基于響應面法優(yōu)化紫蘇醬油關鍵生產工藝

張心愿,王輝,陳向東,李沖偉*

(1.黑龍江大學 生命科學學院,哈爾濱 150080;2.黑龍江省寶泉嶺農墾寶泉醬業(yè)有限公司,黑龍江 鶴崗 154211)

醬油是我們日常生活中最常食用的傳統(tǒng)調味品之一,其在我國已有幾千年的歷史[1],“蕪荑鹽豉醯(xī)酢(cù)醬”出現(xiàn)于西漢時期史游編著的《急就篇》,是我國歷史上以大豆為原料制醬的最早記載[2]。在東漢時期,王充在《論衡》中寫到:“世諱作豆醬惡聞雷”,從側面闡明了當時人們對豆醬制作工藝已無比熟悉的事實[3]。醬油是將蛋白質原料與淀粉質原料混合,然后經過微生物的分解及催化作用,原料被水解成短肽、氨基酸、還原糖和有機酸等小分子化合物,以這些小分子化合物為基礎發(fā)生一系列復合反應,形成色、香、味、形俱全的調味液[4-6]。醬油中富含礦物質、維生素及生理活性物質,營養(yǎng)豐富,具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、促進消化、預防骨質疏松、抗腫瘤及殺菌等保健作用[7]。近年來,隨著大健康時代的到來,人們的生活水平提高,消費者對醬油品質有了更高的要求,減鹽發(fā)酵醬油、有機醬油、大蒜醬油及元素強化醬油應運而生,這些醬油得到廣大消費者的喜愛。

紫蘇因可以在食品中起到去腥、增味等效果,常被用作調味品[8]。紫蘇的藥用價值在《本草綱目》等諸多醫(yī)學論著中均有相關詳細記載[9]。紫蘇中含有的多種生物活性物質(如揮發(fā)油類、酚酸化合物、多糖類等)具有鎮(zhèn)靜、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等功效[10-15],同時具有抗抑郁、免疫調節(jié)和保肝、護肝[16-18]等重要的生理功能。

紫蘇能夠榨油[19],也可入藥,是我國最早的藥食兩用植物之一[20]。目前,科學家們對紫蘇的研究主要集中在利用價值較高的紫蘇油上,而脫脂后的紫蘇餅粕含有大量的優(yōu)質蛋白,長期以來都沒有被很好地利用[21-23]。作為一種新興的植物蛋白資源,田海娟等[24]對紫蘇粕進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)紫蘇餅粕發(fā)酵能顯著提高粗蛋白的含量,蛋白質可被有效降解,從而提高了其可消化蛋白的含量。朱艷等[25]通過建立小鼠模型探究紫蘇籽粕蛋白的免疫調節(jié)作用,研究發(fā)現(xiàn),紫蘇籽粕蛋白可遏制環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官衰退,提高固有免疫中相關免疫細胞的功能,表明紫蘇籽粕蛋白可發(fā)揮較強的免疫調節(jié)作用。Hana等[26]以紫蘇餅粕為原料,提取得到不皂化物(USM),發(fā)現(xiàn)USM可以顯著降低紫外線誘導產生的活性氧數量,緩解紫外線引起的皮膚損傷。尹賀[27]對紫蘇籽粕中含有的多糖進行研究,發(fā)現(xiàn)紫蘇粕多糖可提高小鼠免疫活性物質的表達,間接抑制腫瘤生長,具有一定的抗腫瘤功效。劉子坤[28]從紫蘇粕中提取紫蘇粕多糖,并通過對紫蘇多糖硫酸化修飾進一步驗證了紫蘇粕多糖具有較好的抗腫瘤和抗氧化作用。

由于紫蘇粕價格低廉,且含有豐富的蛋白質,可以作為一種蛋白質原料替代黃豆,不僅可以增加醬油的營養(yǎng)成分和醬油產品的功能性,而且可以提高紫蘇粕的利用效率,提高紫蘇產品的附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫蘇粕:由黑龍江大學食品科學與工程實驗室提供;黃豆、面粉、食鹽、白砂糖、小蘇打:均購自黑龍江大學中央紅超市。

