以難治性腹瀉為主要表現(xiàn)的A20 單倍劑量不足3 例臨床及基因變異分析

付海燕 馬 莉 石偉娜 白革蘭 孫 敏 劉亞麗 程麗娟 賈霄云 李桂桂趙世光 李曉雷 夏耀芳 趙瑞芹

河北省兒童醫(yī)院 1.消化科，2.新生兒科（河北石家莊 050031）

A20單倍劑量不足（haploinsufficiency of A20，HA 20）是由腫瘤壞死因子α 誘導蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）基因變異引起的常染色體顯性遺傳病，由于腫瘤壞死因子α 誘導蛋白3（又稱為A 20）不足導致核因子κB（NF-κB）信號通路的負反饋受到抑制，呈現(xiàn)自身炎癥性疾病的特征[1]。

圖1 例1 消化內(nèi)鏡鏡下表現(xiàn)

A 20 由TNFAIP 3基因編碼，是NF-κB 信號通路的重要負調(diào)控因子[2]。TNFAIP3基因發(fā)生變異可導致A 20 功能缺失，NF-κB 活性抑制受到影響，核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（NLRP 3）炎癥小體出現(xiàn)激活增強，兩者共同作用，導致白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子過量產(chǎn)生，出現(xiàn)免疫失調(diào)，以反復發(fā)熱、口腔潰瘍、肛周病變等表現(xiàn)為著[3]。本研究對3例以難治性腹瀉為主要表現(xiàn)的兒童期HA20患者的臨床特點，實驗室、影像學檢查結(jié)果，內(nèi)鏡下改變及致病基因變異進行分析，為該病的臨床診治提供線索。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析3 例因難治性腹瀉在河北省兒童醫(yī)院就診，存在TNFAIP 3基因致病性變異患兒的臨床資料。本研究通過患兒監(jiān)護人知情同意，并經(jīng)河北省兒童醫(yī)院倫理委員會審查批準（醫(yī)研倫審號：2020-13）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 收集患者一般情況，包括年齡、性別、家族史、發(fā)病情況、生化指標、胃鏡、結(jié)腸鏡及膠囊內(nèi)鏡鏡下表現(xiàn)、胃腸道組織病理、基因變異、診療、隨訪等資料；入院次日收集患兒晨起血、尿、糞便等標本進行檢驗。

1.2.2 基因檢測 收集患兒及父母外周血各2 mL，EDTA 抗凝，用QIAamp 全血DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）按說明書提取基因組DNA。取起始量3μg DNA，稀釋后，采用Covaris S2超聲儀（Covaris公司，美國）進行超聲片段化，大小約150～200 bp。用NEB Next DNA文庫制備試劑盒-Illumina（NEB公司，美國）制備全基因組文庫。用Nanodrop 2000樣本定量檢測儀（Thermo Fisher科技有限公司，美國）和Agilenl 2100生物分析儀（安捷倫科技公司，美國）進行質(zhì)控。

應用全外顯子測序WES 試劑盒（myGenomics，美國）對患兒和父母的基因外顯子區(qū)域及其上下游50 bp區(qū)域進行捕獲，先證者1采用Illumina HiSeq X ten高通量測序平臺對捕獲到的區(qū)域進行雙端測序，讀長為150 bp，先證者2 采用DNBSEQ-T 7 高通量測序平臺對捕獲區(qū)域進行測序。目標區(qū)域測序后，去除測序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)。運用BWA軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）比對到參考基因組上（hg 19 版本），對測序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用GATK軟件（https://software.broadinstitute.org/gatk/）對樣本的比對數(shù)據(jù)進行多態(tài)性位點檢測，對單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入缺失變異（indels）等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，通過ANNOVAR 軟件（http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）注釋所有的SNPs和indels。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

