通過式固相萃取柱凈化-光化學(xué)衍生-高效液相色譜法測定復(fù)合調(diào)味料中黃曲霉毒素的含量

岳超,徐欣豐,趙超群,袁堃,王展華,劉柱,陳碧蓮,梁晶晶*

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院,國家市場監(jiān)督管理局重點實驗室(功能食品質(zhì)量與安全領(lǐng)域), 浙江省市場監(jiān)督管理局重點實驗室(保健品質(zhì)量安全重點實驗室), 杭州 310052;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

隨著國民生活水平不斷提高,現(xiàn)代人們的餐飲方式多元化加快,外賣、火鍋、麻辣燙等成為大部分居民的餐飲首選。為滿足不同的飲食需求,復(fù)合調(diào)味料使用廣泛。復(fù)合調(diào)味料成分復(fù)雜多樣,其原料、配比、加工方式、儲存條件等各不相同。復(fù)合調(diào)味料的原料如花生醬、芝麻醬、黃豆醬、辣椒油等均存在霉菌毒素污染的風(fēng)險[1-6],為追求經(jīng)濟效益,存在不法商家使用價廉質(zhì)次或陳貨進行調(diào)配的可能,使得該類食品存在較高的安全隱患。

黃曲霉毒素現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.22-2016,標(biāo)準(zhǔn)中共涉及5個方法,其中第一、二、三法均采用免疫親和柱凈化。此凈化方法耗時長、操作復(fù)雜、價格昂貴,且用于基質(zhì)復(fù)雜樣品時過柱困難、準(zhǔn)確度低等問題尤為突出。近年來,通過式的凈化固相萃取柱,如EMR-Lipid、PRiME-HLB、ProElut Pls-A等廣泛用在檢測藥物殘留、污染物殘留方面[7-13],此類親脂、親水的新型凈化集提取、濃縮、凈化為一體,可以有效地去除樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)、磷脂等雜質(zhì),且無需活化、平衡,實驗操作步驟少,檢驗效率和結(jié)果準(zhǔn)確度高,但在真菌毒素測定中的應(yīng)用主要集中在糧食制品和食用油上[14-16],在高油脂、高鹽、高蛋白的復(fù)合調(diào)味料中的應(yīng)用較少見。

基于復(fù)合調(diào)味料組成復(fù)雜、基質(zhì)干擾大的特點,本研究建立并優(yōu)化通過式固相萃取柱凈化方法,對花生醬、芝麻醬、黃豆醬、豆豉醬、豆腐乳5種復(fù)合調(diào)味料共計42批樣品中的黃曲霉毒素進行測定,了解復(fù)合調(diào)味料中黃曲霉毒素的污染風(fēng)險情況,以期為完善復(fù)合調(diào)味料中黃曲霉污染風(fēng)險控制提供對策,為完善法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

XR-20AD型高效液相色譜儀(配RF-20A熒光檢測器) 日本島津公司;Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司;萬分之一分析天平 梅特勒-托利多公司;KH5200DE型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)公司;J-34-4型高速研磨勻漿機 深圳市新銳科技發(fā)展有限公司;渦旋振蕩儀 IKA公司;高速離心機 賽默飛世爾科技公司。

黃曲霉毒素(AF,下同)B1、B2、G1、G2混合對照品溶液濃度分別為1.08,0.33,1.01,0.30 μg/mL(批號:610001-202107,中國食品藥品檢定研究院);乙腈、甲醇均為色譜純;實驗用水為超純水。實驗中黃豆醬8批、豆豉醬6批、豆腐乳8批均為市購,花生醬10批和芝麻醬10批為餐飲店中的自制調(diào)味料。

1.2 實驗部分

1.2.1 色譜條件

流動相為乙腈-甲醇-水(20∶20∶60,下同);色譜柱為Zorbax C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫為35 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL,熒光檢測器激發(fā)波長λex=360 nm,發(fā)射波長λem=440 nm。此條件下AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2色譜峰分離度良好,色譜圖見圖1。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精密吸取黃曲霉毒素對照品混合溶液 0.5 mL置于5.0 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容得到混合對照品工作溶液,于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品溶液的制備

稱取充分粉碎混勻的試樣5.0 g,置于50 mL 離心管中,加入4顆鋼珠,準(zhǔn)確加入40 mL 80%乙腈-水溶液,高速研磨振搖提取10 min,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min,上清液待凈化。待凈化液直接上柱,收集濾液于10 mL離心管中,準(zhǔn)確吸取4.0 mL流出液在45 ℃條件下氮氣吹干,加入1 mL初始比例流動相復(fù)溶,渦旋溶解30 s,通過0.22 μm有機濾膜,待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

