重型β 地中海貧血患兒移植前后腸道菌群變化研究

聞 靜 余 閱 楊春蘭 呂佳憶 宋欣平 李 越 張小玲 王曉東 劉四喜

1.深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科（廣東深圳 518038）；2.中國醫(yī)科大學(xué)深圳市兒童醫(yī)院（廣東深圳 518038）

地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）是以α或β珠蛋白鏈合成障礙為特征的溶血性貧血，也是人類最常見的單基因遺傳病之一。重型β地中海貧血（β-thalassemia major，β-TM）患兒的癥狀在出生后逐漸加重，需終身接受輸血和排鐵治療[1]。目前，異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）仍是臨床治愈β-TM患兒的首選方法[2]。

人體中存在大量微生物，僅腸道內(nèi)的菌群就有 1 000多種，但對于單獨個體來講僅有100多種[3]。造血干細胞移植（HSCT）中的預(yù)處理化療、抗生素的使用等勢必會造成腸道黏膜損傷，破壞免疫穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致腸道菌群的多樣性和豐度發(fā)生改變；在這種情況下，會造成多種移植后相關(guān)并發(fā)癥的出現(xiàn)，其中與移植不良結(jié)局密切相關(guān)的腸道移植物抗宿主?。╣raft versus-host disease，GVHD）就與微生物組成紊亂密不可分[4]。本研究基于16 SrDNA 技術(shù)對37例確診β-TM 患兒移植過程中的96 份糞便樣本的腸道菌群動態(tài)變化進行分析，以便更清楚了解移植不同階段腸道菌群的特征，以期通過優(yōu)化腸道菌群來改善移植患兒預(yù)后。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019 年11 月至2020 年6 月在深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科行HSCT 的確診β-TM 的患兒作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡0～18歲；②明確診斷β-TM[5]并且擬行HSCT 的患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有胃腸道疾病史；②中途退出研究。研究方案經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（No.201904602），獲得患兒及其父母或監(jiān)護人的書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 清潔腸道、預(yù)處理、預(yù)防GVHD 方案 清潔腸道方案：全部入組患兒口服去甲萬古霉素+慶大霉素+制霉素。預(yù)處理方案：同胞全相合為環(huán)磷酰胺（Cy）+環(huán)孢素（CSA）+白消安（Bu）+氟達拉濱（Flu）+塞替派（TT）+抗人胸腺細胞球蛋白（ATG）；無關(guān)供者全相合及單倍體為Cy+Bu+Flu+TT+ATG。預(yù)防GVHD 方案：同胞全相合為CSA+嗎替麥考酚酯（MMF），無關(guān)供者全相合及單倍體為后置環(huán)磷酰胺（Pt-Cy）+MMF+他克莫司（FK506）。

1.2.2 臨床資料收集 從深圳市兒童醫(yī)院醫(yī)療病歷系統(tǒng)中獲取患兒基本信息：年齡、性別、供者類型、清潔腸道方案、清髓預(yù)處理方案、預(yù)防GVHD方案等。

1.2.3 糞便樣本收集 收集移植啟動前期（移植前15 天至移植前12 天，A 組）、清潔腸道期（移植前11天至移植前9 天，B 組）、預(yù)處理期（移植前8 天至移植前1 天，C 組）、干細胞輸注期（移植0 天至移植后2天，D組）及移植后細胞植入期（移植后18天至22天，E組）糞便樣本共96份。取患兒新鮮糞便2 g裝入無菌管中，30分鐘內(nèi)放入-80℃冰箱保存。

1.2.4 糞便樣本檢測 利用16 SrDNA 基因V 4 區(qū)域的Illumina HiSeq測序系統(tǒng)測序糞便樣本。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對應(yīng)的融合引物配置PCR 反應(yīng)體系，進行PCR 擴增，使用Agencourt AMPure XP 磁珠對PCR 擴增產(chǎn)物進行純化并溶于洗脫緩沖器，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq 平臺進行測序。

