜程度，但是同時也存在一些弊端。①利用傳統(tǒng)腸膜明串珠菌產(chǎn)生提取的右旋糖酐蔗糖酶的酶活相對較低，固定化后會使右旋糖酐蔗糖酶的酶活進(jìn)一步損失；②固定化酶應(yīng)用于大分子的合成，容易使固定化孔徑阻塞，大分子不能及時排除，容易造成固定化小球溶脹破裂。

2.2 雙酶法

在單合成酶右旋糖酐蔗糖酶體系中加入分解酶右旋糖酐酶，可以有效調(diào)控產(chǎn)物分子量的分布，大大提高中小分子量片段右旋糖酐的得率。右旋糖酐酶能專一性地水解α-1,6 糖苷鍵，將大分量的右旋糖酐水解成較小分子量的右旋糖酐。雙酶法是在以蔗糖為底物的體系中加入兩種酶：右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶協(xié)同催化合成右旋糖酐，右旋糖酐蔗糖酶不斷合成大分子量的右旋糖酐，而右旋糖酐酶又可以對生成的大分子右旋糖酐進(jìn)行降解，兩種酶相互作用，對右旋糖酐分子量的控制效果顯著。

GAN 等[13]以蔗糖為底物，在游離態(tài)右旋糖酐蔗糖酶催化生成右旋糖酐過程中，加入游離右旋糖酐酶，通過調(diào)控右旋糖酐酶的添加量以及添加時間，可以合成分子量不同的右旋糖酐，且產(chǎn)物中小分子量片段的右旋糖酐含量顯著提高，但是仍然存在一些中等分子量的副產(chǎn)物。張義平[14]以蔗糖為底物，通過優(yōu)化固定化右旋糖酐蔗糖酶和固定化右旋糖酐酶的雙酶酶活比、底物濃度以及右旋糖酐蔗糖酶的總酶活量等反應(yīng)條件制備右旋糖酐，獲得平均相對分子質(zhì)量小于10 萬的右旋糖酐的比例達(dá)到99.95%，其占比遠(yuǎn)高于單酶法。

綜上，雙酶法對右旋糖酐分子量的控制效果好，小分子右旋糖酐得率高，且對環(huán)境友好。但由于未經(jīng)修飾或改造的右旋糖酐蔗糖酶的酶活不高，且酶的活力與其催化能力密切相關(guān)，需要進(jìn)一步構(gòu)建工程菌或者馴化生產(chǎn)出右旋糖酐蔗糖酶酶活高的菌株，繼續(xù)研究在高酶活作用下右旋糖酐定向合成作用機(jī)制。

3 結(jié)語

右旋糖酐是一種具有高附加值的多糖，在食品行業(yè)有廣闊的市場前景。國內(nèi)傳統(tǒng)右旋糖酐的制備方法大多為先合成再水解，所得產(chǎn)品的分子量不易控制，分子量分布均一性差、含雜質(zhì)多，且在化學(xué)降解過程容易破壞活性基團(tuán)并引入有害物質(zhì)。近年來，隨著糖生物學(xué)研究的發(fā)展，很多研究者將制備特定分子量右旋糖酐方法聚焦于雙酶合成法，通過調(diào)控雙酶體系中底物濃度、右旋糖酐蔗糖酶加入量以及右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶的雙酶酶活比等，合成不同分子量的右旋糖酐。當(dāng)前雙酶法調(diào)控制備特定分子量的右旋糖酐條件溫和、污染少、能耗低，目標(biāo)分子量的右旋糖酐得率高，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時，降低了右旋糖酐生產(chǎn)成本，具有較好的應(yīng)用前景。但是右旋糖酐蔗糖酶的酶活不高，且其分離及質(zhì)控較難，相信隨著酶工程、基因工程及分離純化等技術(shù)的不斷發(fā)展，將進(jìn)一步提高特定分子量右旋糖酐的生產(chǎn)效率。