2019—2022 年兒童致腹瀉腸道沙門菌血清型/群和耐藥性-雙中心研究

沈瓏慧 華春珍 何娟妃 周明明 周瑾思 羅巧二

1.寧波市婦女兒童醫(yī)院（浙江寧波 315000）；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（浙江杭州 310052）

腸道沙門菌（Salmonella enterica）是近年細(xì)菌性腸炎最常見(jiàn)的致病菌[1-3]，主要通過(guò)污染的食物或水源經(jīng)口感染機(jī)體，臨床以細(xì)菌性腸炎最為常見(jiàn)，多有發(fā)熱、嘔吐、腹痛腹瀉和黏液膿血便等臨床表現(xiàn)[2,4-5]。腸道沙門菌可分腸道亞種、薩拉姆亞種、亞利桑那亞種、雙相亞利桑那亞種、豪頓亞種和印第卡亞種6種，能感染人類的主要集中于腸道亞種，共1 504個(gè)血清型均已獲得命名[6]，這些血清型中常見(jiàn)的型別主要?dú)w屬于A-F 血清群，如臨床醫(yī)師熟悉的傷寒沙門菌，正規(guī)名稱為腸道沙門菌腸道亞種傷寒血清型，屬于D群，鼠傷寒沙門菌屬于B群，甲型副傷寒沙門菌屬于A 群等。隨著年代變遷，腸道沙門菌的常見(jiàn)血清型發(fā)生一定變遷，傷寒血清型日益少見(jiàn)，鼠傷寒血清型逐漸成為最常見(jiàn)血清型[1,7]，但不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同人群，主流血清型的分布存在一定差異[1,7-8]，這可能與耐藥性有關(guān)[1,7]。歷史上腸道沙門菌對(duì)頭孢菌素等臨床常用抗菌藥物敏感率較高，因此美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南[9]推薦，對(duì)于腸道來(lái)源的沙門菌，只需完成氨芐西林、甲氧芐啶-磺胺甲基異噁唑（trimethoprim-sulfamethoxazole,SMZ）和一種氟喹諾酮類抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。然而，隨著抗菌藥物的廣泛使用，我國(guó)沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥率已普遍超過(guò)75%，對(duì)SMZ 的耐藥率也超過(guò)35%[1,8,10-11]。氟喹諾酮類因抑制骨骼的發(fā)育不適用于兒童，因此我國(guó)若參考CLSI指南對(duì)腸道來(lái)源的沙門菌只做3 種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，其結(jié)果無(wú)法為腸炎患兒抗菌藥物選擇提供參考。本研究的目的是闡明本地區(qū)腸道沙門菌兒童株的耐藥模式和血清型以及兩者之間的關(guān)系，為兒童沙門菌腸炎的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性研究沙門菌在腸炎患兒中的分離情況、血清型和耐藥率。通過(guò)寧波市婦女兒童醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱寧波婦兒醫(yī)院）和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱浙大兒院）兩家單位的實(shí)驗(yàn)信息管理系統(tǒng)，檢索2019年1月1日至2022年6月30日糞便培養(yǎng)結(jié)果為沙門菌者，導(dǎo)出患兒的一般信息、血清分型和藥敏結(jié)果。同一患兒在同一病程中多次送檢按1例計(jì)，優(yōu)先記錄沙門菌培養(yǎng)陽(yáng)性者，若患兒同時(shí)或先后分離到不同血清型的沙門菌，則考慮為不同菌株的混合感染或先后感染。

1.2 材料與儀器設(shè)備

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS，德國(guó)布魯克公司）、全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（Vitek 2 compact，法國(guó)bio-merieux公司）、GN鑒定板和GNS藥敏板（法國(guó)bio-merieux公司）、克氏雙糖鐵瓊脂（杭州濱和微生物試劑有限公司）、SS 培養(yǎng)基（浙江青谷生物工程有限公司，上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司）、沙門菌屬診斷血清（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司）。

1.3 方法

研究年限內(nèi)沙門菌的培養(yǎng)采用SS 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。挑選可疑菌落接種至克氏雙糖鐵瓊脂，用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，或用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行細(xì)菌鑒定，用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，再用沙門菌屬診斷血清進(jìn)行血清分型。沙門菌藥敏試驗(yàn)按CLSI 指南進(jìn)行結(jié)果解讀[9]。沙門菌血清分型參照考夫曼-懷特（Kauffmann-White）標(biāo)準(zhǔn)確定血清分型結(jié)果。鼠傷寒沙門菌ATCC 14028和大腸埃希菌ATCC 25922 作為質(zhì)控菌株貫穿始終。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件23.0版，計(jì)數(shù)資料以例、株數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)（其中各年度率的比較采用趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)）；計(jì)量資料非正態(tài)分布資料以M（P25～P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