試驗菌種:米曲霉As3.042(AspergillusoryzaeHuniang 3.042)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),均由黑龍江大學食品科學與工程實驗室提供。

1.2 試驗試劑

甲醛(分析純):遼寧泉瑞試劑有限公司;氫氧化鈉、硼酸、硫酸、碳酸氫鈉、鹽酸、無水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、氧化鎂(均為分析純):天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3 試驗儀器與設備

DK-420S恒溫水浴鍋、DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司;MLS-3781-PC高壓蒸汽滅菌鍋、JA5003分析天平 上海儀電科學儀器股份有限公司;PHS-3C酸度計 上海佑科儀器儀表有限公司;DF-101T集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 醬油生產工藝

黃豆經過挑揀清洗后,使用0.2%的碳酸氫鈉浸泡4 h,高溫(121 ℃)蒸煮20 min,面粉熟制75 ℃烘干20 min,黃豆與面粉的質量比為8∶2(試驗組添加紫蘇粕來代替部分黃豆),將面粉、黃豆、紫蘇粕混合均勻,加入0.3%米曲霉,置于恒溫培養(yǎng)箱中,在制曲過程中適當噴灑補加蒸餾水,保證曲料水分較恒定,有利于米曲霉的生長繁殖,培養(yǎng)溫度30 ℃,培養(yǎng)1～2 d后,曲面長出黃綠色的曲毛(長度為1～2 mm)。將成曲和一定濃度的鹽水倒入發(fā)酵瓶后放入培養(yǎng)箱中發(fā)酵,溫度為42～45 ℃,每日攪拌2次(時間間隔為12 h),發(fā)酵7 d后,將發(fā)酵溫度降到32～34 ℃,繼續(xù)發(fā)酵23 d,經過3次不同溫度淋油后進行滅菌包裝。紫蘇醬油生產工藝見圖1。

圖1 紫蘇醬油生產工藝Fig.1 Production process of perilla soy sauce

1.4.2 單因素試驗設計

采用單因素試驗方法,分別將紫蘇粕替代量(0%、10%、20%、30%、40%)、鹽水濃度(9%、10%、11%、12%、13%)及酵母添加量(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)3個因素作為變量,每個因素設置5個水平,按照生產工藝制曲及發(fā)酵,考察不同因素對紫蘇醬油樣品中氨基酸態(tài)氮含量的影響,每個水平設置3個重復,結果取數據平均值。

1.4.3 響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗的基礎上,根據Box-Behnken中心組合試驗設計,確定紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量的較優(yōu)選擇區(qū)間,設計三因素三水平響應面分析試驗,其因素與水平見表1。通過測定氨基酸態(tài)氮含量,得到最佳工藝配方及用量。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4.4 醬油總酸含量的測定

總酸是指食品中所有酸性成分的總量,對總酸含量進行測定,可以對比食品的風味,確定食品的穩(wěn)定性,避免腐敗等。醬油中總酸含量的測定參考GB 12456—2021中的方法[29]。

1.4.5 總氮含量的測定

食品中總氮含量的測定主要用于監(jiān)測食品安全,防止不良食品流入市場。醬油中總氮含量的測定參考GB 18186—2000中的方法[30]。

1.4.6 氨基酸態(tài)氮含量的測定

氨基酸態(tài)氮是以氨基酸形式存在的氮元素含量。醬油中的氨基酸態(tài)氮主要來源于原料的蛋白質經微生物代謝分泌產生的蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶等多酶系作用生成的各種氨基酸,是醬油產品主要的鮮味物質。醬油中氨基酸態(tài)氮含量的測定參考GB 5009.235—2016中的方法[31]。

