宏基因組二代測(cè)序技術(shù)診斷骨髓涂片陰性嬰幼兒黑熱病3 例報(bào)告

謝 壘 王 瑤 馬 威 范曉蕾 孫 娟 陳曉昕 王懷立

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)病區(qū)（河南鄭州 450052）

黑熱病又稱內(nèi)臟利什曼病，是杜氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲引起的慢性地方性傳染病[1]。臨床特征有持續(xù)性不規(guī)則發(fā)熱、肝脾腫大、全血細(xì)胞減少、高丙種球蛋白血癥和體重下降等[2]。由于黑熱病臨床表現(xiàn)無明顯特異性，極易與血液系統(tǒng)疾病相混淆，造成誤診或漏診。近年來隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，宏基因組二代測(cè)序技術(shù)（metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）在指導(dǎo)感染性疾病的診斷和治療中突顯出重要作用[3]。本文對(duì)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室收治的經(jīng)mNGS 確診的3例骨髓涂片陰性黑熱病患兒的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，探討mNGS 在嬰兒黑熱病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 臨床資料

例1，女，1歲，居住于河南安陽林州市，因發(fā)熱5 天、發(fā)現(xiàn)骨髓象異常1 天于2021 年4 月18 日收入院。入院前5天患兒發(fā)熱，最高體溫達(dá)40℃，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC） 4.67×109/L，血紅蛋白（HB） 94 g/L，血小板（PLT）131×109/L，C反應(yīng)蛋白（CRP）41.63 mg/L，予頭孢類抗生素（具體不詳）治療4 d，仍反復(fù)高熱。復(fù)查血WBC 4.57×109/L，HB 81g/L，PLT 46×109/L，CRP 177.57 mg/L，降鈣素原（PCT）1.05 ng/mL，骨髓涂片見原始+早幼粒細(xì)胞占11%。入院體檢：輕度貧血貌，全身可見散在出血點(diǎn)，雙側(cè)淋巴結(jié)腫大，較大者約9 mm×6 mm，邊界清，肝脾肋下未觸及。初步診斷為急性白血病待排。輔助檢查：血WBC 3.23×109/L，HB 78 g/L，PLT 41×109/L；CRP 116 mg/L，PCT 1.87 ng/mL；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶90 U/L，纖維蛋白原1.32 g/L，鐵蛋白3 803.3 ng/mL，三酰甘油2.27 mmol/L；血培養(yǎng)陰性，EB病毒和巨細(xì)胞病毒DNA檢測(cè)、血培養(yǎng)、骨髓涂片及培養(yǎng)均陰性。超聲檢查示雙側(cè)頸部淋巴結(jié)腫大，肝膽脾胰未見明顯異常。予頭孢曲松80 mg/kg，qd×4 d，美羅培南17 mg/kg，q6h×1 d，丙種球蛋白2 g/kg及對(duì)癥支持治療5 d，患兒仍反復(fù)發(fā)熱。追問病史，當(dāng)?shù)亟跓o類似患者。

例2，男，1 歲10 月齡，居住于河南省安陽林州市，因發(fā)熱12天、抽搐9天、血象異常6天于2021年12月21日收入院。入院前12天患兒發(fā)熱，體溫39℃，伴咳嗽、流涕，入院前9天體溫升至40℃，抽搐1次，為全身強(qiáng)直大發(fā)作，持續(xù)2分鐘緩解；入院前6天發(fā)熱時(shí)再次抽搐1 次，表現(xiàn)同前。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查血WBC 5.94×109/L，HB 100 g/L，PLT 109×109/L，CRP 72.14 mg/L，血沉 74 mm/h；外周血涂片示粒系減低；胸片示支氣管肺炎。予阿糖腺苷、頭孢噻肟鈉抗感染治療，效果欠佳。入院體檢：頸部多個(gè)淋巴結(jié)腫大，較大約1 cm×0.5 cm，質(zhì)韌，活動(dòng)度可，無壓痛；肝臟肋下5 cm，質(zhì)軟，脾肋下7 cm，質(zhì)韌。初診為血液系統(tǒng)疾病待排。輔助檢查：血常規(guī)WBC 3.80×109/L，HB 85.8 g/L，PLT 110×109/L；CRP 59.9 mg/L，PCT 0.373 ng/mL，血沉 58 mm/h，纖維蛋白原 3.24 g/L，三酰甘油1.22 mmol/L；血培養(yǎng)、骨髓涂片及培養(yǎng)陰性。超聲檢查示雙側(cè)頸部淋巴結(jié)腫大，肝脾大。予拉氧頭孢40 mg/kg，q12h，噴昔洛韋5 mg/kg，q12h抗感染治療2 d，患兒仍反復(fù)發(fā)熱。追問病史稱當(dāng)?shù)亟谟写_診黑熱病患者。