研究年限內(nèi)共送檢糞便培養(yǎng)20 427份，腸道沙門菌培養(yǎng)陽(yáng)性1 014例，陽(yáng)性率5.0%（1014/20427），男性患兒占55.7%（565/1014），男性患兒陽(yáng)性率（4.8%，565/11855）與女性患兒差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.2%，449/8572，χ2=2.35，P=0.125）。門診患兒糞便沙門菌培養(yǎng)陽(yáng)性率15.2%（640/4200），顯著高于住院患兒（2.3%，374/16227，χ2=1183.0，P＜0.001）。兩家醫(yī)院患兒糞便標(biāo)本腸炎沙門菌分離情況及患兒一般信息見(jiàn)表1。糞便腸炎沙門菌培養(yǎng)陽(yáng)性者年齡中位數(shù)為14（9～26）月，陰性者年齡中位數(shù)為15（4～43）月，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.99，P=0.32）。5到10月份糞便腸炎沙門菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率較高，其中7月份總分離率最高，達(dá)9.53%（168/1762）。2019年1月1日至2022年6月30日各月份糞便培養(yǎng)腸炎沙門菌的分離率見(jiàn)圖1。2019、2020、2021年度和2022年1—6月份分離到的菌株數(shù)分別為220、355、321和118株，分離率分別為4.5%（220/4884）、5.8%（355/6153）、4.9%（321/6486）和 4.1%（118/2904）。

表1 兩家醫(yī)院患兒糞便腸炎沙門菌分離情況及患兒一般信息

圖1 2019—2022 年各月份糞便腸炎沙門菌總分離率

2.2 腸道沙門菌血清型/群

1 014株菌株中腸道沙門菌中腸道亞種1 013株，最常的為B 群，占67.3%（682/1014），其次為C 群13.0%（132/1014），D群11.9%（121/1014），E群5.2%（53/1014），未能分群占2.5%（25/1014）；腸道沙門菌亞利桑那亞種1株，占0.1%（1/1014）。1 014株腸道沙門菌的血清群和血清型分布見(jiàn)表2。鼠傷寒血清型最常見(jiàn)，占48.7%，2019至2022年各年度鼠傷寒血清型的構(gòu)成比分別為38.6%、50.4%、52.3%和52.5%，逐年上升趨勢(shì)顯著（χ2=11.74，P=0.008）。浙大兒院與寧波婦兒醫(yī)院的構(gòu)成比比較：B 群沙門菌（549/830，66.1%對(duì)133/184，72.3%，χ2=2.58，P=0.11），C群沙門菌（116/830，14.0%對(duì)16/184， 8.7，χ2=3.70，P=0.06），D群沙門菌（104/830，12.5%對(duì)15/184，8.2%，χ2=2.79，P=0.10）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但浙大兒院鼠傷寒沙門菌（370/830，44.6%對(duì)124/184，67.4%，χ2=31.37，P＜0.001）和E1群沙門菌的構(gòu)成比（36/830，4.5%對(duì)17/184，9.2%，χ2=7.31，P=0.007）顯著低于寧波婦兒醫(yī)院。