例1，女，5歲10個月，因“間斷嘔吐、腹痛、腹瀉2年余”于2019年5月就診。入院時查體：身高106cm（P3），體重15kg（P7），體質(zhì)指數(shù)13.3 kg/m2（P3），口腔黏膜光滑，腹部平軟，中上腹及臍周壓痛，全腹未觸及包塊，肛周未見異常。糞便常規(guī)：白細胞1～3個/HP，潛血陽性；血EB 病毒、巨細胞病毒抗體及DNA檢測陰性；結(jié)核桿菌斑點試驗（T-SPOT）陰性；血腫瘤標志物檢測陰性；糞便細菌、真菌、寄生蟲、艱難梭菌等檢查未見異常；糞便鈣衛(wèi)蛋白及血常規(guī)見表1。腹部超聲示回盲部腸管壁及部分乙狀結(jié)腸壁增厚，回聲減低；胃鏡示胃竇黏膜可見片狀充血及陳舊出血斑，十二指腸球部及十二指腸降部見霜斑樣潰瘍，膠囊內(nèi)鏡可見空腸及回腸下段多發(fā)潰瘍；結(jié)腸鏡示回盲部充血（圖1）。胃鏡病理示胃竇局部微膿腫形成，可見隱窩膿腫；腸鏡病理示末段回腸可見隱窩炎，回盲部、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸及直腸可見灶狀淋巴細胞聚集。予患兒腸內(nèi)營養(yǎng)8周，繼予甲基潑尼松龍15 mg/d治療2周后，逐漸減至8 mg/d治療2個月，患兒仍有間斷發(fā)熱、嘔吐、腹痛，排黏液血便，進一步完善基因檢查，診斷為HA 20，改用英夫利昔單抗（5 mg/kg）治療2次后，大便次數(shù)及性狀正常。之后以英夫利昔單抗（5 mg/kg）維持治療，于9 歲時測量身高為134 cm（P55）、體重30 kg（P55）、體質(zhì)指數(shù)16.7 kg/m2（P57）。

例2，女，8 歲，因“間斷腹痛、腹瀉3 月余”于2020年3月入院，當?shù)蒯t(yī)院間斷予抗生素治療，效果不佳。入院時查體：身高120 cm（P8），體重20 kg（P9），體質(zhì)指數(shù)14.0 kg/m2（P9），口腔多發(fā)潰瘍，腹部平軟，臍周壓痛，全腹未觸及包塊，肛周未見異常。入院后查糞便常規(guī)：酵母樣真菌55～65/HP，糞便真菌培養(yǎng)：熱帶念珠菌，給予氟康唑抗真菌治療。結(jié)腸鏡檢查示多個腸段潰瘍；腸鏡病理為輕度慢性腸炎，未見肉芽腫及隱窩膿腫。經(jīng)抗真菌治療，患者腹痛緩解，大便成形。2個月后患兒再次出現(xiàn)發(fā)熱、腹痛、腹瀉，伴有口腔潰瘍，查體外陰可見潰瘍。復查腸鏡提示回盲部及回盲瓣可見潰瘍（圖2A），升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸黏膜光滑，血管紋理清晰；病理：回腸末端、回盲部輕度活動性炎癥。膠囊內(nèi)鏡示：回盲部可見潰瘍（圖2B）。進一步完善基因檢查，存在TNFAIP3基因變異。追問病史，患者母親自26歲開始出現(xiàn)反復口腔潰瘍、外陰潰瘍，偶有腹痛，無腹瀉，無黏液血便；無反復發(fā)熱及皮膚病變，當?shù)蒯t(yī)院診斷為“白塞病”，口服秋水仙堿治療，口腔潰瘍和外陰潰瘍間斷出現(xiàn)，發(fā)作不頻繁。根據(jù)患兒臨床癥狀，結(jié)合實驗室檢查結(jié)果、內(nèi)鏡下表現(xiàn)以及基因檢測結(jié)果，診斷為HA20，給予甲基潑尼松龍2 mg/(kg·d)誘導緩解后，采用阿達木單抗繼續(xù)治療（首次應用80 mg，2周后40 mg，之后每隔2周給藥20 mg維持緩解）。于患者9 歲時隨訪，體溫未再波動，口腔潰瘍愈合，無黏液血便及肛周病變，身高128 cm（P20），體重27 kg（P33），BMI 16.6 kg/m2（P53）。