1.4.7 固形物含量的測定

醬油中固形物含量表明醬油中糖類、有機酸和氨基酸等含量的多少,是判斷醬油質量的一項重要指標。醬油中固形物含量的測定參考GB 18186—2000中的方法[30]。

1.4.8 銨鹽含量的測定

銨鹽是醬油中存在的非營養(yǎng)成分,體內過高的銨鹽在一定條件下可對人體產生毒副作用,影響肝、腎功能,降低銨鹽含量對于提升醬油風味具有重要意義。醬油中銨鹽含量的測定參考GB 5009.234—2016中的方法[32]。

1.4.9 感官評價

感官評價采用暗碼品評方式進行,對10名品評人員的評分進行匯總,計算同一樣品的平均得分,以分值的高低來評價醬油的質量。按色澤、香氣、滋味和體態(tài)分別占不同分值權重對所有樣品進行評分。醬油評分項目權重分配及感官評分標準見表2。

表2 醬油評分項目權重分配及感官評分標準表Table 2 Weight distribution of soy sauce scoring items and sensory scoring standards

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 紫蘇粕替代量的確定

不同紫蘇粕替代量對醬油中氨基酸態(tài)氮的影響見圖2。

圖2 紫蘇粕替代量對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of perilla meal replacement amount on amino acid nitrogen content

由圖2可知,隨著紫蘇粕替代量的增加,氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,紫蘇粕替代量為30%時,醬油中氨基酸態(tài)氮含量最高,達到0.701 g/100 g,與對照組相比,提高了11.5%。適量加入紫蘇粕可以提高醬油中氨基酸態(tài)氮含量,但過量加入紫蘇粕,醬油中氨基酸態(tài)氮含量降低,因此,最佳紫蘇粕替代量為30%。

2.1.2 鹽水濃度的確定

不同鹽水濃度對醬油中氨基酸態(tài)氮的影響見圖3。

圖3 鹽水濃度對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of brine concentration on amino acid nitrogen content

由圖3可知,鹽水濃度為11%時,醬油中氨基酸態(tài)氮含量最大,達到0.667 g/100 g,鹽水濃度大于11%時,醬油中氨基酸態(tài)氮含量開始降低,因此,最佳鹽水濃度為11%。

2.1.3 酵母添加量的確定

不同酵母添加量對醬油中氨基酸態(tài)氮的影響見圖4。

圖4 酵母添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of yeast addition amount on amino acid nitrogen content

由圖4可知,酵母添加量為0.5%時,醬油中氨基酸態(tài)氮含量達到最大,為0.673 g/100 g,酵母添加量大于0.5%時,醬油中氨基酸態(tài)氮含量開始降低,因此,最佳酵母添加量為0.5%。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果

響應面試驗是根據Box-Behnken原理進行設計,以紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量3個因素為自變量,以醬油中的氨基酸態(tài)氮含量為響應值,試驗設計方案與結果見表3。

表3 響應面優(yōu)化工藝試驗設計方案及結果 Table 3 Design scheme and results of response surface optimization process test

使用Design Expert 8.0.6軟件,通過其中Box-Behnken Design模型處理表3中數據,二次響應面回歸擬合得到醬油中氨基酸態(tài)氮含量(Y)對紫蘇粕替代量(A)、鹽水濃度(B)和酵母添加量(C)因素之間的回歸方程:Y=-8.341 40+0.016 948A+1.512 22B+1.254 71C-0.258AB+0.002 405AC+0.084 275BC-0.000 244A2-0.069 338B2-2.131 55C2。

通過Design Expert 8.0.6軟件得到表4和圖5。

表4 響應面試驗回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model of response surface test

圖5 功率變換的Box-Cox圖(a)、氨基酸態(tài)氮的實際值與預測值(b)、氨基酸態(tài)氮的有效參數順序(c)Fig.5 Box-Cox diagram of power conversion (a),actual and predicted values of amino acid nitrogen (b),effective parameter order of amino acid nitrogen (c)

由表4可知,模型極顯著(P<0.000 1),說明醬油中氨基酸態(tài)氮含量與紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量的關系顯著;失擬項的P值為0.391 9>0.05,不顯著,說明構建的回歸模型成功,不失擬;離散系數為1.43%,說明試驗的精確度高且可靠性強;紫蘇醬油釀造工藝相關系數R2=0.981 7,說明該模型試驗誤差小,調整系數RAdj2=0.958 1,說明該模型能夠解釋95.81%響應值的變化;信噪比=17.501>4,說明該模型適用于紫蘇醬油釀造工藝試驗的預測。