例3，女，2 歲11 月齡，居住于山西省運(yùn)城市，因間斷發(fā)熱40 天、血象異常10 天、加重3 天于2021年12 月31 日收入院。入院前40 天患兒發(fā)熱，體溫40℃，干咳，當(dāng)?shù)刂委熀蟮? 天體溫正常。入院前25天再次發(fā)熱，體溫40℃，當(dāng)?shù)刂委熤恋?天體溫正常。入院前10 天再次發(fā)熱，體溫39℃。查血常規(guī)WBC 3.69×109/L，HB 91 g/L，PLT 112×109/L，CRP 66.10 mg/L，肺炎支原體IgM 陽性。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予阿奇霉素、美羅培南、喜炎平、人免疫球蛋白（7.5g）、地塞米松（3 mg×2 d）、甲基潑尼松龍（40 mg×1 d，20 mg×1 d）等治療1周，效果欠佳。入院體檢：淺表淋巴結(jié)無腫大，咽部充血，心肺無異常，腹膨隆、軟，肝肋下未及，脾肋緣下6 cm，質(zhì)韌。初診為噬血細(xì)胞綜合征待排，流行性感冒。輔助檢查：血常規(guī)WBC 1.42×109/L，HB 76 g/L，PLT 59×109/L，NE 0.44×109/L；CRP 37.8 mg/L，PCT 16.3 ng/mL，血沉 77 mm/h，纖維蛋白原 3.93 g/L，鐵蛋白 2 885.5 ng/mL；乙型流感及呼吸道合胞病毒陽性；骨髓涂片示骨髓增生活躍，可見吞噬細(xì)胞，吞噬紅細(xì)胞及血小板；血培養(yǎng)及骨髓培養(yǎng)陰性；腹部超聲示脾大。予帕拉米韋10 mg/kg，qd×5 d，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉80 mg/kg，q8h×6 d，丙種球蛋白7.5 g×2 d，地塞米松2.5 g×2 d，患兒仍反復(fù)高熱。追問病史當(dāng)?shù)責(zé)o類似患者。

為明確病因，經(jīng)家屬及本院醫(yī)學(xué)科研和臨床倫理委員會(huì)（批號(hào)：2022-KY-0950-002）同意后，3例患兒均行外周血病原學(xué)mNGS 檢測(cè)。結(jié)果顯示，例1檢測(cè)到利什曼原蟲屬，序列數(shù)2 380，嬰兒利什曼原蟲種，序列數(shù)97；例2檢測(cè)到利什曼原蟲屬，序列數(shù)21 529，嬰兒利什曼原蟲種，序列數(shù)7 752，杜氏利什曼原蟲種，序列數(shù)9 040；例3檢測(cè)到嬰兒利什曼原蟲，序列數(shù)2 962，杜氏利什曼原蟲，序列數(shù)343。3例均未檢出其他病原體。

鑒于3 例外周血mNGS 均檢測(cè)到利什曼原蟲， 3 例均確診為嬰兒黑熱病。后續(xù)對(duì)3 例患兒進(jìn)行rK39抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，例1和例3陽性，例2陰性。

3例患兒確診后均停用原抗感染治療，給予葡萄糖酸銻鈉半支，qd肌注。例1在用藥后3天體溫降至正常，例2 在用藥后2 天體溫降至正常，例3 在用藥后4天體溫降至正常。例1用藥療程為10天，第7天查骨髓涂片未見異常細(xì)胞及寄生蟲，血NGS 陰性，rK 39 抗體弱陽性；例2 用藥療程為14 天，第7 天外周血mNGS 檢出嬰兒利什曼原蟲，序列數(shù)241，杜氏利什曼原蟲，序列數(shù)84，院外繼續(xù)用藥7天，再次復(fù)查外周血mNGS 陰性；例3 用藥療程為12 天，復(fù)查外周血mNGS 陰性，rK 39 抗體陰性。3 例隨訪至今，均體溫正常，血象正常，頸部淋巴結(jié)無腫大，肝臟肋下未觸及，例1 和例2 脾臟回縮至肋下未觸及，例3脾臟肋下約1 cm。

2 討論

黑熱病是一種易被忽視的人獸共患傳染病，傳播媒介為白蛉。利什曼原蟲可通過血液進(jìn)入白蛉體內(nèi)，從無鞭毛體繁殖成鞭毛體。7天后白蛉叮咬人體時(shí)，鞭毛體可進(jìn)入人體，破壞中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞大量增生，引起疾病發(fā)生[4]。黑熱病在我國主要分布于西北部，新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅省、四川省3 個(gè)地區(qū)發(fā)病率最高，陜西省、山西省等為流行地區(qū)[4]，近幾年河南省也有散在病例報(bào)道[5-6]。本組例1和例2患兒來自河南省林州市，其中例2居住地有確診患者，例3來自山西省，兩地均有散發(fā)患者。因此，對(duì)可能來自于流行地區(qū)的發(fā)熱、肝脾淋巴結(jié)腫大、抗感染治療效果差的患兒需高度警惕此病。