例3，女，于13日齡開始排綠色黏液便，伴有間斷發(fā)熱，于2022年4月（22日齡）入院。化驗大便常規(guī)未見異常，給予抗感染及對癥治療，大便性狀好轉(zhuǎn)出院。于1.3 月齡時患兒再次出現(xiàn)腹瀉，大便10 余次/d，為黃色稀水便，不含黏液及血絲，伴有發(fā)熱。查體：身長51 cm，體重3.5 kg（身長別體重P44），口腔黏膜光滑，腹平軟，腸鳴音正常存在；肛周及外陰未見異常。糞便常規(guī)：白細胞2～5/HP，潛血弱陽性；血細菌、真菌培養(yǎng)陰性，T-SPOT 陰性；糞便艱難梭菌、細菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)等均為陰性；血常規(guī)、糞便鈣衛(wèi)蛋白水平見表1。經(jīng)對癥治療，患兒病情無好轉(zhuǎn)，間斷發(fā)熱。追問病史，患兒母親自8歲左右出現(xiàn)反復口腔潰瘍及外陰潰瘍，間斷進餐后腹痛，未予重視，未經(jīng)治療。對患兒完善基因檢查，發(fā)現(xiàn)存在TNFAIP 3基因變異，變異來自于母親。根據(jù)患兒臨床特點、家族史及基因變異，診斷為HA 20。予甲基潑尼松龍10 mg/d治療3天，體溫正常，大便1次/d，黃色糊狀便；繼續(xù)口服甲基潑尼松龍4 mg/d 治療10 天，大便次數(shù)及形狀正常，體重增加。于診斷后第14天加用沙利度胺1.5 mg/(kg·d)，甲基潑尼松龍逐漸減停?；純?月齡時復查，身長65.3 cm，體重 8.2 kg（身長別體重P94）。

2.2 基因檢測結(jié)果

3 例患兒均存在TNFAIP 3基因雜合變異。例1為自發(fā)變異c.811 C＞T（p.R 271 X），在811 號核苷酸由胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?，在?71 位氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，為無義變異（圖3 A），該變異位點人類基因突變（HGMD）數(shù)據(jù)庫收錄已有報道，根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）指南，判斷為致病性變異（PVS 1+PS 1+PS 2+PM 2）。例2 存在變異c.292_295 dupAACG（p.G 99 Efs*3）（圖3 B），變異來源于母親，為在第292～295 號核苷酸發(fā)生堿基重復，致氨基酸移碼，在第99 位氨基酸后第3 個氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，終止密碼子發(fā)生在第2 號外顯子上，發(fā)生無義介導的mRNA 降解機制，導致蛋白機構(gòu)改變，功能喪失。c.292_295 dupAACG 位點在GenomAD 等正常人群數(shù)據(jù)庫中未被發(fā)現(xiàn)，在HGMD、Clinvar 疾病數(shù)據(jù)庫中目前未見報道。根據(jù)ACMG 指南，判斷為疑似致病性變異（PVS 1+PM 2_Supporting）。例3 為c.133 C＞T（p.R 45 X）雜合變異（圖3 C），變異來源于母親，第133 號核苷酸由胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?，導致?5 位氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，從而影響該基因編碼蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能，該變異為HGMD 數(shù)據(jù)庫收錄的已知變異，根據(jù)ACMG 指南，判斷為致病性變異（PVS 1+PS 4_Moderate+PM2_Supporting）。

3 討論

HA 20 是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，于2016 年由Zhou 等[1]首次報道，患兒主要表現(xiàn)為白塞病樣癥狀，之后國際學術(shù)期刊陸續(xù)對HA 20 進行了報道[4-10]。A20即腫瘤壞死因子α誘導蛋白3，由TNFAIP 3基因編碼，由一個卵巢腫瘤N 端結(jié)構(gòu)域（ovarian tumor domain，OTU）和七個鋅指結(jié)構(gòu)域（zine finger domain，ZnFs）組成，共790個氨基酸殘基。OTU 結(jié)構(gòu)域可去除目標蛋白中K 63 泛素鏈（去泛素化），使多種目標蛋白如TNF 受體相互作用蛋白、NF-κB 抑制蛋白激酶1、TNF 受體1 等蛋白發(fā)生泛素化，抑制蛋白酶對其降解；ZnFs 可將泛素鏈附著到K 48 上（泛素化），有線性聚泛素化作用，輔助抑制NF-κB 活化[11-12]，在炎癥和免疫反應的負調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[13]。如果TNFAIP 3基因發(fā)生變異，可導致NF-κB 通路的過度激活，引起IL-1 β、IL-6、IL-18、TNF-α等促炎細胞因子的過量產(chǎn)生，機體出現(xiàn)自身炎癥性疾病的癥狀。