本研究參考國標(biāo)方法、《中國藥典》方法及現(xiàn)有文獻報道方法[3,5,13-14,17]。常用的黃曲霉毒素提取溶液為不同體積比的甲醇-水溶液和乙腈水溶液。結(jié)合研究樣品基質(zhì)特點及目標(biāo)物結(jié)構(gòu)特點,實驗考察了70%甲醇-水溶液、70%甲醇-0.1%甲酸水溶液、80%乙腈-水溶液、80%乙腈-0.1%甲酸-水溶液、84%乙腈-水溶液、84%乙腈-0.1%甲酸-水溶液為提取液時黃曲霉毒素的回收率結(jié)果,見圖2。

圖2 不同提取溶劑對4種黃曲霉毒素回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recovery rates of AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

由圖2可知,乙腈-水溶液為提取溶劑時,黃曲霉毒素的回收率為77.6%～87.6%,明顯高于甲醇-水溶液。甲醇易提取出樣品中的酸類、醇類、酚類物質(zhì),甲醇-水溶液提取離心后,提取液仍渾濁,直接影響后續(xù)樣品的過柱速度。乙腈為提取液時對脂肪、蛋白、色素等雜質(zhì)提取較少,適用于后續(xù)步驟中固相萃取柱填料的凈化需求。黃曲霉毒素對酸度不敏感,提取效率不受甲酸含量的影響。因此,實驗最終選擇80%乙腈-水溶液為提取溶劑。

2.1.2 凈化方式的選擇

實驗以陰性花生醬的加標(biāo)樣品為研究對象,選取EMR-Lipid、PRiME-HLB、ProElut Pls-A、MycoSep 226 4種通過式固相萃取柱凈化,考察3種加標(biāo)濃度水平下各黃曲霉毒素的回收率,并與免疫親和柱凈化測得的回收率結(jié)果進行比較,結(jié)果見圖3。

圖3 不同基質(zhì)樣品黃曲霉毒素的回收率結(jié)果Fig.3 The recovery rates of aflatoxins in different substrates

復(fù)合調(diào)味料樣品基質(zhì)組成復(fù)雜,油脂、蛋白質(zhì)、色素、糖類、食鹽等物質(zhì)含量高,提取液中溶解的油脂、色素等雜質(zhì)較難去除,導(dǎo)致其加標(biāo)回收率結(jié)果低于其他食品類別。經(jīng)過PRiME-HLB柱和EMR-Lipid柱凈化后,4種黃曲霉毒素的回收率與免疫親和柱差異小,且AFB1和AFB2的回收率更優(yōu);ProElut Pls-A的回收率為57.8%～61.3%,且圖譜中干擾大,基線不平,對AFG2的結(jié)果準(zhǔn)確性影響大;MycoSep 226柱凈化對AFG2的回收率影響大,回收率為52.7%～55.6%。

免疫親和柱凈化時特異性強,但本基質(zhì)樣品提取液無法順利通過免疫親和柱進行吸附,且洗脫液復(fù)溶后仍會出現(xiàn)白色沉淀。EMR-Lipid和PRiME-HLB凈化柱均有很好的凈化效果,EMR-Lipid為增強型脂質(zhì)凈化材料,基于體積排阻和疏水相互作用的結(jié)合來去除脂質(zhì),但PRiME-HLB對含有鹽、蛋白、磷脂等物質(zhì)的凈化效果更好。依據(jù)復(fù)合調(diào)味料的組成和黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)特點,最終選擇PRiME-HLB為凈化柱。

2.1.3 提取方式和提取時間的選擇

研究過程中發(fā)現(xiàn),豆豉醬在振搖提取過程中容易結(jié)團,提取液與樣品的接觸面積小,使得提取效率低?；ㄉu和芝麻醬的振搖提取效果好,但30 min才可以提取完全,使得提取液乳化嚴(yán)重。本研究選擇高速研磨均質(zhì)儀,使用鋼柱碰撞進而防止樣品結(jié)團,實現(xiàn)勻漿和振搖提取同時進行。超聲提取可以促使植物組織破壁、變形,提取效率高。實驗考察了10～30 min的提取效果,最終選擇高速研磨均質(zhì)10 min后超聲提取10 min。