1.2.5 信息分析流程 下機數(shù)據(jù)過濾，剩余高質(zhì)量的數(shù)據(jù)用于后期分析，將有效數(shù)據(jù)聚類成分類單元并與數(shù)據(jù)庫比對、物種注釋，基于分類單元和注釋結(jié)果進行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析，以及關(guān)聯(lián)分析與模型預(yù)測等。采用Alpha多樣性指數(shù)Chao 1、Ace、Shannon、Simpson 進行分析，以表征樣品中物種分布的多樣性和均勻度，并直觀展示測序深度和數(shù)據(jù)量情況。Chao1是用Chao1算法估計群落中含分類單元數(shù)目的指數(shù)，Chao 1在生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù)。Schao 1=Sobs+n 1(n1-1)/2(n2+1)，其中Schao1為估計的分類單元數(shù)，Sobs 為觀測到的分類單元數(shù)，n 1 為只有一條序列的分類單元數(shù)目，n 2 為只有兩條序列的分類單元數(shù)目。Chao 1 指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。Ace 是用來估計群落中含有分類單元數(shù)目的指數(shù)，是生態(tài)學(xué)中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，默認(rèn)將序列量10以下的分類單元都計算在內(nèi)，從而估計群落中實際存在的物種數(shù)。Ace 指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。Shannon 為綜合考慮群落豐富度和均勻度的指數(shù)，Shannon指數(shù)越高，表明群落多樣性越高。Simpson 為用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。Simpson=1-隨機取樣的兩個個體屬于不同種的概率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的以中位數(shù)M（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

研究期間本科診療β-TM 577 例次，符合入組標(biāo)準(zhǔn)195 例，其中153 例在知情同意告知時退出，5例有長期腹瀉病史被排除。最后入組37 例患兒，其中男27例、女10例，中位年齡7.5（3.0～17.3）歲。部分時間段樣本因不合格被剔除，最終納入分析共96 份樣本，A 組28 份、B 組17 份、C 組18 份、D 組21份、E 組12 份。5 組患兒間年齡、性別、供者類型、預(yù)處理方案及預(yù)防GVHD 方案差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 腸道菌群構(gòu)成

從門水平分析，A組的主要菌門是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭菌門、疣狀菌門。而B 組的主要菌門是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭菌門、疣狀菌門、藍菌門。C組主要菌門是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭菌門、疣狀菌門。D組主要菌門為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭菌門。E組則由變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、梭菌門等菌門組成。

2.3 腸道菌群構(gòu)成變化

5 組之間厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭菌門、放線菌門、疣狀菌門、藍菌門的豐度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 豐度前7的物種組間豐度比較[M(P25～P75)，%]

2.4 腸道菌群Alpha豐度及多樣性變化

利用Chao 指數(shù)比較移植不同時期腸道菌群Alpha豐度。A組Chao指數(shù)為225.9（182.0～260.5），B 組為234.6（193.0～311.3），C 組為127.6（81.1～180.0），D組為96.8（71.1～139.9），E組為122.7（97.5～142.7），5組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=39.04，P＜0.001）。

利用Shannon 指數(shù)來預(yù)測移腸道菌群Alpha 的多樣性。A組Shannon指數(shù)為2.9（2.4～3.3），B組為2.2（1.6～2.9）、C組為1.4（1.2～2.0）、D組為2.0（1.4～2.3）、E組為0.9（0.6～2.2），5組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=29.39，P＜0.001）。

2.5 不同類別抗生素對腸道菌群影響

為研究干細胞輸注期不同類別抗菌藥物對腸道菌群的影響，本研究對使用萬古霉素、使用亞胺培南-西司他丁以及未使用上述兩種抗菌藥物而使用其他類型廣譜抗菌藥物（如大環(huán)內(nèi)酯類等）3組進行比較，發(fā)現(xiàn)3組間Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（H=0.66、0.24、1.35、0.96，P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同抗生素對于干細胞輸注期腸道菌群Alpha 多樣性影響

3 討論

HSCT 仍是挽救許多血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的有效手段，移植后的免疫重建、感染、以及GVHD等大大影響了移植的成功率[6-8]。近些年由于測序技術(shù)的進步，科研人員大規(guī)模探索人類腸道菌群的組成和功能，并認(rèn)識到腸道菌群的損害與多種免疫介導(dǎo)的疾病相關(guān)，而移植后的GVHD 與腸道菌群密切相關(guān)[9]。