目前HA 20 尚無明確的診斷標準，典型的臨床癥狀、輔助檢查、確切的基因變異可輔助該病的診斷。Zhou 等[1]首次報道的HA 20 患者主要表現(xiàn)為復發(fā)性口腔潰瘍、生殖器潰瘍和胃腸道癥狀，類似于白塞病樣表現(xiàn)，之后相關(guān)病例報道患兒不僅表現(xiàn)出自身炎癥性疾病的特征，還表現(xiàn)出自身免疫性疾病的特征，包括早發(fā)型全身炎癥、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎、口腔及生殖器潰瘍、淋巴結(jié)炎、橋本甲狀腺炎、腎臟受累、眼部病變，促炎細胞因子如IL-1 b、TNF、IL-6、IL-9、IL-17、IL-18、干擾素-γ和干擾素誘導蛋白-10不同程度升高。部分患兒存在低滴度自身抗體，如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體等[4-5,9,14]。相關(guān)研究對61 例HA 20 患兒臨床特點進行分析，發(fā)現(xiàn)29 例患兒在確診之前被診斷為白塞病，11例診斷為幼年類風濕關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎，6例被診斷為周期性發(fā)熱-阿弗他口炎-咽炎-淋巴結(jié)炎綜合征（PFAPA）；其他患兒分別被診斷為克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人Still病等[15]。

隨著對HA 20 疾病機制認識的加深，一些表現(xiàn)特殊的病例逐漸被診斷。有研究報道1例7月齡男性患者由于發(fā)熱，C 反應蛋白、肝功能異常，頸部淋巴結(jié)腫大，皮疹，抗雙鏈DNA抗體和抗單鏈DNA 抗體陽性，IL-10、可溶性凋亡蛋白1配體和IL-18水平升高，考慮自身免疫性淋巴增生綜合征（ALPS），為患兒行全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)患兒存在TNFAIP3基因變異，最終診斷為HA 20。ALPS 樣的臨床表現(xiàn)擴大了HA 20 的臨床表型譜[9]。兒童時期HA 20 還可表現(xiàn)為周期性發(fā)熱綜合征、噬血細胞綜合征、PFAPA等[16-18]，臨床需注意鑒別診斷。

本研究中，例2、例3 基因變異均來自于各自母親，兩位母親均于幼年起出現(xiàn)反復口腔潰瘍及外陰潰瘍，并無反復發(fā)熱、腹瀉，而2例患兒以反復發(fā)熱、難治性腹瀉為主要表現(xiàn)，均無外陰潰瘍，雖與母親有相同的基因變異，但臨床表型并不相同，提示HA 20為異質(zhì)性病變。即使基因變異完全相同的家庭成員，臨床表現(xiàn)也可不同[19]。人口隊列研究表明，每個人的平均基因組包含大約200個非常罕見的變異和54個先前報告為致病的變異，說明許多個體雖存在致病變異，但并未發(fā)展成相應的表型[20-21]，這與致病性變異的不完全外顯率和可變表達性有關(guān)，即由相同基因型引起表型的嚴重程度在受影響的個體之間可能有所不同，造成該種現(xiàn)象與調(diào)控基因變異、表觀遺傳學、環(huán)境因素和生活方式的改變有關(guān)[22]。

多數(shù)HA 20 患兒對糖皮質(zhì)激素有反應，近一半HA20患兒對秋水仙堿治療有反應，免疫抑制劑如環(huán)孢素、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤也經(jīng)常應用于HA 20 的治療當中，沙利度胺可改善腸道炎癥[23]。由于HA20患兒促炎細胞因子過度產(chǎn)生，生物制劑如阿那白滯素、利妥昔單抗、托珠單抗、英夫利昔單抗等也已應用于部分患兒[15]，并取得療效。嚴重難治性HA 20患兒可行造血干細胞移植[24]。本研究中3 例患兒，初始治療選用甲基潑尼松龍，效果并不相同，例3年齡最小，癥狀迅速改善，體重及身長獲得增長。而例1應用甲基潑尼松龍后未能誘導緩解，更換為英夫利昔單抗規(guī)律治療后臨床癥狀緩解。HA 20 的長期預后仍需繼續(xù)隨訪研究。

總之，本研究報道了3 例兒童期起病以反復腹瀉為主要表現(xiàn)的HA 20，例3 是目前全球發(fā)病年齡最小的患兒，甲基潑尼松龍、沙利度胺治療取得良好效果，其臨床表型及預后是否隨年齡增長和環(huán)境變化而改變?nèi)孕柽M一步研究。HA 20 患兒臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，根據(jù)臨床表現(xiàn)疑診為HA 20 的患兒，應完善基因檢測協(xié)助診斷。