表2 1 014株腸道沙門菌的血清群和血清型

2.3 藥敏結(jié)果

菌株對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、SMZ 和亞胺培南的耐藥率分別為75.5%、25.3%、39.0%和1.4%。1 014 株菌株對(duì)常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果見(jiàn)表3，2019—2022 年菌株的耐藥率變化見(jiàn)圖2，菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率有逐年下降趨勢(shì)（χ2=46.58，P＜0.001），對(duì)氨芐西林（χ2=1.78，P=0.62）、頭孢曲松（χ2=4.48，P=0.22）、SMZ（χ2=2.39，P=0.49）和氯霉素（χ2=1.84，P=0.61）的耐藥率變化趨勢(shì)不顯著。寧波婦兒醫(yī)院的沙門菌對(duì)頭孢曲松的耐藥率為33.2%（61/184），顯著高于浙大兒院的菌株（23.2%，164/707，χ2=7.67，P=0.006），兩家單位的菌株對(duì)氨芐西林（78.2%，144/184對(duì)74.7%，529/708；χ2=0.99）和SMZ 的耐藥率（37.5%，69/184對(duì)39.4%，279/708；χ2=0.22）無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。鼠傷寒沙門菌對(duì)氨芐西林（85.9%，395/460對(duì)64.4%，278/432；χ2=55.68，P＜0.001）、氨芐西林/舒巴坦（76.7%，99/129 對(duì)58.1%，36/42；χ2=7.05，P=0.008）、頭孢曲松（29.6%，136/460對(duì)20.3%，90/443；χ2=11.38，P=0.001）、SMZ（44.8%，206/460 對(duì)32.9%，142/432；χ2=13.09，P＜0.001）、環(huán)丙沙星（18.3%，69/377對(duì)6.8%，26/380；χ2=22.65，P＜0.001）和氯霉素（57.6%，193/335對(duì)34.2%，127/371；χ2=35.12，P＜0.001）的耐藥率顯著高于其他菌株。鼠傷寒血清型對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素的耐藥率顯著高于B群其他血清型（70.5%，98/139，χ2=16.27，P＜0.001；9.1%，12/132，χ2=6.61，P=0.01 和46.2%，60/130，χ2=4.96，P=0.03），與頭孢曲松（25.2%，35/139，χ2=1.01，P=0.32）和SMZ 耐藥率（39.6%，55/139，χ2=1.14，P=0.29）無(wú)顯著性差異。不同血清群的沙門菌耐藥率比較見(jiàn)表4。

表3 1 014株沙門菌對(duì)常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果

表4 腸道沙門菌不同血清群對(duì)常用抗菌藥物耐藥率比較果

圖2 2019 年至2022 年各年度糞便培養(yǎng)到的 腸炎沙門菌的耐藥率

B 群和D 群沙門菌對(duì)氨芐西林（χ2=80.95，P＜0.001）、氨芐西林/舒巴坦（χ2=12.53，P＜0.001）的耐藥率顯著高于其他血清群；B群沙門菌對(duì)頭孢曲松（χ2=8.83，P=0.003）、SMZ（χ2=55.82，P＜0.001）的耐藥率顯著高于D 群，對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率顯著高于C 群（χ2=9.47，P=0.002）；B 群和E 群沙門菌對(duì)氯霉素的耐藥率顯著高于C群（χ2=17.41，P＜0.001），C 群又顯著高于D 群（χ2=10.17，P=0.001）。其他血清群組間比較不同抗菌藥物的耐藥率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

資料顯示，5 到10 月份腸道沙門菌在大便中的分離率較高，尤其6到8月份為高峰月份，兩家單位該菌感染的季節(jié)分布一致，考慮與本地區(qū)夏季氣候環(huán)境易發(fā)生沙門菌滋生污染食物以及夏季吃生冷食物較易致機(jī)體感染有關(guān)，與既往研究結(jié)果一致[2,7]。本研究大便培養(yǎng)的陽(yáng)性率低于國(guó)內(nèi)同類研究，住院患兒標(biāo)本陽(yáng)性率更顯著低于門診患兒，且兩家單位陽(yáng)性率也差異顯著，考慮主要與送檢標(biāo)本的納入標(biāo)準(zhǔn)差異較大有關(guān)，臨床應(yīng)掌握好細(xì)菌性腸炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)無(wú)腸道細(xì)菌感染依據(jù)尤其明確病毒性腸炎的患兒，應(yīng)避免不必要的培養(yǎng)檢查。部分住院患兒在門診期間應(yīng)用過(guò)抗菌藥物對(duì)檢出率也有一定影響。

血清分型、分群研究顯示，腸道沙門菌腸道亞種是兒童沙門菌腸炎的主流型別，亞利桑那亞種僅1株。腸道亞種中血清群以B群為主，血清型以鼠傷寒占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，C 群、D 群和E 群占一定比例，其他血清型少見(jiàn)，型別分布與國(guó)內(nèi)多中心檢測(cè)結(jié)果一致[1]，但與河南、廣州的研究報(bào)道以腸炎血清型為主的分布不同[7,11-12]。本組浙大兒院鼠傷寒沙門菌和E1群沙門菌的構(gòu)成比顯著低于寧波婦兒醫(yī)院，提示本菌種的血清型存在地區(qū)分布差異。本組因分型血清限制未能分群的腸道亞種占2.5%，這些菌株屬于非A-F群，高于既往腸道沙門菌腸道亞種非A-F 群血清型1.1%的比例[13]，考慮與菌株分離于不同時(shí)期以及菌株標(biāo)本來(lái)源差異有關(guān)。