本研究中移植啟動前期腸道菌群在門水平上以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門等為主，且厚壁菌門是最豐富的菌門。既往研究認(rèn)為健康人體腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門等構(gòu)成[10]。β-TM患兒移植啟動前期的腸道菌群在菌門水平的構(gòu)成與健康人群相似。

HSCT 前通常經(jīng)過口服抗生素來清潔腸道菌群，以防止菌群易位而造成感染，同時也可減少移植后GVHD 的發(fā)生[11]。既往研究表明使用萬古霉素聯(lián)合多黏菌素B的清腸方案后，菌群的多樣性無改變，而豐度較前下降[12]，而本研究清腸后，菌群多樣性下降，而豐度變化不大，可能與本中心選擇的清潔腸道方案相關(guān)，菌群多樣性的下降可能導(dǎo)致移植相關(guān)死亡率上升[4]，故而清腸方案是否依據(jù)菌群的多樣性來優(yōu)化選擇，目前仍有爭議。選擇性清潔腸道，腸道菌群相對穩(wěn)定，以擬桿菌為主[13]，而全部清潔腸道則擬桿菌的豐度及多樣性較低，以腸球菌、鏈球菌為主，當(dāng)有對萬古霉素、甲硝唑耐藥的腸球菌出現(xiàn)時，菌血癥的發(fā)生率增高[14]；而選用環(huán)丙沙星與甲硝唑聯(lián)用方案，可有效減少腸球菌和減輕GVHD[15]。

預(yù)處理階段使用化療藥物來達到清髓目的，但化療藥物對腸道微生物組的損傷機制尚不完全明確，但治療開始時的早期腸道微生物組變化被認(rèn)為與化療相關(guān)[16-18]?；熀?，腸道菌群的多樣性降低，變形菌門的豐度顯著提升[19]，這與本研究一致，本研究預(yù)處理期變形菌門占最大比例，變形菌門中含大量革蘭陰性菌，既往研究認(rèn)為移植患者變形菌門的相對豐度超過30%，發(fā)生革蘭陰性菌的菌血癥提高5倍[14]。而變形菌門中的伽馬變形菌可作為肺部并發(fā)癥的預(yù)測因子，可能預(yù)測移植后早期細菌直接轉(zhuǎn)移到肺，或由微生物刺激引起的間接肺損傷[20]。而變形菌門占比增高，也提高了GVHD的風(fēng)險[21]。

既往研究認(rèn)為，腸道菌群的重建多在移植后1～3個月[22]，本研究移植啟動前菌群具有最高的豐度與多樣性，移植細胞植入后，腸道菌群的豐度及多樣性尚不能完全恢復(fù)至移植啟動前期水平，故而腸道菌群重建不能在細胞植入期完成，因此在移植后細胞植入期仍需高度警惕感染的發(fā)生。

指南推薦在allo-HSCT患者細胞植入前的中性粒細胞減少期預(yù)防或治療性使用廣譜抗生素，可減少感染并發(fā)癥，但使用廣譜抗生素可導(dǎo)致腸道菌群受損，特別是碳青霉烯類抗生素，有可能發(fā)展為更嚴(yán)重的GVHD[23-24]。本研究中使用萬古霉素、亞胺培南-西司他丁與沒有使用這兩種抗菌藥物對比，不同藥物之間腸道菌群豐度與多樣性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此暫時無法在移植過程中的中性粒細胞缺乏期依據(jù)腸道菌群來優(yōu)化選擇抗生素的類型。

既往研究中移植入組患者以成人居多，且病種豐富，不局限于單一病種。本研究為兒童β-TM 單病種。然而，本研究也具有局限性和一些不足。首先，納入兒童標(biāo)本具有挑戰(zhàn)性，患兒處于特殊敏感的HSCT 時期，依從性相對較差，限制了本研究的標(biāo)本數(shù)量，另一方面由于時間限制，本研究樣本量較小，不足以代表整體。其次，腸道菌群受多種因素影響，本研究入組患兒尚未評估地域性、飲食因素等差異對腸道菌群所造成的影響。然而，考慮到越來越多兒童可以通過HSCT 挽救生命，故而未來需要多中心合作，增加納入樣本量來更全面了解腸道菌群，以提高HSCT成功率。