文獻(xiàn)報(bào)道黑熱病好發(fā)年齡以＜3歲嬰幼兒居多，考慮可能與其免疫功能發(fā)育不完善相關(guān)，本組病例發(fā)病年齡與之相符[7]。臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、肝脾腫大、外周血細(xì)胞減少多見，也可有乏力、納差、精神萎靡等癥狀，缺乏特異性，極易誤診。魏榮榮等[8]在對(duì)山西省陽泉市17 例黑熱病的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，有52.94%（9/17）患者誤診為感染或血液系統(tǒng)疾病。本組3例患兒均有發(fā)熱、全血細(xì)胞減少，例2和例3有肝脾腫大，例1 和例2 早期初診為血液系統(tǒng)疾病，例3 初診為噬血細(xì)胞綜合征。黑熱病患兒骨髓涂片中可見大量吞噬紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的吞噬型組織細(xì)胞，其吞噬細(xì)胞有單純吞噬利杜體、吞噬利杜體和血細(xì)胞及單純吞噬血細(xì)胞三種情況，尤其是第三種情況，是黑熱病容易誤診為噬血細(xì)胞綜合征的主要原因之一。本組3例患兒在入院第一時(shí)間行骨穿涂片檢查，均未發(fā)現(xiàn)吞噬利杜體現(xiàn)象，未見幼稚細(xì)胞和異常細(xì)胞，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，排除血液系統(tǒng)疾病及噬血細(xì)胞綜合征。3例患兒從發(fā)病到確診時(shí)間為7～40 d，在確診前也輾轉(zhuǎn)多家醫(yī)院就診，抗感染等治療無效。因此，對(duì)于長期不規(guī)則發(fā)熱、全血細(xì)胞減少、肝脾腫大、貧血及抗感染治療無效的患者，應(yīng)警惕黑熱病。

目前黑熱病的診斷主要依靠病原學(xué)和血清學(xué)檢查。脾臟、骨髓和淋巴結(jié)穿刺液鏡檢是確診的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。脾臟穿刺液鏡檢診斷的靈敏度和特異度均＞90%，診斷價(jià)值最高，其次是骨髓（靈敏度53%～86%）和淋巴結(jié)穿刺液鏡檢（靈敏度53%～65%）[4]。骨髓穿刺檢查臨床應(yīng)用最為廣泛，但也會(huì)出現(xiàn)假陰性的情況，原因可能是一方面由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員對(duì)該病認(rèn)識(shí)不足，未能識(shí)別出病原體；另一方面骨髓液采集位于黑熱病間歇期，盡管發(fā)熱期和間歇期均有利杜小體存在，但間歇期原蟲數(shù)量較少且不典型，因此未能檢出[9]。本組3例患兒骨髓穿刺結(jié)果均陰性，這也為前期的診療增加了難度。rk 39 免疫層析試紙條法具有較高的特異度和靈敏度[10]。rk39即為利什曼原蟲類kinesin基因中編碼39 個(gè)氨基酸的基因片段重組抗原，ELISA 或免疫層析法都是重要且可靠的檢測(cè)方法[4]。本組患兒中2例rk 39 陽性，提示靈敏性高于病原學(xué)檢查，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。但在檢測(cè)治療后疾病是否復(fù)發(fā)以及區(qū)別現(xiàn)癥者與無癥狀感染者[4]方面存在缺陷。

mNGS 不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，直接對(duì)臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠快速、客觀地檢測(cè)樣本中的多種病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲），對(duì)于感染性疾病的病原體研究具有極高的應(yīng)用價(jià)值[12]。近年來，mNGS 已廣泛應(yīng)用于血液感染、呼吸道感染、骨關(guān)節(jié)感染、腦炎等方面，樣本類型多樣，如腦脊液、呼吸道分泌物、糞便、尿液、血液和組織等[13]。同時(shí)，mNGS 在確定罕見病因中也表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)，如致病性鉤端螺旋體[14]、日本腦炎病毒[15]、沙眼衣原體[16]等。本組3例患兒mNGS 均提示嬰兒利什曼原蟲感染，確診為嬰兒黑熱病，為臨床醫(yī)師提供了快速準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷依據(jù)，使患兒得到精準(zhǔn)治療。

對(duì)于黑熱病的治療，銻劑為首選用藥。但由于銻劑產(chǎn)生的耐藥較為常見，目前國際上推薦兩性霉素B 作為黑熱病治療的一線用藥[4]。本組患兒均給予銻劑治療，未出現(xiàn)耐藥及不良反應(yīng)，療效顯著。在判斷患兒治療終點(diǎn)時(shí)，應(yīng)注意達(dá)到病原學(xué)治愈。因?yàn)榛颊咴谂R床治愈的情況下，往往不能同時(shí)達(dá)到病原學(xué)治愈，容易引起黑熱病復(fù)發(fā)。本組患兒在治療過程中，分別在第7 天予mNGS 復(fù)查，根據(jù)mNGS 結(jié)果，指導(dǎo)后續(xù)治療。3 例患兒均在mNGS 陰性后停藥治療，目前隨訪預(yù)后良好，無復(fù)發(fā)。提示mNGS 不僅在疾病診斷中具有指導(dǎo)價(jià)值，對(duì)指導(dǎo)治療也有較強(qiáng)的意義。

綜上所述，嬰兒黑熱病極易誤診或漏診，尤其對(duì)于骨髓涂片陰性的患兒。mNGS 作為一種快速、精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷方法，為疑難危重的感染性疾病提供了有效的診斷支持，有助于提供精準(zhǔn)治療。