2.1.4 復(fù)溶溶解的選擇

實驗比較了甲醇、黃曲霉提取液、初始比例流動相溶液為稀釋溶劑時的結(jié)果差異。3種溶劑對回收率的影響小,但初始比例流動相復(fù)溶時,其溶劑效應(yīng)小、基線平穩(wěn),在測定低濃度AFG2時準(zhǔn)確度較其他兩種溶劑高。實驗最終選擇初始比例流動相溶液為復(fù)溶溶劑,并高速渦旋1 min充分溶解。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍與定量限

用初始比例流動相溶液稀釋混合對照品工作溶液,配制得到7個水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按照1.2.1項色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對照品濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)。結(jié)果表明,4個目標(biāo)物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比S/N=10確定方法的定量限(LOQ),結(jié)果見表1。

2.2.2 精密度和重復(fù)性實驗

取第二濃度點混合對照品溶液,連續(xù)測定6次,記錄4個目標(biāo)物的峰面積并計算RSD。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的精密度RSD(n=6)分別為0.06%、0.18%、1.06%、0.87%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

平行制備陽性樣品6份,測定并計算4個目標(biāo)物含量。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量的RSD(n=6)分別為0.67%、2.27%、1.04%、2.67%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.3 不同樣品的回收率及精密度

取豆腐乳、花生醬、芝麻醬、黃豆醬、豆豉醬的陰性樣品,依照國標(biāo)中定量限要求(AFB1和AFG1為0.1 μg/kg,AFB2和AFG2為0.03 μg/kg)分別加1×LOQ、5×LOQ、10×LOQ 3個水平濃度的混合對照品溶液進行回收率實驗?；厥章始癛SD結(jié)果見表2。 結(jié)果顯示AFB1和AFG1的回收率均高于AFB2和AFG2,豆腐乳的回收率低于其他樣品。

表2 4種黃曲霉毒素在不同調(diào)味醬中的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of four kinds of aflatoxins in different seasoning sauces

表3 樣品中黃曲霉毒素檢出情況Table 3 Detection conditions of aflatoxins in samples

2.3 樣品的測定

采用PRiME-HLB固相萃取柱,按照1.2.3項方法制備44批樣品的供試品溶液,測定樣品中黃曲霉毒素的含量。結(jié)果顯示,黃豆醬中檢出2批次,豆腐乳中檢出1批次,豆豉醬中未檢出。餐飲店自制花生醬和芝麻醬中黃曲霉毒素的檢出率高,含量范圍AFB1為0.309～4.17 mg/kg,AFB2為0.129～1.01 mg/kg,AFG1為0.219～2.62 mg/kg,AFG2為0.243～1.75 mg/kg,樣品中AFB1均符合GB 2761-2017中限量要求。但1批花生醬黃曲霉毒素含量較高,AFB1為28.9 mg/kg,AFB2為1.01 mg/kg,AFG1為15.4 mg/kg,AFG2為1.69 mg/kg,且AFB1不符合GB 2761-2017中限量要求。

3 結(jié)論

本研究建立PRiME-HLB固相萃取柱直接通過的凈化方式測定復(fù)合調(diào)味料中黃曲霉毒素的方法。相較于國標(biāo)中第一、二、三法,本方法更快速、便捷、環(huán)保、準(zhǔn)確。有效地去除了樣品基質(zhì)中油脂、糖、鹽、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾,進而提高了樣品結(jié)果的準(zhǔn)確性。PRiME-HLB柱凈化過程中無需活化和平衡,上柱溶液無需稀釋,檢驗操作步驟少,檢測效率高,重復(fù)性好,更適用于大批量樣品的檢測。

本研究結(jié)果顯示,預(yù)包裝復(fù)合調(diào)味料樣品中黃曲霉毒素污染率低,餐飲店中自制樣品的黃曲霉毒素污染率高。黃曲霉毒素B族的污染率高于G族,且黃曲霉毒素B1的污染風(fēng)險最大。餐飲店中自制調(diào)味料的原料配比、制作手法各不相同,原料中可能存在同時產(chǎn)生黃曲霉毒素B族和G族的菌株,增加黃曲霉毒素的污染風(fēng)險,應(yīng)加強對餐飲店自制調(diào)味料中黃曲霉毒素的監(jiān)管力度。此外,GB 2761-2017標(biāo)準(zhǔn)中僅對AFB1的限量值進行了規(guī)定,并無對黃曲霉毒素總量的限量要求。依據(jù)“四個最嚴(yán)”的要求,為完善對復(fù)合調(diào)味料中黃曲霉毒素污染風(fēng)險的監(jiān)控,避免此類食品安全問題的發(fā)生,建議增加對堅果及籽類、調(diào)味品中黃曲霉毒素總量的限量要求。