腸道沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥性逐年增加趨勢(shì)明顯[1,7,10]，但通常認(rèn)為對(duì)頭孢曲松等第三代頭孢菌素敏感。不同標(biāo)本來(lái)源的菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性不同，腸道來(lái)源的菌株往往耐藥率高于其他標(biāo)本來(lái)源者[1,7,10]，兒童來(lái)源的菌株耐藥率高于成人株[7]。本研究的菌株均為腸道來(lái)源的菌株，對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)75.5%，對(duì)SMZ 的耐藥率39.0%，且兩家醫(yī)療機(jī)構(gòu)耐藥率無(wú)顯著性差異，反映了本地區(qū)腸道沙門菌兒童株對(duì)CLSI 指南推薦的兩種抗菌藥物較高水平的耐藥現(xiàn)狀，提示對(duì)于耐這兩種抗菌藥物的腸道沙門菌引起的腸炎，必須尋求其他的抗菌藥物。本組菌株對(duì)頭孢曲松的耐藥率不高，為25.3%，與國(guó)內(nèi)大范圍研究的監(jiān)測(cè)結(jié)果差別不大[10]，也提示頭孢曲松可考慮作為耐氨芐西林和SMZ 的沙門菌引起的腸炎的臨床用藥。浙大兒院的菌株對(duì)頭孢曲松的耐藥率低于寧波婦兒醫(yī)院，考慮系兩地頭孢曲松的暴露程度不同造成耐藥率差異。亞胺培南雖然檢測(cè)的菌株數(shù)不多，藥敏結(jié)果提示菌株耐藥少見(jiàn)，可作為三代頭孢耐藥的重癥腸道沙門菌感染的候選用藥。本研究跨度4年，期間菌株對(duì)常用抗生素耐藥率上升趨勢(shì)不明顯，后續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)耐藥率依舊必要。

腸道沙門菌不同血清型對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性存在差異。研究表明，鼠傷寒血清型對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性高于其他血清型[1,10]，與本研究結(jié)果一致。本研究中不同血清群的腸道沙門菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率差別較大，B 群對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松和環(huán)丙沙星的耐藥率處于較高水平，其中鼠傷寒血清型的耐藥率高于其他B 群株，D群株對(duì)頭孢曲松、SMZ、環(huán)丙沙星和氯霉素的敏感率最高，E 群對(duì)SMZ 和氯霉素的耐藥率最高，這些特點(diǎn)的闡明對(duì)于腸道沙門菌感染的抗感染治療具有重要意義。腸道沙門菌血清型別眾多，血清分型工作量巨大，成本也昂貴，在分離菌株數(shù)多的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，每一菌株都要做到精確分型難度很大，對(duì)臨床抗菌藥物的直接指導(dǎo)意義相對(duì)較小，而鑒定到血清群的水平已然能有一定流行病學(xué)監(jiān)測(cè)價(jià)值，當(dāng)然，若能確定到每一血清型，流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的意義更大。本研究的不足之處是部分菌株因經(jīng)濟(jì)原因未能做藥敏試驗(yàn)，此外少數(shù)抗生素可能因紙片缺貨或抗生素種類更改導(dǎo)致完成藥敏試驗(yàn)的菌株數(shù)量不完全相同。

綜上，腸道沙門菌是兒童細(xì)菌性腸炎的最常見(jiàn)致病菌，B群沙門菌為優(yōu)勢(shì)菌群，鼠傷寒沙門菌是最常見(jiàn)血清型，菌株對(duì)氨芐西林耐藥率高，第三代頭孢菌素可作為本病臨床治療的首選用藥。不同血清型對(duì)常用抗菌藥物的耐藥模式差別較大，臨床經(jīng)驗(yàn)治療時(shí)應(yīng)考慮患兒血清型并根據(jù)藥敏結(jié)果調(diào)整用藥。對(duì)腸道來(lái)源的腸道沙門菌，藥敏試驗(yàn)時(shí)建議至少應(yīng)包括頭孢曲松和一種碳青霉烯類抗菌藥物。本組未對(duì)菌株進(jìn)行阿奇霉素耐藥性研究，對(duì)于β內(nèi)酰胺類過(guò)敏的患者，可以根據(jù)流行病學(xué)折點(diǎn)評(píng)估阿奇霉素作為替代用藥的價(jià)值。