結果表明,響應面分析法能很好地描述試驗數據。根據表4和圖5中c,比較F值,FA=3.90,FB=42.04,FC=14.03,說明各因素對醬油品質的影響程度存在差異,按照影響程度大小排序為鹽水濃度(B)>酵母添加量(C)>紫蘇粕替代量(A)。根據顯著性結果可知,回歸方程一次項B、C和二次項A2、B2、C2對結果的影響極顯著(P<0.01),其他因素對結果的影響均不顯著。

2.2.2 響應面各因素間的交互作用

通過Design Expert 8.0.6軟件,根據試驗數據,作出響應面分析圖,從而分析紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量的交互作用對氨基酸態(tài)氮含量的影響。

由圖6可知,當酵母添加量一定時,隨著鹽水濃度的增加,氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降,且曲面陡峭,鹽水濃度對氨基酸態(tài)氮含量的影響較大;等高線呈橢圓形,表明紫蘇粕替代量和鹽水濃度之間的交互作用極顯著。

圖6 紫蘇粕替代量與鹽水濃度的交互作用對氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface diagram and contour line of the effect of interaction of replacement amount of perilla meal and brine concentration on amino acid nitrogen content

由圖7可知,當鹽水濃度一定時,隨著酵母添加量和紫蘇粕替代量的增加,氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降,曲面相對平緩,等高線比較接近于圓形,說明紫蘇粕替代量和酵母添加量之間的交互作用不顯著。

由圖8可知,當紫蘇粕替代量一定時,隨著酵母添加量和鹽水濃度的增加,氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降,曲面較陡峭,等高線比較接近于橢圓,說明鹽水濃度和酵母添加量之間的交互作用顯著。

圖8 鹽水濃度與酵母添加量的交互作用對氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface diagram and contour line of the effect of interaction of brine concentration and yeast addition amount on amino acid nitrogen content

2.3 紫蘇醬油理化指標

測定了試驗組紫蘇醬油和對照組大豆醬油的總酸、總氮、氨基酸態(tài)氮、可溶性固形物和銨鹽含量,結果見表5,醬油感官評定得分表見表6。

表6 醬油感官評定得分表Table 6 Sensory evaluation scores of soy sauce

由表5和表6可知,試驗組總分高于對照組,色澤更深,香氣與滋味更好,體態(tài)略差。紫蘇醬油的色澤與香氣均可達到一級醬油的標準,滋味達到二級醬油的標準,體態(tài)澄清,感官評定特性整體上已達到二級醬油的標準。

將4個因素的評分分別進行百分制化,作出感官評價雷達圖,見圖9。

圖9 醬油感官評價雷達圖Fig.9 Radar chart of soy sauce sensory evaluation

3 結論

通過單因素試驗確定了紫蘇醬油的最優(yōu)工藝區(qū)間, 應用響應面法進一步優(yōu)化,得到最優(yōu)生產工藝條件:紫蘇粕替代量31%、鹽水濃度11%和酵母添加量0.5%。在該條件下,紫蘇醬油的總氮含量為1.42 g/dL,氨基酸態(tài)氮含量為0.708 g/100 g,達到國家一級醬油的標準;可溶性固形物含量為16.20 g/dL,銨鹽含量為0.327 g/dL,總酸含量為1.875 g/100 g,均達到了國家二級醬油的標準。

紫蘇醬油相較于普通黃豆醬油,其色澤更深,香氣與滋味更好,體態(tài)良好,綜合評價比普通黃豆醬油好,感官特性整體上達到二級醬油的標準。從營養(yǎng)與風味方面綜合評價,其品質介于一級與二級醬油之間,與普通黃豆醬油相比,紫蘇醬油品質更好,證明以紫蘇替代部分黃豆制作醬油是可行的。